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这个帖子发布于7年零84天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
目前我在表达一个26k左右的蛋白，pET32a载体，可溶性表达，带有Trx标签，500mM咪唑，20mM磷酸盐，PH 7.4洗脱，因为要做EK酶切，打算把体系置换为磷酸盐缓冲体系，然后过SP去除标签，可透析后出现大量沉淀，纯化下来的蛋白质浓度大概在2mg左右，但为了保证EK酶切的效率，就没有稀释。请问这种情况该如何处理？EK酶切在有咪唑存在的情况下是否可行？另外EK酶切的温度一般在多少为好?我用的推荐使用22度16小时，但对我的蛋白效果一般，请问37度对蛋白影响怎么样？有点长，谢谢耐心看完，寻求帮助！
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1、酶切条件：20mM Tris pH8.0,35-37度，16小时，做酶切梯度，找出最佳酶量。2、咪唑对EK活性有影响，应该去除。透析沉淀情况不明，可能和pH有关，可以考虑提高pH。3、酶切是融合蛋白不用做稀释，我用20-30mg/ml的浓度也一样切。4、市场上的EK有两种，一种是E.Coli.表达，活性低；一种是酵母表达，活性高。5、37度对蛋白有没有影响是无法事先判读的，做一次看看不就可以了吗。6、除酶切后的标签蛋白，可以考虑再用一次Ni柱。
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解答太详细了，多谢！透析我尝试了几个PH值，9.0,8.0,7.4，都不行，蛋白理论等电点是8.8,应该用多大PH。另外盐浓度对EK酶切有影响没？谢谢！
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可溶上清表达，Ni柱纯化后透析去除咪唑产生大量沉淀，这在我的经验中从来没有遇到过。能否把整个试验流程的缓冲体系讲一讲，看看怎么回事。盐浓度都酶切有影响，高浓度盐抑制EK活性。
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载体，pET32a，1mM IPTG诱导，超声破菌后离心保留上清（电泳验证目的蛋白在此）。上样buffer：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，平衡镍柱，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，20mM 咪唑洗脱杂蛋白，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑洗脱目的蛋白，也尝试过不加NaCl的。透析液：1、50mM tris，
PH 8.0,9.0,7.4
2、20mM NaH2PO4 PH 8.0,9.0,7.4都出现沉淀。蛋白等电点大概在8.8左右，还有要提的一点是，洗脱蛋白-20度冷冻保存复溶后也产生沉淀。洗脱蛋白浓度大概在2-3mg/ml，尝试过稀释到1mg/ml左右，也有沉淀。请帮我分析一下。另外我看园子里有用“万金油”进行蛋白透析复性的，不知道用在我这上面是否可以啊？
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to skykiller：刚刚再次拜读了您之前发的帖子，发现我目前这个蛋白和你所纯化的蛋白A比较类似，我是否可以用类似的方法呢？另外就是我不知道我这个蛋白的可溶性怎么样，如果镍柱纯化下来以后脱盐置换缓冲体系，是否会沉淀在柱子上呢？
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1、超声破菌buffer同上样buffer？pH？2、20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑 这个溶液检测过pH没有？如果回答都是yes的话，我也不知道沉淀的原因。万金油中含有EDTA，对EK有抑制。如果透析有沉淀，那么G25换液也很有可能沉淀。
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回答都是yes,PH值都是7.4，是不是就是我这个蛋白本身的溶解度的问题啊？或者说浓度太高了的原因？今天我配了点万金油，还是有沉淀，不过感觉是少了一点，明早再看看，测一下浓度再说。还有一个问题就是，我把万金油是放在透析袋的里面，最后的体系是不是就和我设置的体系一样了啊，里面的成分都可以透析掉吧？
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xiaolongqu edited on
蛋白在等电点的溶解度是最低的，你的是8.8，不适合用9和8吧，大概再低一些，另外你的蛋白本身是可溶还是膜蛋白，离子强度由500mM突然降到0，会对结构有很大影响的
