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目的基因导入受体细胞
第五章 目的基因导入受体细胞5.1 受体细胞? 受体细胞(receptor cell)?又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的 细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究 价值的细胞。?作为基因工程
的宿主细胞必须具备以下特性：① ② ③ ④ ⑤ ⑥⑦⑧ ⑨便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长； 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染； 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基 因的高效分泌表达。 在遗传密码的应用上无明显偏倚性； 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达； 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。?基因工程中常用的受体细胞类型： ? 原核生物细胞 ? 真核生物细胞?真菌细胞?植物细胞?动物细胞原核生物细胞?优点：1. 大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。 2. 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源 DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 3. 原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 4. 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基 因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。?缺点：1.2.3.原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统， 即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空 间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多 真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化 或磷酸化等修饰作用。 原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物 不稳定。? 至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。一、大肠杆菌受体细胞? 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因 工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系 统。 ? 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 ? 缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导 致人体热原反应。二、枯草杆菌受体细胞? ??枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 1. 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表 达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表 达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下， 真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有 天然的构象和生物活性。 2. 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的 基因工程菌。 3. 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 4. 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、 分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、 乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。三、蓝细菌（蓝藻）? 蓝藻――又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无 细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典 型的原核生物。 ? 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优 点，具体表现在：?基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检 测。 ?细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 ?营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和 适宜的温度就能满足生长需要。 ?多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 ?蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品， 在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒 蓝藻，就可达到锦上添花的效果。真核生物细胞一、真菌受体细胞?真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的 加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动 植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。? 酵母菌细胞 ? 是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。 ? 优点： 1. 酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控 机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。 2. 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 3. 不含有特异性病毒，不产生毒素。 4. 培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。 5. 能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取 和加工。二、植物受体细胞?优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个 获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的 植株或品系。 ?缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁， 不利于摄取重组DNA分子。 ?现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、 马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。三、动物受体细胞：?优点：1.2.3. 4.能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好 的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。 易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工， 成本低。??缺点：组织培养技术要求高，难度较大。目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、 猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或 动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵 巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优 点。?5.2重组DNA分子转入原核生物细胞? 5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌?转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过 程称之为转化。?转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。目录? 细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中 通过遗传交换将之组合到自身的基因组中， 从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。?以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可 能机制包括如下基本步骤：? ①细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞时．受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白，又 称为感受因子，能诱导使细菌胞壁部分溶解，局部 暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等，此时 细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因 子以实现转化。? ②转化因子的吸收。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构持异性结 合，然后激活邻近的核酸酶，将双链DNA分子 中的一条链逐步降解，同时将另一条链逐步 转移到受体菌内。? ③整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合 物前体，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核 酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。? ④单链DNA转化因子的整合。整合复合物前体中的 单链DNA片段可以通过同源重组，Z换受体细胞染 色体DNA的同源区域．形成异源杂合双链DNA结构。? ⑤转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染 色体发生分离，形成一个新的转化子。? 大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。 在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是 根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子，而非 来自供体菌的游离DNA片段(转化因子)。 ? 因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化 的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感 受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法 之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。（1） Ca2+诱导的大肠杆菌转化法? Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因： ①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时 Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内 膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感 受态。 ②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟 基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。 当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构 发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供 了进入细胞的通道。
? 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质 粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可 以满足质粒的常规克隆的需要。? Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA 的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖 醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细 胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大 小质粒分子均可进行有效的转化。 ? 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常 很少采用。?DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制? 一般认为只有双链闭环或开环的质粒DNA分子才能转化，而线形DNA分子不能获得转化子。因此，环 状DNA分子中混杂线形DNA分子，会影响环状DNA分 子的转化效率。 ? 也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNA， 但却以单链DNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转 化过程相似。?转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化 子的出现，因此须设以下几种对照处理：DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感 受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。 ② 感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液 代替0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。 ③ 感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入 0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。①（2）电穿孔转化法? 基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electro poration)．形成可逆的 瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 ? 电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外 源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每 ugDNA可以得到109－1010转化子。 ? 研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致 50％~70％细菌死亡时，转化水平达到最高。? 用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多．