医学检验-粪便标本处理-博泰典藏网
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医学检验-粪便标本处理
导读：粪便标本，粪便标本中常见的病原菌:，霍乱弧菌培养:取疑似患者粪便接种于碱性蛋白胨水中,进行增菌,同时划线接种于碱性琼，副溶血弧菌培养:取粪便接种于副溶血弧菌增菌液中,6-8小时后接种于TCBS和SS，（2）提高阳性检出率必须注意：标本要采集新鲜的、陈旧标本大大影响阳性检出率，当留取标本时,为防止穿刺液凝固,可在无菌容器内预先加入灭菌肝素,再注入各种穿刺液，(1)涂片检查:标本如为浆液,可经30粪便标本 粪便标本中常见的病原菌: 革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌
厌氧链球菌种
结核分枝杆菌
产气荚膜杆菌
艰辨梭菌 白色念珠菌
伤寒及其他沙门氏菌 志贺菌属 致病大肠埃希氏菌 弧菌属菌种 气单胞菌种 邻单胞菌 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌 沙门-志贺氏菌:接种HE及麦康凯平板,35℃、18～24小时后检查平板,有疑似菌落,接种双糖,细菌分纯后用细菌鉴定仪上板鉴定后与沙门、志贺氏菌因子血清凝集,以确诊.
霍乱弧菌培养:取疑似患者粪便接种于碱性蛋白胨水中,进行增菌,同时划线接种于碱性琼脂平板/双洗平板血琼脂平板,孵育.增菌培养孵育6小时后,取菌膜移种于上述平板,进行分离培养,并同时做涂片,行革兰染色和悬滴标本,检查形态和活动力.各种分离平板在孵育18-24小时。观察菌落,挑取可疑菌落,先与生理盐水混匀,观察有无自凝现象.再用O1群霍乱多价血清作玻片凝集试验. 如发现霍乱病人,立即向当地防疫部门提供及时准确的信息.
致病大肠埃希氏菌培养:引起腹泻的大肠杆菌有四种--ETEC、EPEC、EIEC、EHEC.取液体状、脓血或糊状粪便或肛拭子划线接种于麦康凯或伊红美兰及血琼脂平板上,35℃孵育18-24小时,挑选乳糖发酵菌落5个,移种于KIA和MIU孵育过夜,并同时进行细菌分纯，用细菌鉴定仪上板鉴定并进行血清学分型.
副溶血弧菌培养:取粪便接种于副溶血弧菌增菌液中,6-8小时后接种于TCBS和SS琼脂平板上,35℃孵育18-24小时后,观察菌落,挑取TCBS上绿色微隆、浑浊、湿润菌落,SS上挑取无色透明、不易挑起菌落进行分纯后用细菌鉴定仪上板鉴定.
真菌培养:真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后,常见于白色念珠菌、球拟酵母菌.将标本接种于含氯霉素的沙保氏琼脂及血琼脂平板,置25-30℃孵育24-48小时,根据菌落形态及涂片革兰氏染色所见结果,决定鉴定方法.
菌群失调及菌交替症:根据临床提示粪便培养需选用数种培养基,包括强选择性和弱选择性肠道培养基、需氧及厌氧血琼脂平板、沙保氏琼脂等,按各类细菌分别进行培养鉴定,并观察其数量变化. 3、操作流程(沙门-志贺氏菌属检查)
粪便或肛拭子
HE及麦康凯琼脂分离培养
血平板分离纯培养
血清学鉴定
4、报告方式:
以分离目的菌种的结果而决定,如:目前常规以SS/HE和中国蓝或伊红美兰分离粪便中的致病菌,阳性者应报告“沙门菌或志贺氏菌”,阴性应报告“未检出沙门菌属或志贺菌属”.其他培养结果报告方式与上述原则基本相同. 5、注意事项 （1）人类肠道中的细菌种类繁多，数量亦多，在健康人肠道内经常寄居的大量的细菌，一旦肠道发生病理改变时，就可能侵入病变部位而引起疾病。 （2）提高阳性检出率必须注意：标本要采集新鲜的、陈旧标本大大影响阳性检出率。 （3）痢疾患者要采集大量脓血部位进行培养。 (4)切勿粪尿混合否则也会影响阳性检测率。 穿刺液培养常见的病原菌 革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌 A群链球菌 肺炎链球菌 草绿色链球菌 肠球菌 厌氧链球菌 结核分枝杆菌 产气荚膜芽胞杆菌 放线菌 念珠菌
淋病奈瑟氏菌
流感嗜血杆菌 大肠埃希氏菌 产气肠杆菌 伤寒及其他沙门氏菌 肺炎克雷伯氏菌 产碱杆菌 铜绿假单胞菌 不动杆菌 梭杆菌 拟杆菌
当留取标本时,为防止穿刺液凝固,可在无菌容器内预先加入灭菌肝素,再注入各种穿刺液.