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你纯化的buffer中都有0.5M NaCl，但透析溶液里就只有20mM NaH2PO4？可能是离子强度不够蛋白沉淀了。试一下透析buffer中加入0.1％Triton X-100或者甘油，并且提高NaCl浓度。或者你可以在Ni柱上切啊，这样连咪唑洗脱都不用了。
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我觉得可以这样：利用2M尿素有促溶的效果，先透析到2M的尿素中，再缓慢透掉咪唑，最后再透掉尿素！
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蛋白质透析除咪唑大量沉淀是比较常见的现象。可能的原因：1：咪唑本身具有很强的缓冲能力，尤其是高浓度的咪唑，所以很容易使透析buffer的pH值发生改变，从而使蛋白沉淀。2：咪唑对有些蛋白的可溶性具有一定的帮助，将咪唑更换成其他的buffer体系时蛋白会发生沉淀。3：透析的过程还是比较快的，buffer体系变化过快也会导致某些不稳定的蛋白沉淀。解决办法：1：柱上酶切，可以把透析咪唑这一步直接省略掉。2：过离子柱之前不透析，直接稀释上样。祝你好运！
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多谢楼上各位的解答，我又继续尝试了几个条件，目前看来，盐浓度是产生沉淀的主要原因。0.5M NaCL的情况下沉淀很少。这就出现了一个问题，我不知道这个浓度的NaCl对酶切有什么影响,正在尝试。另外楼上几位所提的柱上酶切是这么做的，有大概方案么？
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xiaolongqu 多谢楼上各位的解答，我又继续尝试了几个条件，目前看来，盐浓度是产生沉淀的主要原因。0.5M NaCL的情况下沉淀很少。这就出现了一个问题，我不知道这个浓度的NaCl对酶切有什么影响,正在尝试。另外楼上几位所提的柱上酶切是这么做的，有大概方案么？可以先将样品挂上Ni柱，并用酶切buffer平衡好，再把EK用1个柱床体积的酶切buffer稀释好，流进柱子里面，保温反应，反应完之后用酶切buffer洗下切下来的蛋白，最后用含咪唑的buffer洗下挂在柱上的蛋白，跑胶分析酶切的效率
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有一个问题，我这个蛋白切下来以后就没有标签了，那么我的蛋白应该在直接用酶切buffer洗下来的液体里吧
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xiaolongqu 有一个问题，我这个蛋白切下来以后就没有标签了，那么我的蛋白应该在直接用酶切buffer洗下来的液体里吧当然
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汇报一下，又做了几次尝试，在有0.5M NaCl存在的情况下，20mM
NaH2PO4，PH 7.0 透析还算正常，少量沉淀，以此体系进行酶切，22度 16小时，酶切不完全一半左右。另外今天无意中想到胰岛素溶解需要用HCL来溶解，是否我的蛋白也类似于胰岛素呢？大家是否有类似的经验，因为HCL酸性太强，我应该用多大的浓度来调呢，一半蛋白质可以耐受多大的酸度，或者说PH值？
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你应该是想置换成TRIS-HCL缓冲体系吧！这样是会产生沉淀，建议你开始就用TRIS-HCL可以省去很多麻烦！
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wangpei0671 你应该是想置换成TRIS-HCL缓冲体系吧！这样是会产生沉淀，建议你开始就用TRIS-HCL可以省去很多麻烦！我想置换为PBS或者tris体系都可以，也都试过了，都不行。
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同意liuyuefengzhang意见另外很多蛋白在盐离子浓度突然改变的情况下会沉淀。所以可以考虑在透析液中加入一定浓度的KCl或者NaCl；可以考虑加入glycerol或sucrose如果蛋白有一定的疏水性可以考虑加入少量detergent
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我比较感兴趣的是不知道楼主试了柱上酶切没有？我用过2个不同厂家的ek酶，都是带6*his的，柱上酶切的话ek也跟着挂柱了。真想知道楼主的结果是怎样的