当细菌生长到对数中期后予以冷却、 离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液 的离子强度，并用10％甘油重悬细胞，使其细胞浓 度为3×l010个／m1。分装，在干冰上速冻后Z于－ 70℃贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化， 有效期达6个月以上。 ? 电穿孔转化须在低温下(0－4℃)进行，转化效率要 比在室温下操作提高约100倍。（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌? 简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些难 以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。 ? 非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所 须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞 间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶 合性的接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒 通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的 非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。? 接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难 以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是 在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒 的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接接进 行接合转化．而只能通过其迁移作用来完成。? 首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体 细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重 组质粒导入受体细胞。 ? 整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即 待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供 体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称 为三亲本杂交接合转化法。
（4）转化率的计算及其影响因素? 转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：? 一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示； ? 二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表 示。? 用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。? 以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须通过菌液OD值测定或细菌 计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌 总数。然后计算转化子与受体菌的比率。影响转化率的因素①②③分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量 较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于30kb的重 组质粒则很难进行转化。 组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和 性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体， 而处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构成线性 结构的质粒载体有更高的转化率。经体外酶切、酶连操作 后的载体DNA或重组DNA分子由于空间构象难以恢复，转化 率一般要比具有超螺旋结构的质粒低两个数量级。 重组DNA分子的浓度和纯度。在10ng／100u1以下的DNA浓 度范围内，转化效率与DNA分子数成正比关系。? 同一重组质粒DNA分子转化不同的受体菌细胞，转化率不同――受体细胞的选择对于重组DNA分子的转化 也是极为重要。 ? 前述三种转化方法中，最佳转化率以电穿孔法最高 （108~1010）；Ca2+诱导转化法居中（107~108）；而 三亲本杂交转移法最低（104~105），但它适于前两 种方法难以转化的受体菌。? 在转化操作方而，受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。 ? 如Ca2+诱导大肠杆菌转化法，菌龄、Cacl2处理时间、 感受态细胞的保存期以及热激时间均是重要的影响 因素。 ? 电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理 后的转化率，要比不经此预处理的转化率高10~100 倍。5.2.2重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌? 将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程，称为转染。 ? 将重组λ噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常 规方法是转导操作。 ? 转导(transduction)是指通过λ噬菌体(病毒)颗粒 感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细 胞内的过程。? 具有感染能力的λ噬菌体颗粒除含有λ噬菌体DNA分子外，还包括外被蛋白。 ? 以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组A噬 菌体DNA分子进行体外包装 。 ? 体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体 细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组 λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的 λ噬 菌体颗粒的技术。? 基本原理，根据λ噬菌体DNA体内包装的途径，分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋 白的λ噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包 装λ噬菌体DNA，但将它们分别感染大肠杆菌，从中 提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白)和缺失E蛋白的 包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。λ噬菌体DNA体外包装的主要过程? ①制备包装物。 ? 首先，须培养两种溶原菌 ? 第二，诱导溶菌生长 ? 第三，收集和贮存包装物。 ? ②体外包装。 ? 制备λ噬菌体DNA混合液。 ? 第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出 包装物可立即用于包装。 ? 第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率2－5倍， 加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应的 进行。 ? 去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入SM溶液和 氯仿，混匀后离心去除碎屑。上清液中含活的噬菌体颗 粒。? 经过体外包装的噬菌体颗粒可以感染适当的受体菌细胞，并将重组λ噬菌体DNA分子高效导入细胞中。 ? 在良好的体外包装反应条件下，每μg野生型的λ 噬菌体DNA可形成108～109的pfu。对于重组的λ噬 菌体DNA，包装后的成斑率要比野生型的有所下降， 但仍可达到106～107pfu，完全可以满足构建真核基 因组基因文库的要求。5.2.3受体细胞的选择? 野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致 病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠 杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞 的突变菌株。通常应从以下几个方面加以考虑：①限制与修饰系统? 这是导致外源重组DNA转化或转导效率低下的主要原因之一。 ? 应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞， 以提高外源DNA分子的转化或转导效率。 ? 进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不 能修饰，也不能限制外源DNA分子，更便于重组DNA 分子的多种基因操作。②重组系统? 进入野生型细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生的体内同源重组反应由rec基因家族的编码 产物所控制。RecA蛋白能促进DNA分子之间的同源 联会和DNA单链交换，recA基因的突变使大肠杆菌 细胞内的遗传重组频率降低至10-6。 ? recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组 的发生频率。 ? 因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传 表型，基因型为recA-、recB-或recC-等，有些大肠 杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。③易于转化或转导? 可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其 转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态 细胞的菌株作为受体菌细胞．④有明显的选择性差异? 遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传 性状。 ? 如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有AMP 抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生 素敏感。当重组DNA分子转入受体细胞后，载体上 的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此 可以区分转化子与非转化子。 ? 如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的 遗传特征．可以直接筛选到外源基因表达的转化细 胞。⑤感染寄生缺陷型? 从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性。5.2.4重组DNA分子转入真核细胞? 5.2.4.1重组DNA分子导入植物细胞?（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 ? 农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感 染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无 侵染能力。 ? 具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其 Ti质粒上的T-DNA的转移至细胞内部。根据这一性质， 将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介 导进入植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或 表达。? 用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体。选择适宜的外植体是成功进行遗传转化的首要条件，而外 植体的选择主要是依据受体细胞的转化能力来决定的。 ? 目前作为基因转化的外植体材料非常广泛，涉及到植 物的各个组织、器官和部位。?选择合适的转化外植体①优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。 ②要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的幼 期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期。 ③转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。 ④应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞 所在的部位及其数量。切割外植体时应尽可能地 暴露分生组织细胞，增加农杆茵与分生组织的接 种面积。?农杆菌接种操作? 外植体的农杆菌接种就是把农杆菌接种到外植体的损伤切面。通常采用较低的菌液OD值和较短的浸泡 时间来进行外植体的接种。 ? 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不 定芽固体分化培养基上，随着外植体的细胞分裂和 生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长， 故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养。 ? 由于农杆菌的附着侵染、T-DNA的转移及整合都是 在共培养时期内完成，因此共培养技术条件的掌握 是整个转化的关键环节。其中共培养时间对转化率 有着很大影响，? 与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常共生有大量农杆菌，对外植体的正常生长会产生不 利影响，必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的 生长。 ? 脱菌培养是指把共培养后的外植体转移到含有抗生 素的培养基上继续培养生长的过程。目前使用最多 的是头孢霉素。 ? 最后，还须将外植体转移至筛选培养基上继续培养， 筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。? 针对不同的外植体以及不同的转化目的而建立多种转化方法，主要包括叶盘转化法、植 株接种共转化法、植物愈伤组织共培养转化 法、植物悬浮细胞共培养转化法和原生质体 共培养转化法等。? ②整体植株接种转化法：人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤 表面，或用针头把农杆菌注射到植株体内、 使农杆菌按照天然的感染过程在植株体内进 行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因 植株。? ③原生质体共培养转化法即取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚再生出新细胞壁的原生质体 作短暂的共培养，促使农杆菌与植物细胞之 间发生遗传物质的转化。用此方法已成功地 实现了植物细胞的体外转化。 ? ④悬浮细胞共培养转化法。此方法类似于原 生质体共培养转化法，主要差别是首先建立 悬浮细胞系。(2)DNA的直接转移? DNA的直接转移是指利用植物细胞的生物学特件、通过物理化学的方法将外源基因转入受 体植物细胞的技术。 ? 为克服农杆菌介导法的宿主局限性，巳发展 了电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击 法)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体 介导法，多聚物介导法、花粉管通导法等DNA 直接转移技术。①多聚物介导法? 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是常用的协助基因转移的多聚物，尤以PEG应用最广。 