君，已阅读到文档的结尾了呢~~
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
载体构建.doc
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口[发明专利]单酶切载体的构建方法有效
申请/专利权人：
公开/公告号：CNA
发明/设计人：;;;;;;
公开/公告日：
主分类号：
搜索关键词：
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国农业大学，未经中国农业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【】
【说明书】：
技术领域本发明涉及DNA重组技术，具体地说，涉及一种单酶切载体的构建方法。 背景技术表达载体的构建是转基因技术的关键步骤，其主要过程是通过一系列酶切和连接反应将目的基因表达框与载体重组，再将重组后的载体转染宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的表达。目前酶切技术主要分为双酶切和单酶切两种。 双酶切是指载体构建时在载体序列上找到2个合适的酶切位点，同时在目的基因的上下游引入相应的酶切位点；然后通过双酶切反应，在载体和目的基因上个形成2个不同的粘性末端；最后通过连接反应，目的基因可以高效的并以特定方向插入到载体中。双酶切反应的优点是载体不会发生自连，目的基因的插入方向确定和较高的连接效率；限制双酶切应用的因素是要求载体合适位置上存在2个酶切位点，而且要求2种限制酶必须在同一种缓冲液中具有高酶切活性。某些特殊的载体或研究者自己构建的载体就难以找到2个合适的酶切位点，这个时候就需要用到单酶切技术。 单酶切是指在载体的目的基因插入位点处只有一种可用的酶切位点，这样目的基因上下游只能导入相同的酶切位点，经过酶切反应后，在载体和目的基因的两端形成了4个相同的粘性末端，最后通过连接反应将目的基因插入载体中。限制单酶切技术应用的主要问题是连接效率低，连接时间长。这是由于酶切后4个粘性末端相同，载体极易发生自身连接，而且目的基因会以2种不同的取向随机整合到载体中，这两个因素极大的降低了单酶切连接效率，只有双酶切效率的 5-10％左右。研究者尝试了很多方法提高单酶切效率，比如载体5，端去磷酸化等，但效率也不高，而且增加了操作步骤难度、以及核酸降解的机会。无论是单酶切和双酶切，其连接一般都是利用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，连接时间在10h以上。 发明内容为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种新的提高单酶切连接效率的单酶切载体的构建方法。 为了实现本发明目的，本发明提供一种单酶切载体的构建方法，包括如下步骤： 1)单酶切位点的筛选； 2)在目的基因两端引入酶切位点； 3)对载体和目的基因进行酶切和电泳切胶回收； 4)对目的基因和载体混合液进行温度梯度预处理； 5)使用Takara公司的连接T载体用的solution I(主要成分为T4DNA连接酶+Takara公司生产缓冲液)连接载体与目的基因。 其中，步骤1)根据载体的结构和自身研究的需要确定一个限制性内切酶位点。 其中，步骤2)在目的基因的5’和3’端非编码区设计扩增引物，在上下游引物的5’端引入步骤1)确定的酶切位点，加上酶切位点相应的保护碱基，利用高保真酶扩增目的基因，扩增出5’和3’端含有相应的酶切位点的目的基因。 其中，步骤3)将载体和目的基因分别同时酶切，酶切体系根据实际需要确定，一般40-50μL。酶切反应结束后，酶切产物需要电泳分离并切胶回收，电泳时间不能太长，以10-14min为宜，长时间电泳会损失核酸结构。切胶时紫外不能长时间照射胶面，避免损伤核酸结构。 进一步地，步骤4)载体与目的基因按物质量浓度1：10的比例加 入。 载体和目的基因混合液按以下程序处理： 80℃：3min； 55℃：15s； 45℃：15s； 16℃：30s； 在16℃30s结束后再加入solution I，在16℃下连接90min。 作为优选，步骤4)连接反应的总体系为15-20μL。 (1)80℃，3min的目的是为了增加核酸分子的内能，分子运动加剧，使处于自连状态下的载体分子解开，增加目的基因与载体结合的几率，而双链在这一温度不会解开； (2)55℃，15s和45℃，15s的目的是通过缓慢降温实现目的基因与载体以粘性末端相连，通过这一系列温度的变化，可以增加目的基因与载体粘性末端配对； (3)16℃,30s的目的是使体系温度降到16℃，加入连接反应液solution I，避免高温影响solution I中T4连接酶的活性。加入solution I时沿管壁加入，动作要轻，不必混匀。 前述的构建方法中，目的基因与载体连接后，还可包括如下步骤： A、转化感受态细胞 连接反应完成后4℃保存，或直接转化感受态。 (1)感受态取出后冰上融化，将连接产物全部加入感受态中，用移液枪稍稍混匀； (2)冰上静置30min； (3)42℃热激60-90s； (4)冰上静置1min； (5)加入不含抗生素LB培养液，37℃恒温摇床培养1h，200r/min。 B、菌液涂板培养 (1)培养好的菌液离心2min，8000r/min； (2)用移液枪洗掉多余上清，保留100μL左右，并混匀； (3)用涂棒将100μL菌液均匀涂抹于含相应抗生素的培养皿上，37℃生化培养箱中培养12h。 C、挑斑培养 培养皿培养12h后，菌落长出挑取100个左右单克隆菌落，在1mL含相应抗生素的LB培养液中培养5h左右。 D、菌落PCR鉴定 对挑斑培养后的菌液进行PCR鉴定，PCR体系如下： 根据不同目的基因和载体设计不同的引物，单酶切载体构建需要跨载体和目的片段进行引物设计。根据不同的引物和模板设定PCR程序，目的是鉴定菌落中是否成功转染上了目的载体。PCR产物电泳后如果出现相应大小的条带，证明转染上了目的载体。 本发明的有益效果在于： 本发明提供了一种单酶切载体构建的新方法，极大地提高了单酶切连接效率并极大地缩短了其连接时间。通过本发明方法，单酶切连接效率显著提高，同时连接时间只需90min左右，极大节约了人力、物力，降低了单酶切操作难度。 附图说明图1为pBC1乳腺特异表达载体结构图。 图2为本发明HIOMT切胶回收产物的电泳检测图。 图3为温度处理组菌斑。 图4为对照组菌斑。 图5为温度处理组PCR鉴定。 图6为对照组PCR鉴定。 图7为温度处理组与对照组菌落PCR阳性率比较。 具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1pBC1-HIOMT乳腺特异表达载体的构建 pBC1乳腺特异表达载体购自Invitrogen公司。该载体的结构比较单一，只有1个氨苄抗性基因，没有多克隆位点(MCS)。整个载体上只有XhoI、NotI、SalI3个可用的酶切位点，而且要求目的基因必须插入XhoI位点处才能正常的表达(图1)。