如何将dna片段插入到ptopo载体-t或peasy-blunt-simple克隆载体中

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【求助】【在线等】请问如何知道PCR克隆载体上LacZ区域的读码框?
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使用使用transgen公司的pEASY-blunt simple克隆PCR产物,和T载体一样的蓝白斑筛选原理,载体说明书上写LacZa flagment bases 1-449,序列如下,PCR产物连入位点用横线表示。由于我实验需要,现在要知道载体上这段序列表达LacZ时的读码框,问了技术支持答不出来。有人建议把序列翻译出来用Blast比对应该可以知道,但我们这没人会用。请教有经验的前辈,十分感谢!!!AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTGCCCTT——————AAGGGCAGCTTCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGC
不知道邀请谁?试试他们
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本来可以用NCBI的 blastX ,或者我常用的一个DNA RNA 蛋白序列分析软件
一键找出读码框ORF(必须大于100aa)。但是看来都是没必要了,请参看一下网站为你购买载体公司所提供的信息,下图中的DNA序列 分3个核苷酸一连,代表一个密码子,这样你应该知道读码框是什么样了的吧。
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这个图我看过,但它虽然两边是三个苷酸一连,但是中间靠近PCR产物插入位点的地方,这种分隔中断了,按上游的分隔再继续往下数的话(不计PCR产物)到第二行就和图上重新给出的分隔冲突了。
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我怎么看是对的呢??
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第一行最后多一个T。我已经知道怎么做了,多谢你指点NCBI的blastX~! ^^
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emilymu825 edited on
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官方公共微信分子克隆载体如何选择?
由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小,两者呈反比关系,因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体,因为复制起点和标记基因具有生物特异性,所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。
选择克隆载体的几个重要参数:
1、实验对象
2、实验性质
3、载体容量
合适克隆位点
5、载体的稳定性
6、克隆载体的特点
实验对象:
1、供体:遗传背景与DNA特点等,其中包括染色体DNA大小,基因大小与结构,碱基组成,目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。
2、受体:各种中间宿主与终宿主的遗传背景,如遗传物质的传递方式(包括认为的方法),DNA限制修饰系统,DNA重组基因特点,基因产物修饰系统,即转录与翻译后修饰系统。
实验性质:
分子克隆的一般程序包括以下几步:
1、分离供体DNA或RNA(mRNA)和载体DNA
2、构建基因文库或cDNA文库
3、目的基因或cDNA克隆的筛选
4、目的基因或cDNA片段的鉴定:限制酶谱,次克隆,核苷酸序列分析,基因结构分析等
5、基因表达与调控机理的研究
克隆载体容量:
M13mp载体&&&
细菌质粒载体&&
λ载体&&&&&&&&
cos质粒载体&&&
P1载体&&&&&&&&
pEASY载体&&&&&
∽1000kb
合适的克隆位点:
单克隆位点和多克隆位点;单克隆位点的克隆载体就能够很方便的在基因上设计酶切位点,如pEASY-T1 Simple
Cloning Kit克隆载体,双抗,无多克隆酶切位点;而多克隆位点的克隆载体中,酶切位点多,相对于实验来说也更容易。如pEASY-T1 Cloning
Kit克隆载体,双抗性,酶切位点多。
克隆载体的稳定性:
克隆载体的稳定性决定着实验的成败,如果克隆载体在基因克隆过程中足够的稳定,而且能够多次的重复利用,那么此克隆载体的稳定性很好。如pEASY-T5 Zero Cloning
Kit克隆载体的研发数据显示10kb目的基因可以稳定的连接。
克隆载体的特点:
不同品牌的克隆载体或多或少都有着不同的特性差异,即使基本的原理和作用都相同,但是一些细小的差别能决定着生物实验过程的成败。如pEASY系列的克隆载体就有着5min快速克隆,克隆稳定性极强,最大的一个特点是一般的克隆载体需要在中间的实验步骤加入T4连接酶,将目的基因和载体基因序列链接在一起,而pEASY系列克隆载体属于一体式克隆载体,在载体基因的两端就附带了“胶水”,能有效的使目的基因连接到载体基因上。
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