(1) 涂片检查:标本如为浆液,可经3000r/min离心,取沉淀涂片.如为脓液,可直接涂片,涂片固定后,做革兰氏染色和抗酸染色.
(2) 除常规一般培养外，应根据临床提示的要求增加真菌和结核培养,穿刺液含细胞数量较少,必须做增菌培养.如标本外观非脓样,可加大接种量.平板经35℃24-48小时孵育后,如有细菌生长,按常规鉴定,无菌生长的平板还应继续孵育至48小时.方可报告阴性. 浆膜腔积液采集 穿刺液（胸水、腹水、关节液、鞘膜液）
涂片革兰氏染色
血平板、麦康凯
巧克力平板
35度18-24h，5%-10%CO2
初步报告结果
挑取可疑菌落分离培养
菌种鉴定,药敏试验
报告结果 4、报告方式: 穿刺液中检出细菌均应报告鉴定结果及药敏试验. 5. 注意事项 （1） 穿刺液盛于含有抗凝剂的试管或小瓶中，充分混合后，立即送检或置4度冰箱保存。 （2） 应根据临床要求选择相应的培养基。 （1）对疑有淋病性关节炎患者之关节液，采集应即刻送检或床边培养为佳。 脑脊液标本 正常人体脑脊液是无菌的。当人体患有脑脊髓膜炎症时，在脑脊髓液中可以出现病原菌。常见的病原菌有细菌、真菌和结核菌等，引起脑脊髓膜炎的微生物主要有： 革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌
脑膜炎奈色氏菌 Ｂ群链球菌
卡他布兰汉菌 Ａ群链球菌
流感嗜血杆菌 肺炎链球菌
肠杆菌科菌种 消化链球菌
脑膜败血性黄杆菌 炭疽芽胞杆菌
假单胞菌 结核分枝杆菌
无色杆菌 产单核细胞李斯特菌
拟杆菌 新型隐球菌、白色念珠菌
腰穿法收取脑脊液3～5ml，盛于无菌试管，应立即送检，否则影响检出率，同时注意保温，不可置冰箱保存，会使病原菌死亡，尤其是脑膜炎奈色氏菌、肺炎链球菌及流感嗜血杆菌。
实验室接到标本须立即做直接涂片镜检和培养。
(1) 肉眼观察和涂片检查
首先观察脑脊液的外观，除结核性脑膜炎外，其他细菌引起的化脓性脑膜炎多呈明显混浊，经抗生素治疗后，亦可不混浊或轻度混浊。
革兰氏染色：混浊或脓性脑脊液可直接涂片，染色镜检。无色透明的脑脊液，应以3000r/min离心，10-15min，取沉淀物涂片，行革兰氏染色，镜检。根据染色反应及细菌形态特征，常可初步提示感染细菌的种类。
结核分枝杆菌涂片检查：脑脊液以4000r/min离心30min，取沉淀物作小而集中的涂片；亦可将脑脊液在室温下静置数小时或18-24h，待形成纤维网后，取此脑脊液倾于新的无划痕的洁净载玻片上，多余的液体任其溢出载玻片，使纤维网自然展开，干燥、固定后用萋纳氏染色。
新型隐球菌涂片检查：脑脊液的离心沉淀物行墨汁负染色，可在黑色背景中，见到菌体周围有透明的荚膜，似一晕轮，有时可见到出芽的酵母菌。新型隐球菌，特别是荚膜窄者易与白细胞相混淆，可用0.1%甲苯胺兰染色法加以区别。新型隐球菌的菌体呈红色园球状，荚膜不着色，白细胞染成深蓝色。
A． 一般培养应抽2―3ml放如血培养瓶中（同血培养）。主要用于脑膜炎奈色氏菌、链球菌、葡萄球菌、大肠埃希氏菌、产气杆菌、流感嗜血杆菌等细菌的分离。
对有的未直接打入血培养瓶的标本，用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血琼脂平板及巧克力琼脂平板上，置35℃CO2环境中培养18-24h，检视有无细菌生长。根据菌落特点及染色后镜检的特征，初步判定细菌的种类，并进一步分离纯培养后配制菌悬液上板条并做细菌鉴定及血清学检查，并作出报告。