这些多聚物和二价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)与 DNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过 原生质体的内否噬作用而被吸收进入细胞内。? 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等都是细胞融合剂。它们可以使细胞膜之间或使DNA与膜 形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。还可以引 起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有 利于细胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体。 ? 本法中线性DNA比环形DNA有更高的转化效率，而单 链DNA又比双链DNA更为有效。这与质粒DNA分子对 大肠杆菌细胞的转化完全相反。②电穿孔转化法? 细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细 胞致命的伤害，当移去外加电压后，被击穿的膜孔 可被修复。③激光微束穿孔转化法? 此方法是利用直径很小，能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在萦光显微镜下找出合适的细胞，然后 用激光光源替代萦光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成 膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。 ? 这种利用激光微束照射受体细胞实现外源DNA直接导入、整 合和表达的技术称之为激光微束穿孔转化法。 ? 激光微束穿孔转化法的优点：操作简便快捷；基因转移效率 高；无宿主限制，可适用于各种动植物细胞、组织、器官的 转化操作，并且由于激光微束直径小于细胞器，可对线粒体 和叶绿体等细胞器进行基因操作。 ? 但该法需要昂贵的仪器设备；技术条件要求高；稳定性和安 全性等都不如电穿孔法和基因枪法。④显微注射法? 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 ? 这一技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的 固定。由于动物细胞具有独特的贴壁生长待性，因 此不存在固定细胞的问题，这为动物细胞的显微注 射创造了十分有利条件，也是动物细胞能广泛使用 该技术的原因之一。 ? 但是，对植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技 术，然后才能进行定位显微注射操作。⑤超声波介导转化法? 利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性地击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进 入细胞。 ? 利用超声波处理可以避免脉冲高电压对细胞 的损伤作用，有利于原生质体存话，是一种 有潜力的转化途径。⑥基因枪法? 又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞内的现象，将包裹 在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分 子随之带入细胞进行表达的基因转化方法。⑦脂质体介导法? 脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质 体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬 过程，把外源DNA转运到细胞内。 ? 优点是包在脂质体内的DNA可免受细胞DNA酶 降解。⑧花粉管通道法? 将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化 还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎 细胞。 ? 这一方法技术简单，一般易于掌握，且能避 免体细胞变异等问题，故有一定的应用前景。5.2.4.2 重组DNA分子导入哺乳动物细胞①病毒颗粒转导法? 病毒种类多样及病毒DNA或RNA构建的载体性质的各异，所以转导的过程各不相同，主要有三种类型：? 一，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这 样以后不需要再包装成病毒颗粒。 ? 二，带有目的基因的毒病是缺陷性的，须同另一辅助病 毒一起感染受体细胞．在受体细胞内包装成新的病毒颗 粒。 ? 三，虽然带目的基因的SV40病毒是早期转录缺陷型的， 但被感染的COS细胞系的基因组中整合有SV40早期转录区 段DNA，所以没有必要用辅助病毒作混合感染。②磷酸钙转染法? 其依据是哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 ? DNA磷酸钙共沉淀复合物中DNA的数量、共沉淀 物与细胞接触的保温时间、以及DMSO和甘油等 促进因子作用的持续时间均会影响DNA的转染 效率。③DEAE-葡聚糖转染法? 二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA， 实现短时间的有效表达。 ? 目前有关DEAE-葡聚糖的作用机制一般认为DEAE-葡 聚糖能与外源DNA形成复合物，保护DNA免受核酸酶 的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受体细胞膜， 增加其通透性，便于DNA进入。 ? 此方法简单、重复性高，并且转染效率高于磷酸钙 法。④聚阳离子-DMSO转染法? 采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力、然后再用25 ％-30％DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性， 提高对DNA的捕获量。⑤显微注射转基因技术? 应用显微注射器可以把重组DNA直接注入哺乳动物细胞。 ? 用此方法转基因的效率很高。获得稳定转化 子的数量取决于注射的DNA的性质。⑥电穿孔DNA转移技术? 原理同植物的电穿孔转移DNA法。? 在电脉冲处理之前，先用乙酰甲基秋水仙碱预处理细胞10h，可提高转化效率3-10倍。这 很可能是由于预处理导致中期停顿的细胞中， 细胞核处于无膜状态，或者核膜具有较高的 通透性所致。⑦脂质体介导法? 利用脂质体介导法将外源DNA导入哺乳动物细胞具有实用潜力。 ? 由于脂质体具有无毒、无免疫原性的特点， 不仅可用于体外受体细胞的基因转化，而且 可以在动物体内将基因转入肝细胞、血管内 皮细胞等靶细胞或靶组织、靶器官位点，实 现瞬间表达或稳定表达，成为基因治疗的一 种有效工具。5.3 重组子的筛选5.3 克隆子的筛选?概念 ? 克隆子 ? 转化子 ? 重组子?????将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持 的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫 做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体 细胞称为转化子 ），现在这两者有通用的趋向。 含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重 组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或 期望重组子 。 在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般 仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的 方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获 得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。5.3.1遗传表型直接筛选法??5.3.1.1 根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子 中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞 内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。???一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适 量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培 养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。 常用的选择标记基因主要是抗性基因以及表达产物 可以发光或使反应底物显色的基因，相应的选择条 件是可以被抗性基因产物分解的抗生素和除草剂， 可以使基因产物发光的光线，或者是可以使基因产 物显色的试剂。 选择培养基是根据宿主细胞类型配Z的培养基，对 于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养 基中加入适量的某种选择物．即为选择培养基。选 择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决 定。（1）抗药性筛选
（2）插入失活筛选法
（3）插入表达筛选法? ??利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的 表达，由此进行转化子的筛选。 有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段负调 控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记 基因才能表达。 例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因 的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其 调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表 达。当外源DNA片段插入CI基因的Hin dⅢ或Bgl Ⅰ位点上 时，CI基因失活．Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳 性重组子为Tcr表型．而质粒本身为Tcs表型，当转化细菌 涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳性重 组子的转化菌才能生长成菌落。（4）显色互补筛选法
??lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体 之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶 (Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落 成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶 基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组DNA 分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和 IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。??lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段， 含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株，可 转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫 代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落， 而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’ 区插入外源基因后，再转化lac Z’互补型菌株， 由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有 X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。 这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化 子。 此方法主要用于原核生物。α 互 补 的 检 测
?以显色剂x-gal作为选择物时，DNA对照组 不应出现任何菌落，感受态细胞对照组长 出的菌落应全是蓝色的，感受态细胞有效 性对照组长出的菌落中应有白色的，其中 一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。（5）利用报告基因筛选植物转化细胞??报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定， 常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细 胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊 用途的基因。 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下， 可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非 转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可 以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的 表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序 列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码 某些酶类或其他持殊产物的基因等。???①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。④β-葡萄糖酸酶基因（gus）???gus的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生萦光物质 4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于 筛选植物转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的 嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有 GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位 分析。⑤萤火虫萦光素酶基因（luc）??luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在Mg2+的作 用下，可以与萦光素和ATP底物发生反应，形成与 酶结合的腺苷酸萦光素酰化复合物，经过氧化脱 羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧 化萦光素，可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出 产生的萦光，是目前研究动植物转基因很好用的 一种报告基因。 Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存 在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造 成的危害，也没有内源萦光产牛的背景干扰，因 此，Luc是一种理想的报告基因。⑥抗除草剂bar基因?bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草 剂具有抗性。⑦冠瘿碱合成酶基因???主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两 类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。 冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以 催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌萦光染 料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转 植物基因细胞的筛选。 冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多， 现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动 物转基因细胞?? ? ? ? ?在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat) 基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳 动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt） -- 细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (ecogpt)等。???胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因 （dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 （hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合 成代谢。 这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失 调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才 能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞， 导入含有这些基因的外源DNA，补充原来缺失的基 因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加 核苷酸的培养基中正常生长。 根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛 选出转化子。①胸腺核苷激酶基因?胸苷激酶(TK)是核苷酸合成代谢途径中的 一种酶，能够把胸苷转换为胸苷-磷酸，保 证核苷酸的顺利合成。胸苷激酶的编码基 国(tk)，几乎在所有的真核细胞中都能有 效地表达，因此可采用这种基因作为遗传 选择记号以确定哺乳动物基因转移．相应 的受体细胞为遗传标记遗传表型的缺陷型。转基因动物细胞筛选方式：HAT选择法、共转化选择法 ? HAT选择法：由于选择培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨 基蝶呤（A）和胸苷（T），主要针对含有选择标记的目 的基因转化子的筛选。 ? 基本原理：利用培养基中的叶酸类似物氨基蝶呤(APT) 阻断细胞核苷酸的正常合成途径，启动以次黄嘌呤为底 物的补救合成途径（不受氨基蝶呤的抑制，能继续合成 出所需核苷酸）。HAT培养基中有外源的胸苷，通过胸 苷激酶的作用，tk+能以其为底物合成出TTP，则tk+细 胞可继续存活；而tk-细胞无这种合成作用，则死亡。???分离不具有这种选择记号的外源基因转化 子则采用共转化选择法。 共转化是指两种无关联的DNA混合物、能够 以磷酸钙沉淀的方式同时转化受体细胞。 共转化细胞的筛选仍可采用以HAT法进行。②二氢叶酸还原酶基因?二氢叶酸还原酶(DHFR)在真核细胞核苷酸生物合 成过程中可催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸 (THF)。dhfr突变体细胞无法合成四氢叶酸，阻断 了正常核酸代谢途径，不能在常规培养基上生长。 但如果在常规培养基中加入次黄嘌呤和胸苷，则 突变体细胞可以借助补救合成途径维持生长。?应用dhfr基因作为选择记号的一个明显的优 点是，由于基因扩增的结果，转化的细胞 能够合成大量的野生型的DHFR，检测比较 方便。③黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (XGPRT)基因??XGPRT是由大肠杆菌Ecogpt基因编码的一种核苷酸 代谢酶。哺乳动物细胞中缺少这种酶，但存在着 它的类似物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (HGPRT)。XGPRT酶能够有效地把黄嘌呤转变为黄 苷磷酸(XMP)，最终形成鸟苷-磷酸(GMP)。HGPRT 酶则只能利用次黄嘌呤-鸟嘌呤，催化次黄嘌呤转 变为次黄苷-磷酸(IMP)。 根据这些特性，Ecogpt基因可以作为哺乳动物基 因转移的一种显性选择记号。? ?可见哺乳动物的HGPRT酶无法合成GMP。 但当哺乳动物细胞获得外源的Ecogpt基因， 并能有效地表达的话，它们就能够克服霉 酚酸和甲氨蝶呤的抑制作用，利用黄嘌呤 合成GMP，使细胞能够在这种补加有黄嘌呤 和腺嘌呤的抑制培养基中存活下来。5.3.1.2?营养缺陷型检测法?根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛 选含目的基因的克隆子。如果目的基因产物能降 解某些药物使菌株呈现抗性标记，或者基因产物 与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或 颜色直接筛选含目的基因的克隆子。 例如要从某种生物的cDNA文库中钓出dhfr，则可 根据二氢叶酸还原酶能降解三甲氧苄二氨嘧啶的 性质(该化合物会抑制大肠杆菌的生长)，将cDNA 文库的一系列克隆子接种在含有适量三甲氧苄二 氨嘧啶的培养基上，能正常生长的克隆子中含有 dhfr基因。5.3.1.3 形成噬菌斑筛选法???对于λDNA载体系统而言，重组DNA分子大小必须 在野生型λDNA长度的75％-105％范围内，才可以 在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，转导 受体菌，在培养基上形成噬菌斑，未转导的受体 菌继续正常生长。 如果在重组过程中使用的是取代型λ载体，则噬 菌斑中的λ噬菌体即为重组子，因为空载的λDNA 分子不能被包装，难以进入受体细胞产生噬菌斑。 如使用插入型λ载体，由于空载的λDNA大于包装 下限，所以也能被包装成噬菌体颗粒并产生噬菌 斑，此时筛选重组子可以利用λ载体上的筛选标 记基因，如lacZ’。当外源DNA片段插入lacZ’基因 时，重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑则呈蓝 色。?通过系列筛选方法获得转化子后，为了确 定获得的转化子是真正需要的重组子，还 须进一步分析鉴定重组子基因组中的外源 DNA片段、目的基因转录的mRNA或翻译的多 肽（蛋白质、酶）。5.3.2 依赖于重组子结构特征分析 的筛选法?5.3.2.1 快速裂解菌落鉴定分子大小? 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载 体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。 ? 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，由于 重组DNA是载体DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大 于载体DNA分子，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中， 落后的带是重组DNA的带。 ? 这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法， 直观快捷，只须获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进 行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组 子的筛选。 ? 此方法只用于重组子的初步鉴定。?5.3.2.2限制性核酸内切酶酶解分析法? 通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望 重组子和非期望重组子，因为重组质粒DNA分子中，质 粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组。 ? 采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴 定重组子，且能判断外源DNA片段的插入方向及分子质 量大小等。 ? 基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速 提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶 电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。全酶解法?简单操作过程是，用一种或两种能将外源DNA片段 从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解 质粒DNA，凝胶电泳后重组质粒分子较单一载体质 粒多出一条泳带，据此将重组子和非重组子分离 开来。如果插入片段与载体质粒大小相近，则最 好用合适的酶将之线性化，通过比较大小确定其 是否为重组分子。进一步利用在外源DNA片段上具 有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切 酶酶解重组质粒分子，根据酶切图谱分析即可判 明插入片段的方向等。
部分酶解法??通过一种或数种限制性核酸内切酶对重组质粒DNA 分子进行部分酶解分析，根据部分酶解产生的限 制性片段大小，确定限制性核酸内切酶识别位点 的准确位Z及各个片段的准确排列方式，从而将 期望重组子筛选出来。 部分酶解法较全酶解法简单易行，两者通常用于 当载体和外源DNA片段连接后产生的转化菌落比任 何一组对照连接反应(如只有酶切后的载体或只有 外源DNA片段)都明显多时的重组筛选。?5.3.2.3利用PCR方法筛选确定重组子? 由于在载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧 序列多数是已知的，可以设计合成相应的PCR引 物，以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进 行PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，若出 现特异性扩增DNA带，并且其分子量同预期的一 致，则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待 的重组子。5.3.3 核酸分子杂交检测法??基本原理是：具有一定同源性的两条核酸 (DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度 等条件下，可按碱基互补配对原则高度特 异地复性形成双链。 该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交 的双方是待测的核酸序列和用于检测的已 知核酸片段(称为探针)。??基本做法是将待测核酸变性后，用一定的方法将 其固定在硝酸纤维膜(或尼龙膜)上，这个过程也 称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核 酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核 酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针 互补的特异DNA片段所在的位Z。 根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支 持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分 为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、southern 印迹杂交和Nothern印迹杂交四类。分子杂交??核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相 互配对的过程。 分子杂交：生物大分子之间通过相互作用 结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对； 蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、 蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互 作用。
5.3.3.1 Southern印迹杂交?Southern blot DNA杂交由 E.Southern于1975年提出。 DNA琼脂糖凝胶电泳 DNA或RNA探针杂交 转移到NC膜上 放射自显影显杂交带??Southern印迹杂交，有时又称为DNA印迹杂交或Southern DNA印迹杂交等。?它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝 胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤 膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA 探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片 段。??其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固 相载体上，与标记的核酸探针进行杂交， 在与探针有同源序列的固相DNA的位Z上显 示出杂交信号。通过Southern杂交可以判 断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的 片段以及该片段的长度。 该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指 纹分析和PCR产物判断等研究中。Southern杂交?纪念发明者――Edward Southern（1）提取总DNA （2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析演示硝酸纤维素滤膜? ????在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固 相支持物，但它也存在一些不足之处： 第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的， 这种结合并不十分牢固。 第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱，容易碎裂，因此操作 须小心谨慎(待别是经烘烤后)。 第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在 低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。 第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是 小于200bp的DNA片段)结合能力不强。尼龙膜? ?现在人们更倾向于使用尼龙膜。 尼龙膜结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维 素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地 结合，经烘烤或紫外线照射后，这种结合 更加牢固。同时尼龙膜韧性强，操作较方 便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂 文。但其杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜 高，这可通过增加预杂交液中的非待异性 封闭试剂用量的方法加以克服。3.3.2 Northern印迹杂交???Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后、从 电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法．又称 为Northern RNA印迹杂交等。 该法是在southern印迹杂交基础上发展起来的，主要针对 RNA分子的检测，基本步骤与southern印迹杂交相似。但 RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处理， Northern杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以 定量分析组织中某一特异mRNA的表达丰度，根据其迁移的 位Z也可判断基因分子大小。这一技术应用十分广泛，常 用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异及病理研 究。 注意：需在变性条件下电泳，防止RNA形成二级结构。?在RNA变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、 乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。