因此在构建载体时只能选择单酶切方法。 1、带有XhoI酶切位点的HIOMT基因全长的克隆 (1)HIOMT全长克隆引物的设计 我们在HIOMT基因的5’和3’端非编码区分别设计上下游引物，在上下游引物的5’端引入了XhoI限制性内切酶的识别位点CTCGAG，并加入保护碱基CCG，引物序列如下： 正向引物：CCGCTCGAGCCACCATGTGCTCCCAGGAG； 反向引物：CCGCTCGAGCGGTCACTTTCTGGCCAAGA。 (2)HIOMT全长PCR扩增 以绵羊松果体cDNA为模板，利用上述引物对和Max高保真酶(Takara：R045Q)进行PCR扩增。反应体系如下： 98℃预变性2min； 98℃变性10s，55℃退火15s，72℃40s，35个循环； 72℃延伸5min，4℃保存。 2、PCR产物电泳与切胶回收 PCR结束后，进行电泳，电泳缓冲液为TAE，琼脂糖凝胶浓度为1％，电压90v，电泳时间12min，切胶回收，胶回收试剂盒购自Takara(D301)。回收产物经电泳检测(见图2)，目的条带位于1000bp-1500bp之间，与目的基因(1058bp)大小相当(参阅NCBI核酸数据库)，表明目的基因成功被克隆并引入酶切位点。 3、载体与目的基因的酶切与连接 (1)pBC1和HIOMT的酶切与产物回收 将pBC1和上一步骤中回收到的HIOMT基因分别同时进行XhoI酶切，XhoI限制性内切酶购自Takara(1094A)，酶切体系如下： 37℃酶切4h，反应结束后，酶切产物需要电泳分离并切胶回收，按照步骤2中的方法进行操作。 (2)载体pBC1与HIOMT连接
专利文献下载
1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书；
2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利（升级中）；
3、专利数据每周两次同步更新，支持Adobe PDF格式；
4、内容包括专利技术的结构示意图、流程工艺图或技术构造图；
5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升！欢迎使用！
该文献正飞奔而来，请耐心等候...20
友情链接：交换友情链接需要网站权重大于3，网站收录10W以上，如符合条件，请联系QQ：。
行业网站：相关推荐：
400-周一至周五 9:00-18:00
服务热线：400-投诉建议：022-
扫一扫，微信关注高智网
高智&让创新无法想象2000万件&专利数据酶切位点设计和选择_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
酶切位点设计和选择
阅读已结束，下载文档到电脑
想免费下载更多文档？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，方便使用
还剩7页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢导读：重组质粒构建是常用的分子生物学手段，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，2)载体酶切的问题，始终不能成功构建重组载体，二、载体酶切的问题，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定，现在我每次构建之前，这步骤属于质粒载体与外源DN段的连接反应，实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，用KpnI和HindIII构建重
做酶切要注意的问题
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下：
1) 克隆基因的酶切位点问题
2) 载体酶切的问题
3) 连接片段浓度比的问题
在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。
二、载体酶切的问题
1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点，就先
分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DN段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和DN段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DN段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。
实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。
实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI，在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定HindIII位点失效。最后他责备本人暗中保留一手，没有倾攮相授。呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。呵呵，你说冤不冤？这世道啊!也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。
两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题
一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“一、二”，16℃ 10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错（特别声明我不是天为公司内线，呵呵）。
这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：
1． 取一平皿。
薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固 (4 ℃可以存一个星期)。
3． 平皿背面可以画成小方格。
4． 一小格中点1 ul样品。
5． 另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng)
6． 凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。
OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。
包含总结汇报、办公文档、教程攻略、旅游景点、人文社科、外语学习、资格考试、IT计算机、文档下载以及载体构建经验谈等内容。
相关内容搜索}