血平板和巧克力平板是分离用的最基本培养基。巧克力平板需放入CO2环境中，有利于检出脑膜炎奈色氏菌、肺炎链球菌及嗜血杆菌等。
结核分枝杆菌培养：取离心后的沉淀物，接种罗－琴氏培养基，斜置于35℃温箱，孵育7天后，直立，继续孵育生长至八周，无菌落生长，发阴性报告；有菌落生长，鉴定后发报告。
真菌培养：取经离心后的沉淀物，接种于科玛嘉显色平板上，放在35℃孵箱中孵育，一般2-3天即可出现菌落。极少数真菌需培养2-3周，才能出现菌落，甚至培养阴性。根据菌落形态、涂片所见和细菌鉴定结果等进行鉴定。 3．操作流程：
混浊液可直接检验清亮液应离心取沉淀
涂片、革兰氏染色、镜检
必要时作抗酸染色或墨汁染色法
血琼脂平板
巧克力平板
35℃18-24h
CO2环境下35℃18-24h
细菌鉴定/药敏试验
血清学鉴定
发出报告 4、 报告结果：
无论是涂片还是培养，一旦检测到阳性应立即通知临床医师。培养并经鉴定的结果报告“×××菌”，同时报告药敏试验结果。 5、 注意事项 （1） 由于脑脊液奈瑟氏菌离体后容易自溶，流感嗜血杆菌等也易死亡，故不论是做涂片镜检，还是进行培养检查必须立即送检。 （2） 标本若混浊，最好进行床边培养。 （3） 做好治疗前采集标本。 （4） 要切实防止皮肤表皮葡萄球菌和其它细菌的污染、。 尿液标本 1、标本的采集
① 中段尿：女性采样前应先用肥皂水或0.1％高锰酸钾溶液冲洗外阴部及尿道口；男性须翻转包皮冲洗，用0.1％新洁尔灭消毒尿道口．灭菌纱布擦干后收集标本。
② 导尿管导尿采样可减少污染。对留置导尿者，可用碘酒消毒尿道口处的导尿管壁，用空针细针头斜穿管壁抽吸尿液。或消毒后解开接口，弃去导尿管前段尿被、留无污染的膀胱内尿液数毫升送检。不可从集尿袋的下端管口留取标本。
③送检标本以晨起第一次尿液为佳。
④ 室温下尿标本耽搁稍久，可致尿内细菌浓度明显增加而影响病原菌与污染菌的区分。不能立即送检者，可暂存4℃冰箱。 正常人体中，膀胱中的尿液是无菌的，从膀胱穿刺取出的尿液业应是无菌的。尿液经尿道排出时，受到尿道中细菌的污染而混有细菌。取经尿道排出的中段尿，细菌数不会超过10^3CFU/ml。患有泌尿系感染时，尿中的菌数高于10^4-5CFU/ml，因而，以此界限作为诊断泌尿系感染的依据。
2、 检验步骤:
留检的标本应立即送检，否则尿中细迅速繁殖,使菌落计数不可靠而影响诊断.实验室 接到标本后，须立即进行涂片和培养。用定量接种环或定量加样器取中段尿10UL，滴注在血平板上，用接种环涂抹，待表面干燥后，35℃培养24H，计数生长的菌落数，乘以100，求出每ML的菌落数。
(1) 涂片检查:一般细菌细菌涂片:以无菌操作作吸取尿5～7ml,放入无菌试管内，经3000r/min离心30分钟后，倾去上清液,取其沉渣,制成涂片,行革兰氏染色,镜检.如发现有革兰氏阴性或阳性细菌,即可做出报告.
淋球菌涂片:尿标本如上处理后另制一 张涂片以革兰染色,镜检.如查到细菌并为革兰氏阴性双球菌,肾形,存在于细胞内或细胞外,经培养证实后方可做出报告。
念珠菌涂片:将尿液离心沉淀后,取沉淀物放于洁净玻片上,覆以盖玻片,略加压力,使成薄片,直接用高倍镜观察.如沉渣太多,可滴加10%氢氧化钠,使之溶解后再做镜检.也可制成薄片,干后经火焰固定,革兰氏染色,油镜检查.发现有卵圆形的芽生孢子和管状的假菌丝,且革兰氏染色为阳性,就可报告检出念珠菌.