5.3.3.3?斑点印迹杂交和狭线印迹 杂交如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或 转基因个体、器官、组织提取的总DNA或 RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑 点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂 交(slot blotting)进行检测，它们是在 Southern印迹杂交的基础上发展的两种相 似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的 核酸杂交技术。?两种方法的基本原理和操作步骤相同，即 通过特殊的加样装Z将变性的DNA或RNA核 酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上， 然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸 样品中是否存在特异性DNA或RNA。两者的 区别仅在于呈现在杂交滤膜上的核酸样品 分别为圆斑状和狭线状。??斑点杂交法主要用于基因组中特定基因及 其表达情况的定性和定量研究。 与其他核酸分子杂交法相比，斑点杂交法 具有简单、快速、经济等特点，一张滤膜 上可以进行多个样品的检测，同时也适用 于粗提核酸样品的检测，但该法不能用于 鉴定所测基因的分子质量，且特异性不高， 有一定比例的假阳性。???Southern印迹杂交是先从转化子中提取总DNA，经 酶切及琼脂糖凝胶电泳分带，转移到用于杂交的 膜上，变性处理后再用DNA探针与其杂交。 斑点印迹杂交是把提取的转化子总DNA直接点样到 用于杂交的膜上，变性处理后再用DNA探针与其杂 交。 菌落（或噬菌斑）原位杂交是直接把菌落或噬菌 斑印迹转移到用于杂交的膜上，经溶菌和变性处 理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用DNA 探针与其杂交。???用Southern印迹杂交法不仅可以鉴定重组子中含 有重组DNA分子，而且还可以知道待检测的DNA分 子（DNA片段）的大小以及待检测的DNA片段在重 组DNA分子中的位Z，但是此方法操作比较麻烦。 斑点印迹杂交、菌落（或噬菌斑）原位杂交操作 比较简单，但是只能区别是否含有待检测重组DNA 分子的重组子。 菌落（或噬菌斑）原位杂交已广泛地用于从基因 组DNA文库和cDNA文库中筛选含目的基因的重组子。5.3.3.4?菌落(或噬菌斑)原位杂交?菌落(或噬菌斑)原位杂交是直接接把菌落或噬菌 斑印迹转移到硝酸纤维色滤膜上，不必进行核酸 分离纯化、限制性核酸内切酶酶解及凝胶电泳分 离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出 来并与滤膜原垃结合，再与特异性DNA或RNA探针 杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。 由于生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，是按 照其原来的位Z不变地转移到滤膜上，然后在原 位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落杂交 或噬茵斑杂交隶属原位杂交范畴。?操作步骤 1.将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸 纤维素薄膜上 2.裂解菌落或噬菌斑并使释放的DNA原位结 合于滤膜上 3.固定于滤膜上的DNA与标记探针进行杂交 4.杂交后滤膜的漂洗及放射自显影溶菌、使DNA 暴露 洗菌体碎片和 Pr 使单链DNA牢 固结合在膜上
原 位 杂 交③原位杂交 （Hybridization in situ)菌落杂交――由菌落释放DNA 进行的杂交空斑杂交――由噬菌斑释放DNA进行的杂交④斑点杂交（Dot blot) ――把DNA直接点在NC上，形成斑点的杂交⑤ Western blot 是蛋白质分析技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳转移 NC 应免疫反2、核酸杂交① 原理 利用同源DNA碱基配对的原理，检测特定的重 组体的方法② 操作程序A、菌落生长 B、转移到NC膜上 C、DNA释放和变性 （变成单链DNA）： 10％SDS 0.5M NaOH D、中和 0.5M Tris-HCl pH 8.0 E、固定 80 ℃ 120’ F、杂交（包括预杂交， 加探针DNA杂交） G、放射自显影 H、对照比较，选出重组克隆③优缺点 优点：精确，灵敏。可检出不表达的重组克隆 缺点：A、必须用放射性同位素：污染 昂贵 B、必须对目的基因顺序有所了解 噬菌斑杂交方法完全相同预菌落杂交法，但效率更高， 每次平板可容纳20，000个噬菌斑。3、生物素探针原理：利用免疫组织化学和分子杂交相结合的原理。生物 素苯环上带有一个NH基团和羟基，可以和酶、抗原、抗体结 合，也可以和dUTP上的嘧啶环C5共价连接在一起。可以用生 物素标记的单核苷酸（Biotin-dUTP)合成单链DNA，即生物素 DNA探针。 生物素化DNA＋抗生物素蛋白＋生物素化酶 DNA 酶复合体 酶分解底物显色五、阳性重组体的分析和初步鉴定1、克隆基因片段大小的分析 ①快速破碎法 ②煮沸法 直接电泳比较 ③碱裂解 2、克隆基因的酶切图谱分析 ①单酶解分析――克隆片段的存在、大小 ②双酶解分析――定向克隆用 ③多次酶解分析――切下的小片段再酶解 ④部分酶解分析――物理图谱 3、克隆基因的顺序分析 4、克隆基因的产物分析 ①分子量 ②N－末端顺序 ③Aa全顺序分析 ④生物活性 ⑤等电点5.3.3.5 核酸杂交探针?杂交探针，是指具有一定序列的核苷酸片 段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并 且通过适当标记进行检测。（1）核酸杂交探针的种类?????①同源或部分同源探针。 是指与目的基因的部分序列完全互补的核酸探针．长度约 为19-24个核苷酸。该长度足以保证同源探针能够利用杂 交方式将靶序列与其他序列区分开来。 同源探针主要用于从cDNA或基因组DNA文库中筛选含有目 的序列的克隆于以及通过southern杂交或Northern杂交等 技术来鉴定或检测特定的基因序列，进行基因定位分析等。 由于同源探针难以获得，有时可以采用部分同源探针进行 杂交分析。部分同源基因来自其他种属的同一基因或从同 一种属中克隆到的相关基因片段。 这类探针只限于靶序列已知的情况，不能用于从文库中分 离和筛选未知序列的克隆。②总cDNA探针??总cDNA探针是利用逆转录酶的作用，对生 物细胞总的或经分离的Po1y(A)mRNA进行示 踪标记制备的。 一般用于对应于高丰度的mRNA的cDNA克隆 的筛选。③特异性cDNA探针??通过差示筛选法、减法杂交法或mRNA差别 显示法等从目的细胞中筛选获得某些特异 性的cDNA片段。将这些cDNA片段进行示踪 标记后即可作为探针使用。 一般用于筛选cDNA文库中那些对应于低丰 度的mRNA的目的克隆。④人工合成的寡核苷酸探针?寡核苷酸探针的核苷酸序列是根据目的蛋白的一 小段已知氨基酸序列推导合成出来的，长度一般 为10-30bp，甚至可达50bp。由于遗传密码子的简 并性，已知的氨基酸序列往往对应于多种不同的 核苷酸序列，要精确推测其真正的目的序列极为 困难。一般应选用简并度低的密码子以缩小可能 的核苷酸范围，也可以采用中性核苷酸，如次黄 嘌呤等代替简并度高的密码子以增加杂交体的稳 定性，但通常使用一组寡核苷酸的混合物作为探 针，用于基因组DNA文库或cDNA文库的筛选。（2）探针标记物? ?? ? ? ? ?理想的探针标记物应满足的条件： 1)标记物不会影响探针的主要理化性质，如杂交特 异性、杂交稳定性及酶反应待征等； 2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好； 3)操作简便、省时．经济实用： 4)化学稳定性高、易于长期保存； 5)安全、无环境污染。 常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放 射性两大类。①放射性标记物?? ???放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的 产物，常见的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其 中以32P、3H、35S最为常用。 32P标记的核苷酸具由高放射性，放射自显影检测灵敏度高， 但其分辨力低，半衰期短(14.3d)，探针不能长期保存。 与32P标记物相比，35S的放射性较弱，检测灵敏度低，但其分 辨力高，放射自显影的本底低，适于细胞原位杂交等。半衰 期较长(87.1d)，辐射危害较小，使用较为方便安全。 3H主要用于制备高分辨力的原位杂交探针，因其释放的放射 能很低，放射自显影的本底也不高．但却需较长的曝光时间。 半衰期长(12.35a)，标记探针可较长时间保存。 标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器 等射线探测仪来完成。②非放射性标记物??非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨 力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放 射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异 性较差。 目前已广泛应用的非放射性标记物有生物素(biotin) 标记的核苷酸、地高辛(digoxigenin)标记的核苷酸 和萦光素(fluorescein)标记的核苷酸等。此外，乙 酰基氨基芴(AAF)或乙酰基氨基碘芴(AAIF）、汞离 子、金颗粒、银颗粒及磺基等标记的核苷酸也能作 为标记物使用。生物素(biotin)????生物素是一种水溶性维生素．又称为维生素H、辅酶R（羧 基转化酶的辅酶）。其分子中的戊酸羟基经化学修饰活化 后可携带多种活性基团、能与核苷酸或核酸等多种物质发 生偶联，从而使这些物质作上生物素标记。 最为常用的生物素标记物：生物素与dUTP分子中嘧啶碱基 的第5位的碳原子通过一个碳链连接臂共价结合，形成 bjotin-11-dUTP及biotin-l6-dUTP。 如果生物素偶联上某种光敏的芳香基团，即可成为光敏生 物素，也较为常用。生物素标记的探针可通过生物素-抗 生物素蛋白的亲和系统检出，也可以通过生物素-抗生物 素抗体的免疫系统检出。 抗生物素蛋白(avidin)，又称亲合素、卵白素等，是一种 从卵清中提取的碱性的四聚体糖蛋白，与生物素分子有极 高的亲和力，具有专一、迅速及稳定的特点。可与酶、萦 光素、胶体金等检测标记物结合，利用这些检测标记物即 可确定生物素标记探针或与把DNA形成的杂交复合体的位 Z信息等。
C链连接臂biotin与RNA上U的C5相连地高辛(DIG)??地高辛(DIG)是一种类固醇类的半抗原，又称为 异羟基洋地黄毒苷配基，自然界中仅在毛地黄植 物中发现，其他生物体中不含有抗地高辛的抗体， 避免了采用其他半抗原作标记可能带来的背景问 题。 该配基通过一个由11个碳原子组成的连接臂与尿 嘧啶核苷酸嘧啶环上的第5个碳原子相连，形成地 高辛标记的尿嘧啶核苷酸。地高辛与抗地高辛抗 体能发生免疫结合，利用抗地高辛抗体上带有的 酶标记就可进行探针的检测。萦光素??萦光素是一类能在激发光作用下发射出萦 光的物质，包括异硫氰酸萦光素、羟基香 豆素、罗达明等。 萦光素与核苷酸结合后即可作为探针标记 物，主要用于原位杂交检测。萦光素标记 探针可通过萦光显微镜观察检出，或通过 免疫组织化学法来检测。（3）探针标记方法???探针的标记有体内标记及体外标记两种方 法。 体内标记法是以标记化合物作为代谢底物， 通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核 酸分子标记，例如在培养基中加入3H-胸苷， 就可以标记到生长在该培养基中的活细胞 DNA分子上。 体内标记法受多种因素的限制，且标记活 性不高，一般很少使用。体外标记?????包括化学法和酶法两种。 化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种 基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标记物连接到探 针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制 备非放射性标记物的探针。 常用的化学标记法有光敏标记法、化学衍生结合标记法和 交叉相连法等。 酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促 聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸 探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部 分非放射性标记探针。 常用的酶法有DNA缺口平移标记法、DNA随机引物标记法、 DNA末端标记法及PCR标记法等。①切口平移标记法 (nick thanslation labeling)DNA聚合酶Ⅰ该法标记模板链②随机引物标记法 (random primed DNA labeling)核随 苷机 酸引 片物 段是 的含 混有 合各 物种 。可 能 排 列 的 寡Klenow片段催化该法标记模板互补链? ?随机引物：46 使用随机引物标记的探针一般长400-600个 核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。 与切口平移法不同的是，该方法标记的是 模板互补链，而非模板本身。③末端标记法 (DNA terminal labeling)? ???该法标记的是线性DNA或RNA的5’端或3’端，属非 均一性标记。 1)3’凸出末端的加尾标记法：末端脱氧核苷酸转 移酶将带有标记的dGTP或dCTP加到DNA3’-OH端 2)双链DNA3’隐蔽末端的填充标记：（若反应体系 存在全部与模板序列互补的dNTP）以凸出序列为 模板，Klenow酶或T4DNA连接酶催化补平3’末端 （若一种dNTP带标记则成为探针）。 3)5’末端标记：T4多聚核苷酸激酶将ATP的标记的 γ-磷酸基团转移到游离的5’-OH上。? ? ?④PCR标记法(PCR labeling)：标记的一种dNTP ⑤光敏标记法 ⑥化学衍生结合标记法：生物素和地高辛等非放射性标记物可以与事先经过化学修饰得到的核酸衍生物 更加牢固地结合，进行非放射性探针的制备。常用的 化学修饰反应包括磺化、转氨、溴化等反应类型。?⑦交叉相连标记法：利用一些高分子化合物，如 细胞色素c、组蛋白H1及大肠杆菌单链结合蛋白质 等能与核酸结合的特性，制备相应的探针。⑤光敏标记法： 用于生物素和地高辛等非放射性标记物的探 针的制备。生物素标记探针（光敏基团）将光敏生物素与待标记的核酸混合，在一定条件下强光照射约 15min使光敏生物素与核酸间形成牢固的共价结合，从而得到 生物素标记的核酸探针。⑥化学衍生结合标记法（双功能胺） 活性氨基胞嘧啶（氨基特异性试剂） 生物素酯生物素化的胞嘧啶（生物素标记的核酸探针）5.3.4 免疫化学检测法????基本过程与菌落分子杂交法相似，但该法使用抗 体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。 免疫学检测法具有专一性强、灵敏度高的特点， 只要有一个拷贝的目的基因在克隆子细胞内表达 合成蛋白质，就可以检测出来。 前提条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且 有目的蛋白的抗体。 根据实验手段的不同，免疫学检测法可以分为抗 体测定法和免疫沉淀测定法等类型。5.3.4.1 抗体测定法?? ???（1）放射性抗体测定法 基本依据 ①一种免疫血清中含有多种类型的免疫球蛋 白IgG分子，这些IgG分子分别与同一抗原分子上 不同的抗原决定簇特异性结合。 ②抗体分子或其某部分可牢固地吸附在固体 支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不 会被洗脱掉。 ＠通过体外碘化作用，IgG抗体会迅速地被放 射性125I标记上。放射性抗体测定法的操作过程?首先将转化的菌体涂布在琼脂平板培养基上，长出菌落后， 再影印到另一块琼脂平板上培养。待影印琼脂平板上的菌 落长好后，用氯仿饱和气体裂解菌落，使阳性菌落产生的 抗原释放出来。将吸附了未经标记的IgG抗体的聚乙烯薄 膜覆盖在琼脂平板表面，如释放抗原和抗体具有对应关系 则在薄膜上形成抗原-抗体复合物。小心取下薄膜，再用 125I标记的IgG处理，125I-IgG便会与结合在聚乙烯薄膜上 的抗原决定基结合。漂洗聚乙烯薄膜，去除过剩的125IIgG，然后于空气中干燥薄膜，经放射性自显影后，即可 从母板上就获得所需的重组克隆。 这种方法十分灵敏，抗原含量低至5pg仍然可被检测出来。?