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柱上酶切没有尝试，因为目前面临一个新的问题，我这个蛋白以后可能要做中试生产，所以可能要换载体，不用标签了！
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请问楼主，pet32a的标签是否需要去除，我需要有活性的蛋白，我的蛋白是36KD，非常感谢！
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可溶上清表达，Ni柱纯化后透析去除咪唑产生大量沉淀，这在我的经验中从来没有遇到过。能否把整个试验流程的缓冲体系讲一讲，看看怎么回事。盐浓度都酶切有影响，高浓度盐抑制EK活性。
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PH 8.0,9.0,7.4
2、20mM NaH2PO4 PH 8.0,9.0,7.4都出现沉淀。蛋白等电点大概在8.8左右，还有要提的一点是，洗脱蛋白-20度冷冻保存复溶后也产生沉淀。洗脱蛋白浓度大概在2-3mg/ml，尝试过稀释到1mg/ml左右，也有沉淀。请帮我分析一下。另外我看园子里有用“万金油”进行蛋白透析复性的，不知道用在我这上面是否可以啊？
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[求助]蛋白质透析为什么会出现絮状沉淀！？
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gyqing 艳过刘痕高手就是高手，，，还有几个问题请教，，１.为什么ＰＢＳ和ＴＥ作复性缓冲液是对复性有那么大的影响，，我用ＰＢＳ时几乎没有可容蛋白，，而换了万金油后可容性很好．．这和他门的化学性质到底有什么关系呢，，如果要讨论这个问题　应从那些方面考虑，，有那些资料可以参考吗？２.甘油的问题．甘油含有－ＯＨ基．在通常的反应中应表现为还原性，，如果他仅在保存时起缓冲作用的话，那么为什么在不加它时，容易沉淀的多．３.关于谷胱甘肽的问题．我门都认为氧化型谷胱甘肽起氧化二硫键的作用，而还原型的作用好象是对氧化型谷胱甘肽的氧化作用起平衡作用，然而，还原型氧化型谷胱甘肽溶液是及不稳定的易被氧化成氧化型的．．那，是什么使还原型氧化型谷胱甘肽被氧化呢，，应该是氧．由此推论，，氧使还原型氧化型谷胱甘肽被氧化．氧化型谷胱甘肽起氧化二硫键，还原型平衡氧化型谷胱甘肽的氧化平作用．还原型氧化型谷胱被氧化成氧化型后．会加剧对二硫键的氧化作用，，对氧化－还原谷胱甘肽对而言这似乎有点矛盾．．另外，，既然溶液中有能使还原型谷胱甘肽氧化成氧化型谷胱甘肽的物质，，按氧化还原规律那么就应该有比氧化型谷胱甘肽更强氧化能力的物质，，换句话说，，有比氧化型谷胱甘肽更易氧化二流键形成的物质，，从这个意义上讲　，用昂贵的氧化型谷胱甘肽似乎有点说不过去．．以上为笨鸟一时说想，，也不知道是否正确．．希望各位高手指点．．谢谢！！！！！！！！我想沉淀的多少并不是哪个透析体系好哪个不好，我想主要的原因还是有蛋白质的性质决定的，有的蛋白就是用PBS的透析体系好些，而有的是用TGE好些，也许就是由于那种体系适合你的蛋白决定用那种体系透析的吧。TGE这个体系我记得我是在一本叫做从纯化到星辰的书上看到的，作者是一个在美国做实验的中国人，具体什么原理没有讲，我也没有查过文献，所以如果说甘油还有其他作用的话，那偶就不知道了，呵呵。
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请问楼主这个问题解决了吗？我最近做复性也是 我采用的是梯度透析复性 但是在最后去除变性剂的过程就会大量沉淀 各种助溶剂都试过了 就是没有用 蛋白浓度在0.1mg/ml 左右 而且缓冲液ph离等电点&2 虐心啊 我们可以讨论讨论
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艳过刘痕 我想沉淀的多少并不是哪个透析体系好哪个不好，我想主要的原因还是有蛋白质的性质决定的，有的蛋白就是用PBS的透析体系好些，而有的是用TGE好些，也许就是由于那种体系适合你的蛋白决定用那种体系透析的吧。TGE这个体系我记得我是在一本叫做从纯化到星辰的书上看到的，作者是一个在美国做实验的中国人，具体什么原理没有讲，我也没有查过文献，所以如果说甘油还有其他作用的话，那偶就不知道了，呵呵。水是强极性溶剂，加入醇类后溶液的总极性减小，蛋白质分子之间疏水作用降低，沉淀也就少了。早年做疏水层析常用含乙醇或异丙醇的溶剂洗脱，但是量不好掌握而且易挥发。透析的操作时间长，只能用性质相对稳定的丙三醇（甘油），己六醇（甘露糖醇）之类多元醇。