结核分枝杆菌涂片:尿液经4000r/min离心30分钟,取沉淀作涂片,行萋纳氏染色及潘本 汉氏染色,如两张涂片均查见红色杆菌,可报告为“找到结核分枝杆菌”.如萋纳氏染色片上查见红色杆菌,而潘本汉氏染色未查见红色杆菌,则为耻垢分枝杆菌.也可用金胺O-罗丹明荧光染色法.
(2) 培养:临床多用中段尿做细菌培养,应做菌落计数,培养结果才有诊断意义.
培养基常用血平板,在检查淋球菌时,须使用淋球菌平板,并防入CO2环境中孵育.
许多抗生素是经肾脏代谢的,所以尿中抗生素浓度较高,细菌的细胞壁结构易受破坏,可形成L-型细菌,常规方法不能检出.对用过抗生素的患者,尿培养有条件时须接种高渗培养基,以免漏检.
3、 操作流程:
淋病奈瑟氏菌培养
血琼脂平板 麦康凯平板
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作者：马文霞
同组人：皮雄
时间：日、15日、22日
单位：兰州大学生命科学学院生态学班
摘要：这次实验进行对微生物进行简单染色、革兰氏染色以及芽孢的染色、并在显微镜使用油镜对其进行观察，目的是了解并掌握光学显微镜的用法，能利用简单染色、革兰氏染色、芽孢染色的方法对芽孢进行染色，并观察其形态结构。首先我们使用接种环和酒精灯将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、四联球菌和巨大芽孢杆菌四种微生物固定到载玻片上；然后分别使用简单染色法、革兰氏染色法、芽孢染色法对其进行染色；最后使用光学显微镜对其形态和颜色进行观察。实验结果表明枯草芽孢杆菌显紫色为革兰氏阳性菌，大肠杆菌显红色为革兰氏阴性菌。结果表明，不同微生物的细胞壁有着两种不同的结构和组成，因此，可以通过革兰氏染色对微生物进行分类和鉴别；可以利用简单染色法对细菌的形态、结构进行大致的观察；不同微生物的细胞壁有两种不同的结构和组成，可以通过革兰氏染色对细胞进行分类和鉴别。
关键词：光学显微镜，革兰氏染色，简单染色，芽孢染色，油镜，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌。
前言：普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜都是由一套透镜组成的。普通光学显微镜通常能将物体放大
倍。细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，从而能更清楚地观察到其形态和结构。常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞常带负电荷，而碱性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
微生物的细胞壁由于其肽聚糖层厚度、脂质的含量以及其结构的不同，对染料有着不同的滞留能力，分别显革兰氏阳性和革兰氏阴性，经过革兰氏染色后分别显蓝紫色和红色，本次实验即通过对大肠杆菌和枯草杆菌进行革兰氏染色，希望可以通过颜色分辨其为革兰氏阳性还是阴性，以此来增进我们对革兰氏染色的理解和掌握。
芽胞是细菌的一种抗逆性很强的休眠组织，因此芽胞的壁厚，通透性低而不容易被染色，上色后亦不易褪色，所以先使用着色能力较强的染料对细菌进行染色，脱色后再使用对比度相对较大的复染剂对细菌进行染色，之后在观察中细菌菌体和芽胞便会呈现不同的颜色。 本实验报告首先介绍了本次实验的材料和方法，然后是实验结果以及分析，最后是小结讨论。
1、 材料与方法
1、1、1菌种
枯草芽胞杆菌，大肠杆菌，四联球菌，巨大芽孢杆菌
1、1、2溶液和试剂
二甲苯，石炭酸复红染液，结晶紧，碘液，番红液。
1、1、3仪器和其他用品
酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，滤纸，滴管，接种环，载玻片夹子，无菌水等。
1、2 步骤和方法
1、2、1、显微镜的使用操作及注意事项
显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。
（一）观察前的准备
1、拿取显微镜时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。
2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。
3、调节光照
自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。
4、调节光轴中心
显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。
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3，整个过程试管口都要处在酒精灯的上方，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄，是要慢慢晾干，如果得确要加快速度，可以处于酒精灯火焰上部远处稍微烘几下、固定。2. 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于菌落上，染色1～2min ，倾去染色液，有细水从载玻片上方向下冲洗，至洗出液为无色，将载玻片上水甩净： 显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、镊子，待水滴混浊后停住，等其干燥，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脱色微生物实验中细菌在染色前需要固定的原因：一：杀死细胞. 涂片 取出载玻片、擦镜纸. 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，燃尽载玻片上的酒精和灭菌，在中间轻轻点一小滴蒸馏水，用接种环在试管的斜面培养基上，轻轻挑取少量菌体。在样品区域加滴香柏油，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接：使细菌附着于玻片上，是染料易于着色，直至流出的酒精刚好不出现蓝色，立即用水冲净酒精. 脱色 将载玻片上面的水甩净，将载玻片倾斜，不易被水冲掉。在固定时. 复染 用番红液复染约1～2min，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的. 镜检，点燃载玻片。以油代替空气作为光的传播介质，减少光线的折射或全反射，使观察到的像更加清晰，水洗，然后再吸水纸吸干 6。