?此方法中，首先吸附到固体支持物上的是 抗体，相应的抗原与之反应后在固体支持 物表面形成抗原-抗体复合物，再用同位素 标记的抗体检测该复合物，并通过放射自 显影鉴定重组克隆子。????目前所采用的免疫学检测方法中，更多的是先将待检测的 菌落或噬菌斑按原位印迹到硝酸纤维素膜等固相支持物上， 然后裂解细胞，使目的蛋白抗原结合到硝酸纤维素膜上， 进一步与相应的抗体（即第一抗体）反应，形成抗原-抗 体复合物。 对抗原-抗体复合物的检测，既可采用125I标记的第二抗体 直接检测，也可采用125I标记的A蛋白进行间接分析。 直接检测法中，针对不同的第一抗体，应分别标记相应的 第二抗体进行检测； 间接分析法中，只须标记一种A蛋白分子便可检测多种不 同的第一抗体（A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种组 分，它可以牢固地结合到IgG分子的Fc段，形成多分子复 合物）因此用一种碘化标记试剂可以检测筛选产生不同抗 原的重组克隆子，而不必每次标记不同的第二抗体。
（2）非放射性抗体测定法??非放射性抗体分析技术的发展得益于非放射性标 记物的广泛成功的应用。 可以采用直接与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷 酸酶（AP）偶合的第二抗体，检测目的蛋白抗原抗体复合物。也可采用与HRP偶联的抗生物素蛋白 来检测与生物素偶联的第二抗体等。这些方法也 称为酶联免疫检测分析法（ELISA），具有较高的 灵敏度和特异性，也没有使用放射性核素标记物 带来的半衰期短和安全防护等问题。
5.3.4.2 免疫沉淀测定法?在生长有转化子菌落的培养基中，加入与 目的基因产物相对应的标记抗体。如果菌 落会产生与抗体相对应的抗原蛋白（目的 基因产物），则其周围就会出现一种叫沉 淀素的抗体-抗原沉淀物形成的白色圆圈。 该方法操作简便，但灵敏度不高，实用性 较差。
5．3．5 转译筛选法??转译筛选法，分为杂交选择转译（hybrid selected translation）和杂交抑制转译 （hybrid arrested translation）。 其突出优点在于将克隆的DNA同所编码的蛋 白质产物之间的关系对应起来。5.3.5.1 杂交抑制转译检测法?原理是，在体外无细胞的转译体系中，目的基因的转录产 物mRNA一旦同DNA分子杂交之后，就不再能够指导蛋白质 多肽的合成。从转化子菌落或噬菌体群体中制备质粒DNA， 变性后选择有利于形成DNA-RNA杂种分子，但不利于形成 DNA-DNA杂种分子，同时又能阻止线性质粒DNA再环化的反 应条件，与原菌落或噬菌体群体的总mRNA进行杂交。从杂 交混合物中回收核酸，进行体外转译。由于体系中加有 32S标记的甲硫氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。把其结 果同未经杂交处理的mRNA的转译产物作比较，若杂交组缺 少某种蛋白质（被杂交抑制了的mRNA的产物），表明供杂 交用的那部分克隆子群体中含有目的基因。然后，将这个 群体分成若干较小的群体，并重复上述实验程序，直至最 后鉴定出含目的基因的单一克隆子。??如果被研究的目的基因能编码丰富的mRNA， 采用杂交抑制转译检测法筛选阳性克隆子尤 为适合。 常用的无细胞转译体系包括麦胚提取物和网 织红细胞提取物等，系统中包含了基因表达 所需要的所有因子，如RNA聚合酶、核糖体、 tRNA、核苷酸、氨基酸以及合适的缓冲液组 成成分。5.3.5.2 杂交选择转译检测法??杂交选择转译法，有时也称杂交释放转译 法（hybrid released translation），比 杂交抑制转译法灵敏度更高的阳性重组子 筛选法，适用于低丰度mRNA产物的cDNA重 组分子的检测。 与杂交抑制转译法不同，杂交选择转译法 是通过杂交手段选择目的mRNA进行体外转 译，而非抑制目的mRNA的体外转译。?基本做法是从克隆文库中挑取转化菌落或噬菌体群体，分 离制备其质粒DNA分子，经适当处理后牢固结合在硝化纤 维素滤膜上。然后用同一菌落或噬菌体群体的mRNA（甚至 是总的细胞RNA）进行杂交。通过洗脱作用，分离出能与 结合的DNA分子杂交的mRNA。回收杂交的mRNA，加到无细 胞体系中进行体外转译，通过凝胶电泳分析或根据生物活 性鉴定转译合成的带放射性标记的多肽产物。一旦获得某 种呈阳性反应的克隆群体，可将它分成许多小库，直到用 划线培养法获得一个或数个呈阳性反应的单菌落重组子为 止。5.3.6 亚克隆法??亚克隆或次级克隆（subcloning）是将克 隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。 一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内 切酶切割后，将所得各片段分别重组到载 体上，再转化宿主细胞，通过对转化细胞 的表型鉴定或其他方法来确定基因所在的 位Z。5.3.7 插入失活法?? ? ?基本原理是将特定的DNA随机插入到重组 DNA分子中，获得一系列插入重组子，根据 其突变的类型鉴定失活的基因，进一步利 用此插入DNA作为标记物，对失活基因进行 定位。 插入失活法主要有两种形式： ①接头插入突变 ②转座子诱变①接头插入突变 通过在重组DNA分子中随机引入序列已知的合成接头， 使目的基因失活从而确定克隆基因的位Z。?一般的方法是，在合适的条件下用DNase随机切割 重组DNA分子，然后，用EcoRI甲基化酶处理线性 DNA分子，纯化分子内部原有的EcoRI识别和切割 位点。再用DNA聚合酶Ⅰ将线性DNA分子的两端补 平，在连接酶的作用下在此平末端接上EcoRI接头， 进一步用EcoRI酶消化，经T4DNA连接酶作用使DNA 分子重新环化，转化受体细胞后进行再次筛选鉴 定。由于EcoRI接头的插入可能导致克隆化目的基 因的失活。因此一旦发现目的基因失活后，便可 通过接头插入位点，将克隆化目的基因位Z确定 下来。②转座子诱变? ?采用转座子（transposon）随机插入、失活目的基因的方 法也能进行目的基因的定位研究。 细菌中也有特定的转座子，且一般存在于某些质粒或噬菌 体的基因组中，它们自身不能自主复制，但往往含有抗生 素抗性基因，因此，将含有转座子的质粒或噬菌体引入克 隆细胞，经过一段时间培养后，质粒或噬菌体DNA上的转 座子有可能转移到待测重组DNA分子上，并且这种转座子 的插入是随机发生的。从这些细胞所形成的菌落中分别制 备重组质粒，然后转化合适的受体细胞，通过对重组质粒 上原有表型特征和转座子抗生素抗性标记的选择，鉴定出 含转座子诱变质粒的转化子。再次分离重组质粒，根据转 座子和重组质粒的限制性核酸内切酶酶切图谱，确定转座 子插入的位点，然后根据每个选择转化子的目的基因遗传 表型表达与否，进一步定位目的基因。5.3.8 电子显微镜作图检测法? ? ?5.3.8.1变性作图 一般用于DNA分子中AT丰富区段的鉴定。 将DNA分子暴露在变性条件下，AT丰富区端 因融解温度较低最先发生变性解链，形成部 分变性的DNA分子，在高浓度的甲酰胺溶液 的稳定作用下，利用电镜可以观察到这些变 性区段形成的特殊“泡”状精细结构，以此 作为标记位点，可用于克隆基因的定位。5.3.8.2 异源双链定位法?如果两条单链DNA分子间有一定的同源序列，在复性条件 下，两条单链DNA分子在同源序列处可因碱基配对而结合， 形成部分双链结构。 据此，将经碱变性处理的二种DNA分子混合，溶液调至中 性后加入甲酰胺，使DNA分子复性。当同源序列有50％复 性杂交后，将混合溶液稀释，在电子显微镜下观察并作图， 可以获得异源双链间同源序列及非同源区序列的有关信息。 如果使用探针和待测DNA分子进行上述操作，很显然，可 以在待测DNA分子上定位与探针序列有同源性的区段。?5.3.8.3 R环检测法??原理：在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70％） 的甲酰胺溶液中，双链的DNA-RNA杂交分子要比双 链的DNA-DNA分子更加稳定。因此，将RNA及变性 的DNA的混合物Z于这种退火条件下，RNA便会同 它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的 DNA-RNA杂交分子，而使被取代的另一链处于单链 状态。 由双链DNA-RNA分子与单链DNA分支共同形成的 “泡状”结构，叫做R环结构。
5.3.9 转录产物作图?如果克隆DNA片段中的目的基因能够转录生 成mRNA产物，通过对mRNA的分析，也可以 间接鉴定重组DNA分子，并对目的基因进行 定位研究。5.3.9.1 S1酶作图法?S1酶作图法主要依据与R环检测法相同，即在高浓度的甲酸胺 溶液中，DNA-RNA双链分子比DNA-DNA双链稳定。 基本做法是，经热变性处理的DNA分子在高浓度的甲酰胺溶液 中与同一材料的mRNA复性杂交，由于mRNA是由克隆DNA片段中 目的基因的外显子区域转录生成的，两者能形成上述R环结构。 用单链特异的S1核酸酶消化R环结构中处于单链状态的DNA分子， 保留了杂合的双链分子。然后分别在自然条件和变性条件下进 行琼脂糖或聚丙烯酸胺凝胶电泳，其中，在自然条件下进行的 凝胶电泳中，杂合双链区形成一条带，由此可确定不被降解的 DNA片段的大小。而在变性条件（碱性条件）下进行凝胶电泳 时，由于mRNA分子被水解，每个DNA分子都有其特定条带。用 目的基因上不同区段的DNA进行杂交，即可确定mRNA的末端及 位于该基因内部的内含子的位Z。?
