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作者：赛先生
来源：赛先生
关键词：肿瘤免疫,PD-1,T细胞,CAR-T,CD8 T,CTLA4
与手术、放疗和化疗等传统手段明显不同，的免疫治疗，对人类健康和生物产业而言是一场&革命&。有不少业内人士认为，这一领域的成功可能在近几年获得诺贝尔奖。那么，该领域的功臣是谁？其科学基础又是什么？
董晨（清华大学研究所教授）
近几年，有关肿瘤免疫治疗的好消息不断传来。一系列成果的出现，使美国《科学》杂志在2013年把免疫治疗推为当年最大的科学突破。
有几项进展格外引人瞩目：继美国食品和药品管理局（）2011年批准anti-CTLA4（细胞毒性T细胞抗原-4抗体）用于治疗，PD-1（程序性细胞死亡1）抗体也在2014年获准用于同类，并提前结束肺癌第三期；CAR-T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）技术在治疗方面也有巨大成功。
一时间，有不少业内人士认为，这一领域的成功可能在近几年获得诺贝尔奖。那么，谁应该得奖呢？更重要的是，这些发展的科学基础是什么？
T细胞疗法方兴未艾
我们体内的T细胞主要是带有&&T细胞受体的一类，而其中又有表达CD4和表达CD8分子两种。CD4 T细胞主要分泌细胞因子来调节其它免疫细胞的功能，因此被称为辅助性T细胞。CD8 T细胞则被叫作杀伤性T细胞，对于病毒感染的细胞，它们能特异性地识别并杀死它们。
家一直想利用疫苗来引发肿瘤特异性的CD8 T细胞的功能，从而消灭肿瘤。针对病毒抗原的疫苗，对于人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）引起的肿瘤，都有不错的预防作用。但是治疗性疫苗，包括利用树突状细胞的疫苗，到目前都没有太强的治疗效果。位于美国西雅图的生物制药公司Dendron有个治疗前列腺癌的树突状细胞疫苗，曾因获批准而股票大涨，但又因治疗效果不佳在最近宣布倒闭。
界的另一种思路是把肿瘤病人的T细胞活化以后回输给病人，但是病人血液里的肿瘤特异性T细胞一般比较少。美国癌症研究所的Steven Rosenberg博士发现了一种新的办法。他本人也是外科医生，可获得大量的肿瘤组织用于实验。他的实验室就把组织里的T细胞用T细胞受体活化剂以及生长因子-白细胞介素2扩增起来。组织里的T细胞很多是针对治疗的。这些T细胞被回输到病人体内，有比较好的治疗效果。据我所了解的美国安德森癌症中心（MD Anderson）的结果，采用这种被称为&Adoptive T Cell Therapy（过继性T细胞治疗）&的疗法，大概有50%以上的病人有治疗反应。
但是对于其它肿瘤，尤其是非实体瘤，不一定像的免疫性那么强，或者很难收集到肿瘤特异性较强的T细胞。一些科学家就想到，把针对肿瘤的表面受体加到病人血液里的一般CD8 T细胞上，从而使它们也可以攻击。CAR-T就是这样一种方法，把识别所有B细胞都表达的CD19分子的受体加上能引起T细胞活化的信号传递区域，形成所谓的嵌合人造受体。这个受体表达的T细胞就能攻击和消灭所有表达CD19的细胞。现在这个技术方兴未艾，在白血病治疗中有显著疗效，并正在尝试用于实体瘤。多个CAR-T的生物技术公司都大热。
免疫系统的重要&刹车&
既然很多肿瘤中，尤其是，都有肿瘤特异性T细胞，这说明免疫系统是可以识别肿瘤并且试图控制的，但为什么它们不能消灭？我们还有办法促进这些T细胞的功能吗？