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结，当用乙醇处理时，由于脱水而引发网状结构的孔径变小。将聚光器升至最高位置并开足光圈。二。 三、 实验步骤 革兰氏染色： 1，水洗。 4： 在低倍镜下寻找要观察的细菌菌落（在不停地移动载玻片，若感觉到有红色阴影，立刻停止： 蒸馏水、碘液，切忌烘得玻片升温，否则有可能会破坏细菌生命形态细菌的革兰氏染色与显微观察 一、 实验原理 革兰氏染色原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 显微镜成像原理，故又常 被称为复式显微镜。显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。在载玻片与镜头之间加滴镜油主要是为了增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。 2. 溶液或试剂。 二、 实验器材 1. 菌落： 大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、 金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，将载玻片上水甩净。 5、类脂含量高，通透性降低，而且速度要快，以防污染培养基。然后在载玻片的小水滴以转圈的动作涂片. 仪器，将镜筒升高：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，然后转换到油镜、结晶紫染色液、95%酒精、番红染色液、香柏油。 3，调整倍数，若不是菌落，继续找）
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实验二 显微镜的使用及细菌的革兰氏染色
微生物学实验Lab work on Microbiology三峡大学化学与生命科学学院 微生物学教学组实验指导老师：涂璇、苏香萍、郭金玲、吕育财显微镜实验室规则及要求实验前要预习，写好预习报告。 保持室内整洁，不要随意走动。 如若发生意外，及时报告老师。 作好实验记录，写好实验报告。 对于实验材
料，写好姓名组号。 牢记无菌概念，保持清洁卫生。 上课认真听讲，课后积极讨论。 上课不许闲聊，不得随意走动。 注意实验安全，祝你实验顺利。实验二、显微镜的原理及使用、 细菌的革兰氏染色及形态观察第一部分 显微镜的原理及使用一、目的要求 学习并掌握油镜的原理和使用方法 二、实验材料 显微镜 擦镜纸 香柏油 标本物镜 ×10、40、100（油镜） 目镜 ×4、10、16 载 物 台 聚光器光源调焦旋钮 （粗调、微调）三 显微镜的基本构造1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、 照明装置(聚光 镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它使检视物放大, 造成物象. 2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载 物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部 件.它起着支持 调节 固定等作用.目镜目镜通常插在镜筒上，是位于人眼附近实现第二级放大的镜头，镜放大倍率通常为 5 ～ 20 倍。有单 目和双目两种工作方式。 目镜可分为惠更斯目镜、平场补偿目镜、平场广视 野目镜和其他特殊目镜等多种。惠更斯目镜在普通显微 镜上用的最多。平场补偿目镜一般标有“P”或&PB“，和 平场物镜相配用。物镜物镜安装在物镜转换器上，是实现第一级放大的镜 头，放大倍率通常为 5 ～ 100 倍，是显微镜的最主 要部件。显微镜的放大及分辩作用主要由它来担当。 物镜通常都标有表示物镜光学性能和使用条件的 一些数字和符号。例子：“40 / 0.65”。40表示它的放大倍数；0.65表示它的 “数值孔径”（有的写成N.A.1.65或A.0.65）；有些油镜 上标有“油（oil）”字。 “160/0.17”。160表示使用该物镜时，显微镜的机械 筒长应为160mm（所谓机械筒长是指取下物镜和目镜 以后，所剩下的镜筒长度）；0.17表示使用该物镜 时，盖玻片的厚度应为0.17mm。根据放大倍率分3类： 低倍物镜：放大倍率1X-5X， 数值孔径0.04-0.15 ； 中倍物镜：放大倍率&5x-25x， 数值孔径0.15-0.6 ； 高倍物镜：放大倍率&25x-100x， 数值孔径0.60-1.40 ；根据使用方法分2类： 浸液系物镜：物镜与标本之间加入某种液体。 根据浸液的种类，可分 为油浸系和水浸系两种。 使用油浸系物镜时，通常加入香柏油（折射率为 1.515）；使用水浸系物镜时，加入水（折射率为 1.33）。 干燥系、水浸系和浸油系物镜：各有特殊的用 法。干燥系物镜不可用油浸，油浸性 物镜不可用 水浸。聚光器聚光器在镜台下面，功能是提供亮度足够且均匀的物面 照明，包括聚光镜和可变光阑两个部件。 聚光镜的作用是将光源来的光线会聚到标本上； 可变光阑在聚光镜的下方，用来调节照明光束孔径，以 与物镜孔径角匹配。由十几块金属薄片组成，中央通光孔 为圆形，移动可变光阑的把手，可调节通光孔的大小。聚光器的主要参数是数值孔径。数值孔径是可变的， 受光阑孔的大小控制，光孔开大，数值孔径增大，反 之减小。聚光镜外壳上的是数值孔径的最大值。 除了普通的聚光镜（亮背景上的暗物点，称亮视场照 明）外，还有暗视场聚光镜（暗背景上的亮物点）、 相衬聚光镜、偏光聚光镜等多种用途的聚光镜。其它光源系统：供给照明标本用的光线。有自然光 和电光源两种。 滤光片：使用滤光片后可以有选择地滤除某些 光线。 载玻片和盖玻片 ：载玻片是用来承载样本的， 盖玻片是用来覆盖样本的。 标准盖玻片的厚度 为0.17mm；载玻片的厚度则为1.1mm。镜筒镜筒是金属制的圆筒，上端插目镜，下端连接物镜。 可分为单目、双目和三目三种。 单目镜筒有直筒和斜筒之分。双目和三目镜筒则都 是斜筒式的；为了适应不同人眼的瞳距，双目镜筒间距 通常可调，调节范围在55~75 mm之间；为了适应视力不 同的人使用，双目镜筒可伸缩调节。调节范围在500度近 视和远视之间。 三目镜筒在双目镜筒的上方又增加一个镜筒，在此 可加配摄影设备。物镜转换器物镜转换器装于镜筒下端，用来安装和转换物镜。 按安装物镜的孔数不同，可分为四孔式、五孔式、六 孔式、七孔式等几种。 对物镜转换器的精度有两点要求：同轴和齐焦。 