S1内切核酸酶和S1图谱? ?S1酶切割单链DNA或双链DNA的单链区。 S1图谱：S1酶切割单链DNA特异性强，突变 型和野生型DNA分子杂交后经S1酶处理， DNA分子被准确地在突变位点切断，可以用 来确定基因突变位Z；即S1酶作用后电镜 或凝胶电泳分析产生的DNA片段的长度来定 出突变的位Z。DNA的物理图谱?DNA分子的限制性内切酶酶解片段的排列顺 序。5.3.9.2 引物延伸作图法? ?可用于RNA 5’端的定位和定量。 利用5’端标记的单链DNA引物（合成的寡核 苷酸或限制性核酸内切酶酶切片段）与 mRNA杂交，在DNA聚合酶1的作用下合成与 mRNA互补的cDNA，再通过变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳测定cDNA的长度，即可反映出引 物末端标记核苷酸与RNA5’端的距离，而 cDNA的量与mRNA样品中靶序列的浓度大约 成正比。5.3.10 基因表达产物分析法??如果重组质粒的目的基因能顺利表达，那 么只要能检测到该目的基因的蛋白质产物， 就能说明该重组质粒含有目的基因，即基 因表达产物分析法。 转译筛选法和免疫学检测法等也可以归属 于本类方法，这里主要介绍大肠杆菌小细 胞系统和大细胞系统两种分析法以及DNA蛋 白质筛选法。①大肠杆菌小细胞系统? ?野生型大肠杆菌在突变条件下会以极低的频率及出芽方式产 生一种微小细胞结构，这类小细胞结构通常不含有染色体 DNA，无生存能力。 但如果从含有重组质粒的大肠杆菌克隆株制备小细胞，就有 可能将重组质粒分子分配到新形成的小细胞中，得到仅含重 组质粒的小细胞结构。小细胞与正常细胞相比在大小和密度 上存在着一定差异，可以利用密度梯度离心法等从正常细胞 中分离出小细胞。含有重组质粒的小细胞在纯化后不久便具 有合成RNA和蛋白质的功能。尽管表达量非常低，但当在含 有放射性前体（如32S-甲硫氨酸）的条件下培养小细胞时， 因为没有其他内源基因表达蛋白的干扰，由质粒DNA编码合 成的新蛋白质仍能标记上放射性核素，进而可以通过SDS-聚 丙烯酸胺凝胶电泳和放射性自显影技术加以分析。
②大肠杆菌大细胞系统???大细胞是由对紫外线敏感的大肠杆菌突变株细胞制备而来 的，这种菌株受到紫外光照射后，其基因组编码的蛋白质 合成终止，并最终导致细胞停止分裂，处于这种状态的细 胞体积通常大于正常细胞，因此称为大细胞。如果能控制 好紫外光照射剂量，则以上述大肠杆菌突变菌株作为受体 细胞的重组克隆菌中就会选择性地产生仅能合成重组质粒 DNA编码蛋白的大细胞。 与小细胞系统相似，大细胞的这种选择性基因表达量也很 低，因此同样需要对新合成的重组质粒编码蛋白进行放射 性核素标记，以证实重组子中外源基因表达产物的存在。 无论是小细胞体系还是大细胞体系，其操作均很繁琐，一 般只在无其他适合的筛选鉴定方法的前提下才加以应用。③DNA-蛋白质筛选法??是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋 白质因子的一种方法，现已成功地用于筛 选并分离表达融合蛋白质的克隆。 操作流程与免疫筛选法较为相似，但所使 用的标记检测物是DNA探针，而非标记抗体。 检测对象是编码能与DNA特异性结合的蛋白 质的外源目的基因，即：待检测的外源目 的基因编码的蛋白质是一种DNA结合蛋白质。??基本操作步骤：用硝酸纤维素滤膜进行“噬菌斑 转移”，使外源目的基因的表达蛋白质吸附在滤 膜上；再将此滤膜与放射性标记的含有DNA结合蛋 白质编码序列的双链DNA寡核苷酸探针杂交；最后 根据放射自显影的结果筛选出阳性克隆子。 由于本方法是利用一种放射性标记的DNA探针，检 测转移到硝酸纤维素滤膜上的特异性蛋白质多肽 分子，因此叫蛋白质筛选法。5.3.11?DNA序列测定法?DNA序列测定，即核酸一级结构的测定，简 称DNA测序。 对克隆DNA片段进行序列测定及分析，不仅 可以直观地鉴定出重组DNA分子中是否含有 目的基因，也可以获得目的基因的编码序 列和基因调控序列，这对目的基因的表达 及其功能研究具有重要意义。DNA序列分析???目前用于测序的技术主要有Sanger等（1975） 发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert （1977）发明的化学降解法。 这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核 苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定 的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度 的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上 电泳进行检测，从而获得DNA序列。 目前Sanger测序法得到了广泛的应用。5.3.11.1 DNA的化学降解测序法?原理：利用某些化学试剂能专一地修饰 碱基，使相应的糖苷键变得不稳定，这 样可以得到特定碱基结尾的四组片段。硫酸二甲酯（DMS）： G； pH2甲酸哌啶： G+A;肼（NH2NH2）：肼（NH2NH2）+高盐：C+T;C5.3.11.1 DNA的化学降解测序法? ?DNA的化学降解测序法也叫Maxam-Gilbert测序法， 基本原理是，将待测DNA分子进行末端放射性标记， 然后Z于4组独立的化学反应体系中分别进行部分 降解，其中每一组反应特异性地针对某一碱基或 某一类碱基。通过化学降解一段时间后，在每一 组反应体系中，生成各种不同长度的、一端为放 射性标记固定的寡聚核苷酸分子，经聚丙烯酰胺 凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测DNA分 子的碱基序列。（2）碱基切割反应体系? ?进行碱基特异性化学切割反应的试剂是硫酸二甲 酯、肼（联氨）以及哌啶（六氢吡啶）。 硫酸二甲酯、肼（联氨）主要对碱基进行化学修 饰，哌啶则可以从修饰碱基处断裂核苷酸链。在 不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试 剂按不同的组合能特异地切割核苷酸序列中的特 定碱基，降解待测模板DNA分子。?????常见的特异反应： ①G反应，硫酸二甲酯能使模板DNA分子中G上的N7甲基化。 甲基化的G与脱氧核糖之间的糖苷键在中性环境和高温条 件下发生断裂，鸟嘌呤碱基脱落，导致多核酸骨架在G处 发生断裂。 ②G＋A反应，在酸性条件下，如用甲酸处理，可使A和G 嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键稳定性下降， 利用哌啶使嘌呤碱基脱落，从A和G嘌呤处断裂核苷酸链。 ③T＋C反应，肼能使模板DNA分子中T和C的嘧啶环断裂， 环境中的哌啶能进一步脱离T和C碱基，从T和C嘧啶处断裂 核苷酸链。 ④C反应，在高盐条件下，肼只能断裂C嘧啶环，而不会 与T发生反应。利用哌啶除去C碱基，从C碱基处断裂核苷 酸链。1、待测模板的制备2、化学降解待测 模板DNA分子3、待测模板DNA 分子的序列分析一 、 化 学 裂 解 法? ??DNA序列的读取是逆电泳方向进行的。 化学降解测序法不仅适于单链DNA，也适于双链DNA 的测序，主要用于研究DNA的一级和二级结构、DNA 甲基化位点测定和DNA-蛋白质相互作用等方面，结 果准确可靠，是DNA测序的基本方法之一。 它的缺点是一轮反应所能测定模板DNA长度只有 250bp左右，若测定大片段DNA分子时，操作较为繁 琐费时。另外，化学降解测序法不能在载体上直接 进行，标记后的模板DNA分子难以纯化。5.3.11.2 DNA的双脱氧链终止测序法? ?（1）基本原理 双脱氧链终止测序法是由Sanger等在 加减法的基础上建立的一种简单快速的DNA 序列分析法，故也称为Sanger测序法。有 时又称为引物合成法，或酶促引物合成法， 因为该法是以待测DNA分子为模板，在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下，利用适当的DNA合成引 物进行DNA互补链的合成来完成测序工作的。???基本原理是，DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成出 对应的DNA互补链，但在反应过程中，如果2’，3’-双脱氧 核糖核苷三磷酸底物掺入到寡核苷酸链的3’端，DNA链的 延伸反应即被终止。 