T细胞对于病毒感染的细胞有很强的杀伤力，但是我们机体有多种办法使CD8 T细胞不会误判而攻击自己正常的组织细胞。这就涉及到免疫学里的共刺激因子学说。美国国立卫生研究院（NIH）的科学家Ronald Schwartz等发现了T细胞活化，不仅需要T细胞受体的第一信号，而且需要第二信号，主要来自于CD28受体。ICOS（可诱导共刺激分子）是另一个共刺激受体，笔者的实验室在本世纪初做过很多工作，最近，清华大学研究所祁海老师有新的突破。只有两个信号都有，T细胞增殖和功能才会最强。CD28受体在T细胞表达，而它的配体CD80和CD86来自抗原递呈细胞。在正常情况下，或者有时，CD80/CD86表达是比较低的。所以，机体不会发生疾病，对肿瘤的免疫力也不强。但是根据前耶鲁大学Charles Janeway教授的理论，在感染时，天然免疫系统的活化会导致CD80/CD86的高度表达，T细胞功能就非常强了。鉴于这种考虑，不少学者也在思考如何对肿瘤特异性T细胞增强第二信号，比如通过坏死因子TNF受体家族的OX40和4-1BB。CAR-T的嵌合受体就综合了第一和第二信号。
现任职于MD Anderson免疫系的James Allison博士（笔者过去的系主任）则采取了另一种策略。CD80/CD86除了CD28，还有另一个受体&&CTLA4， 在T细胞活化以后表达。华裔学者Tak W. Mak（麦德华）以及哈佛大学的Arlene Sharpe 教授通过CTLA4基因敲除小鼠的研究，发现这些小鼠出生不久就死于疾病。因此，CTLA4是免疫系统中一个至关重要的&刹车&。Allison博士就想到通过抗体阻断CTLA4功能，以增强CD8 T细胞对肿瘤的杀伤力。他的课题组通过对小鼠模型的研究，证明了这个办法是可行的。后来被施贵宝收购的Mederax生物技术公司，根据这些结果制造了人源化CTLA4抗体，并对治疗进行了。大约有20%～30%的晚期病人有治疗反应，但最鼓舞人心的是，两年存活率相当好。很顺利地批准了这个药。
关于CTLA4抗体的作用机理，Allison博士最近有研究发现，它的作用可能不是或者不仅仅是阻断CTLA4和CD80/CD86的结合，而是去除了一类被称为是调节性T细胞的CD4 T细胞。这类T细胞被日本著名学者Shimon Sakaguchi教授在1995年发现。越来越多的证据表明，调节性T细胞对于保持机体的免疫耐受起着不可或缺的作用，它们在肿瘤中也大量存在，并高度表达CTLA4。 所以，CTLA4抗体可能通过去除调节性T细胞而增强免疫。这也解释了为什么接受CTLA4抗体的病人，常常会有疾病出现。
寻找更好的抗体
PD-1分子是日本著名家本庶右（Tasuku Honjo）教授在1992年发现的。年，他的课题组报道，PD-1在B和T淋巴细胞都表达，而且起到类似于CTLA4的负调节作用。
他们发现PD-1基因缺失小鼠会得自身免疫疾病，但比CTLA4缺失小鼠要慢很多、轻很多。PD-1有两个配体，都和CD80/CD86分子有氨基酸序列相似性。第一个配体PDL1，首先由华裔家陈列平在1999年发现，并由本庶右的实验室在2000年证明是PD-1的配体。另一个配体PDL2，被美国哈佛大学医学院教授Arlene Sharpe实验室等在2001年报道。
PDL1/L2在抗原递呈细胞都表达，PDL1在多种组织也有表达。陈列平实验室首先发现PDL1在肿瘤组织高度表达，而且调节里的CD8 T细胞。2006年，美国埃默里大学（Emory University）的Rafi Ahmed教授研究慢性感染病毒时发现PD-1控制CD8 T的&衰竭&，这样T细胞不能很好地发挥抗病毒功能。
由于CTLA4抗体的成功，多家公司也制造了PD-1抗体。本庶右教授合作的日本公司Uno和施贵宝一起制造了PD-1抗体，除此，默沙东、罗氏、等也都有PD-1或PDL1的抗体。施贵宝和默沙东在PD-1抗体对的中首先获得突破，有比CTLA4抗体更好的治疗反应，副作用也更低，已于2014年在日本和美国获得药监部门正式批准，对肺癌、淋巴癌、肾癌等多种治疗都有不错的效果。另外，CTLA4和PD-1抗体联用，在治疗反应和多年存活率方面，均远远好于单一抗体。
