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【兴趣小组】western blot 条带形状讨论
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这个帖子发布于6年零108天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:10
做western blot 近一年，在要发文章的时候发现条带不够漂亮，高表达蛋白有时是哑铃状，有时是笑脸状，做内源性蛋白时同一蛋白会出现条带不在同一水平线上，或者同一条带只显影一部分或者不同实验鼠个体组织的β-actin有的条带缺失，做co-ip时拉下来的条带比较弥散，位置上移10-20KD左右。
这些现象有谁遇到并解决了，或者谁知道其中的原理，谢谢一起分享，共同进步共同发财。本人是中南大学湘雅医学院的一名技术员。配试剂配胶方案：见附件
跑胶：80v，30min；120v，70min（8%
常规）转膜：290mA，90min
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个人经验仅供参考：哑铃状：凝胶不均匀，可能是胶未混匀，也可能是凝胶时间过短，凝胶和室内温度还是有关系的，一般而言时间凝胶1小时会好些笑脸状，不在同一水平线：可能和电泳时的电压有关，电压调小如90V可能就会改善。还有一个可能是你电泳的那根导丝没有清洗干净，导致电泳的时候不均匀，直观看到的就是电泳时冒出的气泡有些地方多，有的地方少，气泡多的地方电泳可能较快，反之较慢，出现不在同一水平线。此外，上样的样本要没有杂质，如果样本有问题，也可能出现上述几种形态的。条带缺失个人觉得可能是转膜时候的问题，可能转膜时有气泡或者未充分接触等等。
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（1）带型不漂亮主要原因可能是你跑胶的速度太快了，欲速则不达，我一般40 v， 1h, 然后80v跑完。这样带型一般比较漂亮。另外，Page胶制备时一定要充分混匀，如果胶不均匀条带也不会漂亮；条带粗的蛋白也适当降低蛋白上样量，一抗和二抗的比较适当降低。（2）条带来时缺一块，可能是由于你的一抗孵育时间太短了，我一般是4度过夜，而不是室温1-2h,这样抗体才能与蛋白带充分接触。
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1、制胶时胶没混匀，导致凝胶不均匀，胶混匀时按一个方向缓慢搅动就可以，还有就是制胶时候的温度不要太高，最好是25°C左右，另外就是上样的时候要充分混匀，2、多加点蛋白酶抑制剂3、孵育抗体一定要让抗体均匀的接触膜的表面，最好是4°C过夜，4、一抗的浓度可能还有点高了，摸索一抗最佳浓度。
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western结果条带呈微笑状
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western测定LC3结果，请教这是什么原因造成的呀？
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可能是胶的问题
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绝对是胶配的不好，不均，再一个，蛋白用之前一定要离心，然后混匀再上样
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自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）更详细的下面这个网址里面有
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&&求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法
求助Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法
去年下半年做了一段时间WB实验，前田再次做，只换了个一抗和细胞裂解液，其他都没变（当然目的蛋白也不同了）。去年能出条带，这次却不能了。。。
现将改变的试剂及可疑操作罗列如下，供大神分析并搭救:hand:
1.细胞裂解液：RAPI细胞裂解液（强），碧云天生物技术研究所；
2.一抗:Isotype, IgG;& & Host, R& &&&Species Reactivity, Human, Rat。&&二抗：Goat Anti-Rabbit IgG.
3.目的蛋白大小约21KD，内参用GAPDH，于27KD-18KD处剪膜。一抗用5%BSA1:1500稀释，37oC孵育90min；二抗用5%BSA1:3000稀释,37oC孵育90min。
4.DAB显色试剂盒显色。PVDF膜的熊样如下：A
今天做了点蛋白试验（有叫“点杂交”），膜泡甲醇，晾干；蛋白样品（4个）按20ug/10ul加2xLoading Buffer煮沸后点于膜上,干后封闭，孵一抗，二抗，显色。PVDF膜熊样如下：B、C。（白斑之间即为蛋白点样点，由于膜被封闭液和5%BSA浸透而呈现这样）
前面的A膜有用marker,后面点蛋白实验B，C没用。我想问一下，我的一抗是新买的，N-term抗体，这跟二抗结合有影响吗？还有，从我的实验结果你能看出什么吗？
好的，谢谢！还有什么宝贵的建议吗？
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