在4个特定反应体系中分别加入一种ddNTP反应底物 （ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）以及DNA模板、合成引 物、DNA聚合酶I、一定浓度的dNTP（dCTP、dATP、dGTP、 dTTP，其中有一种是带32P放射性标记的），DNA链的合成 随机终止于某一特定ddNTPs。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳和放射自显影技术读出待测DNA模板的碱基序列。 双脱氧链终止测序法的精确度较高，绝大多数以单纯测定 DNA序列为目的的实验室均采用此法。此法读取的碱基序 列是待测DNA模板的互补链，而非模板链本身。?Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸 结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止 核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应 构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使 延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终 止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和 ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百 至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点， 但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝 胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶 片放射自显影或非同位素标记进行检测。
（2）双脱氧核糖核苷三磷酸的作用机 制?2’，3’-双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）的分子 结构式与2’-脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）极为相 似，惟一的区别是，ddNTP在脱氧核糖的3’位Z上 缺少一个羟基，这是由于dNTP进一步脱氧所致。 在DNA链的合成过程中，ddNTP可以利用其5’-磷酸 基团与DNA链上的游离羟基基团形成磷酸二酯键而 使链得以延伸，但是由于ddNTP缺少3’-0H基团， 不能与下一个底物分子的5’-磷酸基团进行反应， 因此新生的寡核酸链一旦加入ddNTP，DNA链的合 成就会终止。
（3）待测模板DNA分子的制备?采用DNA分子克隆的方法制备模板DNA，即将限制性核酸内 切酶消化切割的DNA小片段，随机地克隆到一种合适的载 体分子上，经转化筛选后就可得到含有同一来源DNA片段 的重组子克隆后代，以此大量制备重组DNA分子，可直接 用于DNA测序需要，因为新生DNA链的合成反应是从引物3’ 端定向进行的，无须将待测DNA片段从载体上切下。事实 上，载体的存在不但不会影响测序的结果，反而有利于测 序的进行，因为在实际操作中，引物往往不是与待测DNA 的3’端互补，而是与载体克隆位点的两侧序列互补，这样 可以测定完整的DNA序列。??M13载体能克隆单链DNA分子，制备的产物可直接 用作引物合成反应中的单链模板，同时，由于待 测DNA片段均被克隆在M13载体的同一个特定区段 内，所有的待测DNA片段，都可以使用同一种引物， 即M13载体克隆位点两侧的通用引物（universal primer）进行DNA链的合成延伸，避免了因合成和 分离各种不同引物而导致的许多麻烦。 因此，M13载体双脱氧链终止法目前已经成为一种 普遍采用的快速DNA序列分析法。??为了提高DNA测序速度，1985年Chen和Seeburg建 立了一种针对双链DNA模板进行的双脱氧链终止测 序法，该法是将待测定的DNA片段克隆到质粒载体 上，直接用闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终 止法测定模板DNA序列。由于通常使用的质粒是 PUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止 -pUC体系DNA序列分析法。 这种方法的最大优点是，它无须将DNA克隆到M13 载体分子上，而是直接用碱变性的双链闭合环形 的重组质粒DNA作为模板进行序列分析，因此比 M13法更为简单快速，实用价值高。（4）测序反应物的合理应用???双脱氧链终止测序法的操作关键是ddNTP与 dNTP的用量比例，两者较为理想的分子比 在1：3至1：4之间。 大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段、测序酶是 经过改造的T7噬菌体聚合酶、TaqDNA聚合 酶 DNA序列分析中通常采用[α-35S］dATP代替 [α-32P］dNTP，以便获得更高的分辨率。5.3.11.3 大片段DNA的测序策略???DNA测序通常包括克隆、测序反应和读序三个步 骤。 前述两种DNA测序方法中，一次测序能直接读出的 DNA序列长度受到聚丙烯酰胺凝胶分离效果的限制， 一般情况下，最大限度不超过350个碱基序列。因 此，对于较大的DNA片段而言，必须将其分成较小 的片段分别测序，才能获得完整的碱基序列。 选择恰当的测序策略将直接关系到大片段DNA或基 因组DNA序列分析的工作效率。①随机克隆策略??又叫鸟枪法克隆策略，先将克隆DNA片段用 超声波打断或DNA酶Ⅰ切断，随机亚克隆到 M13载体上，分别进行DNA序列测定，然后 利用计算机进行数据分析，排出完整的DNA 序列。 鸟枪法的缺点是随机亚克隆易造成序列重 复测定，也易丢失某些序列；测序及测序 后的数据处理和分析工作量大，并需要计 算机帮助进行排序才能得到完整的序列。
②引物步移策略? ???将待测DNA片段克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸， 从DNA片段的一端开始逐步进行序列测定，直到另一端为 止。 引物步移法克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备的 繁琐步骤，也减轻了随后数据分析的工作量。 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基序列， 才能合成适当的引物进行测序，因此该策略难以自动化操 作。此外，引物合成费时费力，再加上目前常用的质粒载 体不易纯化等也都影响了该法的实施。 最近的研究表明：随机引物可作为引物步移法中的测序引 物，例如采用线性连接的3条6碱基的随机引物即可很好地 引导测序反应，这些结果为引物步移法的自动化带来可能。
③定向缺失克隆策略?利用核酸外切酶Ⅲ、Bal31或T4 DNA聚合酶等酶解方法， 从克隆DNA片段一侧进行不同时间的定向缺失，逐步缩短 DNA片段大小，分别回收并环化DNA缺失片段，使DNA片段 被保护一侧的引物结合位点与缺失不同长度的一侧连接重 组，转化筛选后得到一系列由待测DNA片段定向缺失后形 成的嵌套重组子，然后利用引物结合位点逐一测定这些嵌 套重组子中的待测DNA模板，最后根据重叠序列将不同片 段的序列拼接为完整的DNA片段序列。利用Exo Ill能特异性起始切割5’凸出 端或平末端的双链DNA，而不能有效 切割3’凸出端的双链DNA的特性，构 建待测DNA的定向嵌套缺失。5.3.11.4 DNA测序技术的发展???第一，非放射性标记检测物的使用 第二，DNA测序自动化：1是测序过程中某些具体 步骤的 机械化和自动化，2是高度集成的自动化测序仪的发明及 应用 第三，计算机在DNA测序中的应用：大规模测序计划在很 大程度上依赖于计算机程序对原始数据进行分类、整理和 排序，尤其是在随机测序策略中，采用计算机辅助分析， 不需确定各亚克隆在靶DNA中的位Z，也不必查明究竟测 定的是哪条链，得到的全部序列资料由计算机妥当排列， 拼接成为完整的序列，并借助计算机软件进一步开展包括 测阅读框架、重复序列识别和同源序列比较等分析，因此 计算机的应用大大加快了DNA测序的发展进程。?第四，现有技术的其他改进。主要包括： 增加每块胶上的泳道数；采用新型凝胶和 电泳技术；改进光学检测系统；提高测序 聚合酶的催}