同轴是指每个物镜被定位即调入光路后，物镜和目镜 的光轴应在一条直线上；齐焦是指用低倍物镜调焦 后，从低倍转换到高倍物镜，无须使用粗调，即可初 见物象（但允许细调），又称为&等高转换&。调焦机构粗动调焦机构简称粗调，用来快速调焦，由粗动 手轮控制。旋转手轮，可以使物、目镜与载物台快 速相对移动。 粗调有三种方式：镜筒升降式、镜臂 升降式、载物台升降式。 微动调焦机构简称微调，作精细调焦的慢动装置。 总调节距离一般为1.8~3mm，由微动手轮控制。上升 或下降2 mm的距离，需要转动十几圈。其它载物台：用于承放标本。与显微镜的光轴垂直。有 固定式和带移动器式 两种。 镜臂，呈弓形：立于镜座的上端。支撑整个光学 和机械零件。 镜座，显微镜的基座：支撑整个镜体。简易显微镜 的多呈马蹄形，电光源显微镜的镜座为多方形，其 内部装有电光源系统。即照明灯、聚光镜、反光镜 及其电路等均装在其镜座内。四、普通光学显微镜的原理普通光学显微镜属于复式显微镜，将两个凸透镜系统适当 地组合在仪器中，对标本进行放大。 显微镜的总放大倍率是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘 积。放大倍率是指直线尺寸的放大比。
显微镜的两个重要参数 有效放大倍率：显微镜放大倍率的极限。 分辨率： 能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。 当选用的物镜分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的 微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是 一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之 如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备 分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。
成像质量?Brightness ?Focus ?Resolution 分辨力 ?ContrastImage ofpollen grain with goodresolution (left) Image ofofpollengrainundergood(left) and out(left) Image ofpollen grain with good contrast (left) Image pollen grain in focus brightness of and poor resolution (right) and poor brightness(right) and poor contrast (right) focus (right)（二）油镜使用的原理油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。 使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之 间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。 这种油常选用香柏油，香柏油的折射率n＝1.52，而玻璃 的折射率n＝1.52。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入 物镜而不发生折射。 如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干 燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射 现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的 照明度就减低了 。1、 数值孔径利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值 孔径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。 所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜 口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得 的乘积，可用下列公式表示：N A = n × sinNA=数值孔径 n= 介质折射率 α―最大入射角 即镜口角α2数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依 据；λ 分辨率= 2 n sinθn香柏油 NA max = 1.4θ减小工作距离 提高物镜性能λ紫外光，电子波2、D:是指显微镜能辨别物体两点间最小距离。 D =λ2NA可见光的波长为0.4-0.7微米，平均波长为0.55微米。若用 数值孔径为0.65的物镜，则D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。 这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于 0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜， 则D=0.22微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。 由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。 根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率； （3）加大镜口角来提高分辨力。3、放大率：显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造 象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率 就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因 此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1） 和目镜放大率（V2）的乘积， 即：V=V1×V2四、操作步骤1、取镜 2、调节光源 3、低倍镜观察 4、高倍镜观察 5、油镜观察： 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到 被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一 般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物 镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物 镜受损。