除了CTLA4和PD-1以外，还有其他的负调节共刺激因子，比如陈列平、我们实验室和Tak W. Mak都研究过的B7-H3，以及陈列平、James Allison 和我们实验室同时发现的B7-H4/B7S1/B7x 等等。这些分子对肿瘤免疫发挥的功能还不清楚。在治疗方面，也许针对这些分子的药物和PD-1联用，会比CTLA4抗体毒性更小，或者在对其它的治疗中比现有药物效果更好。我觉得这一领域将会再度成为的大热门。
免疫治疗走进新时代
针对肿瘤疾病，我们已进入一个免疫治疗的新时代。免疫治疗是通过调节免疫系统，尤其是CD8 T细胞功能来实现的，跟以前的针对的手术、放疗和化疗有明显不同。
免疫治疗的突破，是和免疫耐受的密不可分的。克服机体免疫耐受机制，将是今后免疫治疗的主要目标。新的办法和组合将会不断涌现。
这一领域的最大功臣，一般被认为应该是James Allison。过去十多年，他致力于把成果转化到临床治疗上，是免疫领域的旗手。其他有可能一起获诺贝尔奖的是本庶右博士， 还有家常提到的Shimon Sakaguchi博士，但Shimon Sakaguchi也有可能和其他学者因发现调节性T细胞而另外获奖。
肿瘤的免疫治疗，对人类健康和生物产业而言是一场&革命&。中国有那么多的病人，我们应该做什么？
笔者觉得这方面还有很多的机会，各种肿瘤的最佳治疗方案还有待最后建立，我们还可以迎头赶上。但是，我们必须大力发展。中国只有发展一批世界级的肿瘤免疫实验室（我现在觉得没有一个），我们才可能有原创的药物不断出现，才能像日本一样有机会在10年后问鼎诺贝尔奖。否则，我们的病人就只能依靠外国的制药公司进行治疗。（）
作者注：感谢王晓东和刘勇军博士阅读本文并提供宝贵意见。作者参与了多家生物技术制药公司，观点可能有偏颇，特请读者注意。
(责任编辑：yixin.zhang)
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中国的市场的确存在很大的隐患，干细胞行业是个专业性要求较高的行业
个体化医疗是未来医学研究与应用的趋势，而个体化治疗的关键在基于生物分子标志物的诊疗策略
中国疫苗市场的巨大潜力，吸引了世界排名最领先的跨国疫苗制造巨头前来淘金。&&&肿瘤细胞 在 生物学 分类中
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and MCF-7 of tumor cell lines,too.
&&&&JSW103代谢产生的甲醇提取的混合物对肿瘤细胞系B16和SGC7901体现有较强的选择性,其IC50分别达到了0.2701μg/mL和0.097μg/mL,并且对Bel 7402、H446、MCF-7也表现出较高的活性。
&&&&Conclusions
18 upregulates FasL protein expression in colon cancer cell line and enhances the ability of cancer cells to counterattack T lymphocytes.
&&&&结论　细胞因子IL 18具有上调大肠癌细胞FasL蛋白表达水平 ,增强肿瘤细胞反向杀伤T淋巴细胞的作用
&&&&These ceramides didn't exhibit significant cytotoxicity against the human cancer cell lines Bel-7402, NCI-4460 and the normal human cell lines L-02 in the preliminary cytotoxic activity investigation.
