关注今日：13 | 主题：286272
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【求救】关于测序！！！有人测过1000多bp的片断么？
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这个帖子发布于12年零363天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的实验是检验基因突变的，先做PCR，然后再把PCR产物拿去测序来检测突变。但是我得目的片断有1300多bp。本来拿到生工去测序的，但是他们说每个反应只能测500bp，我的需要三个反应才能测通，而且因为我得片段比较大，最好是能克隆了再去测序，否则直接测引物下游的片断容易丢失，那样就测得不准了，因为本来就是检测突变的。我现在很苦恼，如果直接去测序，可能测得不准。但是如果先克隆一下又很贵，克隆一个需要300RMB，再加上测序费用210RMB，那样一个样本做下来得500多RMB,而且我的样本也不只一个。这个序到底该不该测呢？
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丁香园荣誉版主
多合成几条引物，可将目的片断1300 bp分2-3次扩增。
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如果不克隆测通是最好的，北京三博远志公司可以一个反应测800bp,所以你的1300bp两个反应就可以测出来，正向和反向同时测，然后在用软件拼接起来。两个反应才160元。如果测不通的话再考虑克隆。花钱不会很多，关键是很费时间。
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谢非常感谢两位战友！我的参考文献上在测序的时候又设计了一对测序引物，我需要向他们提供么？
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生工是毛细管电泳测序，而且是单泳道，所以一个反应作500bp算比较不错的结果。如果用跑板胶得测序仪过夜8小时，会出很好的结果（做法应该和上面差不多）。上海晶泰也可以做。我个人认为，如果不是大规模的测序不必要用毛细管，比如li-cor得测序仪就不错，成本也不高。
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关于丁香园关注今日：18 | 主题：313765
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【求助】测序结果前1000bp和后2800bp和目的片段吻合但中间多了1000多bp,这是什么原因
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这个帖子发布于8年零31天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
求助各位大侠，我的测序结果前1000bp和后2800bp和目的片段吻合但中间多了1000多bp,这是什么原因呢，谢谢！我的目的片是3800bp即前1000bp加上后2800bp刚好正确，但中间多了1000多。
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freecell 编辑于
You should tell people what the 3.8 kb DNA is originated, from cDNA or from genomic DNA.
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谢谢mpark，是cDNA，大概过程是这样的从别的老师那边拿到带有目的片段的质粒，通过PCR扩增目的片段，将PCR产物加A尾，连接到T载体上面，通过酶切鉴定大概为4000bp左右的质粒拿去测序。结果就出现了多了一千多bp了。
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When you have 2.8 kb PCR products, you need to do gel purification before A/T cloning. 2.8 kb fragment should be separated from those around 4 kb PCR products on the gel.
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楼上的如果真心回答别人问题，就说的详细一点啊，弄两个单词放上面就解决人家问题了？
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谢谢你们，我打算把中间的片段切了，
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拿PCR产物直接测
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