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南华大学硕士学位论文肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白的表达、纯化及其临床诊断初步应用姓名：郑江花申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：吴移谋主要缩略语英文索引缩略词全称中文名称AA/aaaminoacid氨基酸A280absorbanceat280nm280nm处吸光度A450absorbanceat450nm450nm处吸光度bpbasepair碱基对BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CPAFChlamydialprotease-likeactivityfactor衣原体蛋白酶样活性因子CpnChlamydophilapneumoniae肺炎嗜衣原体CtChlamydiatrachomatis沙眼衣原体CVcoefficientofvariation变异系数DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPsdeoxynucleosidetriphosphates脱氧核苷三磷酸DTTdithiothreitol二硫苏糖醇ECLenhancedchemiluminescence增强化学发光EDTAethylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验GSHreducedglutathionehormone还原型谷胱甘肽GSSGoxidizedglutathione氧化型谷胱甘肽GSTglutathioneS-transferase谷胱甘肽S-转移酶6×His6histidinedomain6个组氨酸残基HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HSP60heatshockprotein热休克蛋白60IPTGisopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷mAbmonoclonalantibody单克隆抗体MIFmicroimmunofluorescence显微免疫荧光法MOMPmajoroutermembraneprotein主要外膜蛋白Mrrelativemolecularweight相对分子质量2原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：年月日关于学位论文使用授权说明本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者签名：导师签名：日期：年月日肺炎嗜衣原体CPAF重组蛋白的表达、纯化及其临床诊断初步应用硕士研究生：郑江花导师：吴移谋教授中文摘要目的：构建肺炎嗜衣原体（Chlamydophilapneumoniae,Cpn)蛋白酶样活性因子（Chlamydialprotease–likeactivityfactor，CPAF）免疫优势区(181～400aa,CPAFm)基因的重组表达体，在大肠杆菌中诱导表达，纯化表达产物，对其进行免疫活性分析；建立间接ELISA方法检测Cpn感染临床标本,评价重组蛋白在临床诊断中的应用价值，为制备Cpn感染快速诊断试剂盒提供实验依据。方法：通过生物信息学分析并查阅文献，筛选CPAF免疫优势区基因，以CpnCWL029株基因组DNA为模板，高保真PCR扩增目的基因，将其亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体中构建重组质粒，经酶切和测序鉴定后，转化至E.coliBL21中，IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE和Westernblot分析和鉴定表达产物；复性后用谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferase，GST）琼脂糖凝胶FF纯化重组蛋白，A280紫外分光光度法测定纯化蛋白浓度。用纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，优化后进行可靠性试验和稳定性试验，并检测其与Ct的交叉反应。以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔，用ELISA方法检测兔血清中特异性抗体效价，分析重组蛋白的免疫原性；用间接ELISA方法和Westernblot分析重组蛋白的免疫反应性。间接ELISA方法与金标准方法MIF检测临床标本，评价重组蛋白在血清学诊断中的应用价值。以纯化的抗重组蛋白多克隆抗体为一抗建立间接ELISA方法，与进口PCR试剂平行检测呼吸道感染患者痰咽拭子，评价重组蛋白在抗原检测中的应用价值。结果：软件分析CPAF抗原表位并查阅文
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