使用油镜按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm， 并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜 筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本 接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈 （带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线 充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上 升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。 如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察， 重复上述操作。注意事项使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线。 油镜使用完毕，移开物镜镜头，取下标本片。先用擦镜纸 擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头 上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用 手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜 的金属部件。 将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜 套，然后放回镜箱中。五、实验报告1、结果 分别绘出你在油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌、大肠杆菌的形态，同时标明物镜的放大倍数和总放大率。2、思考题：（1） 用油镜便于观察细菌的依据是什么？ （2）使用油镜应特别注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加 滴什么油？起什么作用？ （3）当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要 求？应如何调节？ （4）影响显微镜分辨率的因素有哪些？第二部分 细菌的革兰氏染色 及形态观察 一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备 2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点 3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：为什么要对细菌染色？ 细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜 下不易识别，必须对它们进行染色，使经染 色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能 更清楚地观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸 性染料和中性染料三大类。微生物染色的染料通常是盐，分酸性染料和碱 性染料两类。 常用碱性染料：美蓝、结晶紫、碱性复红、番 红、孔雀绿； 常用酸性染料：伊红、酸性复红、刚果红。三、实验器材 1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌 (Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面 28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜 面菌种； 2、仪器 显微镜； 3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水 纸，染色缸等。 4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘 液，95%乙醇，0.5%番红染色液；四、实验步骤细菌的简单染色步骤：涂 片干 燥固定染 色镜 检干 燥水 洗操作步骤： 1、涂片：加一小滴蒸馏水于载玻片中央，挑取少量细菌培 养物混合于水中。玻片要洁净无油，水和菌体适量，涂抹要 均匀，不宜过厚。 2、室温自然干燥。 3、加热固定：涂面向上，通过火焰2~3次。温度不宜过高， 以玻片背面不烫手为宜。 4、染色。滴加染液于涂片上，以刚好覆盖涂片薄膜为宜。 不同染液时间不同。如碱性美蓝约1~2min，石炭酸复红和 结晶紫1min。 5、水洗。倒去染液，用自来水冲洗，至流下的水无色。不 要直接冲洗涂面，水流不宜过急。 6、干燥。自然干燥或电吹风吹干或吸水纸吸干。 7、镜检。涂片需完全干燥后才能使用油镜。细菌的革兰氏染色步骤：涂 片 干 燥 固 定 结晶紫 染 色乙醇脱色水 洗碘液媒染水 洗水 洗番红复染水 洗干 燥 镜 检
实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开 2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察，涂片 厚度适当 3、固定温度适当 4、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，脱色程度适 当 5、染色过程中勿使染色液干涸五、实验报告1.画出你所观察到的形态并标出革兰氏染色结果。 2.思考题：（1）涂片后为什么要进行固定？固定时应注意什么？ （2）革兰氏染色步骤是什么？其中关键步骤是什么？ （3）为什么必须用培养24h的菌体进行革兰氏染色？结 束请注意实验台面清洁！ 请值日生留下来打扫卫生！结 束请注意实验台面清洁！ 请值日生留下来打扫卫生！}