&&&&这两个化合物对肿瘤细胞系Bel＿7402,NCI＿4460和人体正常细胞系L＿02不显示有意义的细胞毒性。
&&&&Methods\ Northern blotting method was used to detect the expression of the gene in 10 embryo tissues,6 cancer cell lines,4 cancer tissues.
&&&&方法　利用Northern杂交方法检测 10种人胎儿组织、6种人肿瘤细胞系、4种人的肿瘤组织及癌旁组织中该基因的表达。
&&&&? Objective To establish a CD151 overexpression cell line, and to set up a model for studying the role of CD151 in the cancer cell motility and metastasis.
&&&&目的构建高表达CD151细胞系Tca,为研究CD151在肿瘤细胞迁移及肿瘤转移中的作用和相关机制提供实验模型。
&&&&The protein showed high homology with human GMPRand was named as GMPR2. Northern blot analysis indicated a ubiquitous expression ofGMPR2 mRNA in normal human tissues and cancer cell lines.
&&&&该蛋白质与人鸟苷酸还原酶在氨基酸水平上有高达79%的同源性，并暂时命名为GMPR2。 Northern杂交分析显示新分子的mRNA广泛表达于正常人体组织及多数肿瘤细胞系。
&&&&C-myc oncogene expression in peripheral blood lymphocytes
from normal human and in tumour cell lines
&&&&C-myc在正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株上的表达
&&&&Furthermore, DNase-like activity in vitro and the ability of inhibiting tumour cell growth in vivo are as following G-O≥ G-N3>G-C5>G-N3C5. In conclusion, results in this study demonstrate the consistency of the structure and bioactivity of gelonin with the protein of α+β conformation.
&&&&它们的构象变化与类DNase活性和抑制肿瘤细胞生长的能力均为GO≥GN3>GC5>GN3C5.结果再一次证明了具有α+β型结构蛋白,gelonin的构象与生物活性的一致性.
&&&&A COMPUTER IMAGE ANALYSIS APPROACH
FOR QUANTITATIVE MEASUREMENT OF
THE TUMOUR CELL
&&&&口腔颌面部涎腺肿瘤细胞计算机图象分析
&&&&Research indicates that gastrin is a autocrine growth factor of gastrointestinal tumour cell and it can promote cancer cells through enhancing proliferation, inhabiting apoptosis,stimulating migration and cooperating with COX-2. Antisecretory agents, receptor antagonist,antisense polynucleotide and anti-gastrin antibody have been evaluated as anti-gastrin therapy of gastrointestinal tumour.
&&&&研究显示胃泌素是胃肠道肿瘤自泌性的生长因子，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、刺激浸润以及和COX-2协同作用促进肿瘤生长。 胃肠道肿瘤的抗胃泌素治疗分为分泌抑制、受体拮抗、反义寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗体治疗。
&&&&We construct a therapeutic vaccine against gastrointestinal tumour consisting of the nine terminal amino acids of human G17 linked or crosslinked via a peptide spacer to P64K. The vaccine induces body to produce anti-gastrin antibody, which could neutrilize the gastrin endocrined or autocrined by tumour cell and inhibit the growth of tumour.
&&&&我们选择P64K蛋白，通过一段多肽交联桥(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)与G17的B细胞表位交联或者是构建G17P64K融合蛋白来作为治疗性疫苗，诱导机体产生抗胃泌素G17的抗体从而中和并清除内分泌或者是源自肿瘤细胞自分泌的胃泌素，达到治疗胃肠道肿瘤的目的。
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> 干扰素-α对卵巢癌细胞CA125的诱导作用探讨
干扰素-α对卵巢癌细胞CA125的诱导作用探讨
首都医药 2000年第8期第7卷 基础研究
作者：周国平　刘光　张川敏　刘亮
单位：周国平　刘光　张川敏（北京军区总医院　100070）；刘亮（山西运城妇幼保健站　044600）
　　卵巢癌(Ovarian Cancer)发病率较高，占妇科肿瘤发病之首，恶性程度较高，大多数发现于晚期，5年生存率仅为30%左右。而CA125是与上皮细胞型卵巢癌相伴随的表面抗原，检测血清中CA125对卵巢癌病人的手术治疗范围、术后复发及用药等问题均有指导意义。本文利用干扰素-α(interferon IFN)对体外人工培养的两株卵巢细胞系SKOV3及3AO表达CA125进行诱导调节，检测其浓度变化。旨在探讨IFN-α对卵巢癌可能的治疗作用。
　　1　材料和方法
　　1.1　细胞系和细胞培养：卵巢癌细胞系SKOV3及3AO(购自军事医学科学院)，培养于含10%新生小牛血清(FCS，经56℃30分钟水浴灭活)RPMI-1640(GIBCO产品)中，其中加有Hepes、青霉素及链霉素，37℃、5%CO2、饱和湿度下CO2孵箱中培养。
　　1.2　IFN-α诱导实验：取呈指数生长的SKOV3及3AO细胞分别用D-Hanks液洗3次，以0.25%胰酶与0.02%EDTA-Na21∶1混合液，37℃消化3～5分钟，用Hanks液轻轻洗2次；然后用不含FCS的RPMI-1640培养液制成细胞悬液(1×103个细胞/ml)，24孔培养板中每孔加入300个细胞悬液。上述条件下培养24小时后吸出培养液，每孔加入含不同浓度IFN-α(浓度分别为10、100、U/ml)的无血清培养液400μl，每种细胞每个浓度分别加3个孔；对照孔为不含IFN-α的等量培养液，上述条件下培养48小时。
　　1.3　CA125含量检测：收集上清培养液；用ACS，180SE全自动化学发光免疫分析仪(美国康仁公司)检测其CA125含量。每组3个样本，取均值(X)±标准差(S)绘制“浓度-效应曲线”图。
　　1.4　统计学处理：用CASIO，fx-82sx计算器进入统计学状态进行计算。数据结果以均值±标准差(±s)表示，采用双样本t检验分析处理，当P＜0.05为差异显著，当P＞0.05为无显著差异。
　　2　结果
　　在IFN-α诱导下，SKOV3和3AO的表达量均发生变化，即IFN-α对SKOV3，3AO细胞表达CA125蛋白抗原有显著的诱导降低作用，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
　　当IFN-α浓度在1000U/ml时CA125表达量***(见图)，从图中可以看出CA125的表达水平与IFN-α的剂量有一定依赖有关。但当IFN-α浓度增加到10000U/ml时，对CA125蛋白抗原的诱导降低作用并没增加或增加极少。
图1　干扰素诱导CA125变化的浓度-效应曲线
　　3　讨论
　　CA125是一种高分子糖蛋白，主要在癌变的卵巢上皮细胞膜上表达，并可释放到细胞间质中，其诊断敏感度最高可达90.2%，在手术前，对有骨盆肿块者，CA125检测可使诊断的正确率达80%左右。也有报导，CA125的水平可区分良性和恶性疾病，在良性疾病中，80%的患者CA125＜65U/ml，而75%的恶性疾病患者CA125浓度＞65U/ml。血清CA125持续性增高与进行性恶性疾病和治疗效果不佳也有关，当血清CA125值≤35U/ml，癌灶多很小，手术可将此极小的病灶完全切除净，再辅助化疗，存活期可能延长；而血清CA125＞35U/ml时，其复发癌灶常较大或较多，不易切净或是化疗已产生耐药。故手术后生存率比前者明显降低。血清CA125阳性预测值可为100%，阴性预测值为65%左右。本文实验结果显示IFN-α能下调SKOV3和3AO细胞CA125抗原蛋白的表达水平，当IFN-α浓度在1000U/ml时，对CA125蛋白抗原的诱导降低。但IFN-α对卵巢癌是否有确切的治疗作用和临床意义仍尚待商榷。
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···············肿瘤坏死因子-α的相关知识（3）
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