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对PCR产物加A尾
我用的是高保真酶，PCR产物为平滑末端，如何用Taq酶对PCR产物加A尾？望说得详细一点。谢谢
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【求助】PCR双酶切讨论
如果是PCR产物进行双酶切，有哪些因素会影响酶切效果？有没有什么方法判断是否酶切开了？我进行克隆时，总是出现假阳性，或者就干脆平板上长一颗两颗或没有，挑出来有质粒但是双酶切鉴定时没有目的片段。郁闷！后用20小时对PCR产物进行双酶切，结果却克隆出来了，然而，再以同样的方法做另外的克隆时却没有做出来！请求指教，谢谢！没有人回答这个问题难道无法解决吗?PCR产物酶切好象没办法判断吧，因为酶切下来的只有一点东西。要想酶切好，就先对PCR产物进行纯化，把PCR反应体系的东西去掉。然后酶切体系不要太小，20-30ul是需要的。胶回收时，电泳速度要慢，时间要长。大概就可以了。PCR产物酶切前后都已经过了纯化，酶切体系也没有问题。但是只有克隆完成后才可以知道是否酶切完全，而且克隆成功与否是与许多因素相干的，也就是说目前为止没有什么方法可以确保PCR酶切是否已经切开喽。如jessicachen所说，先进行纯化然后酶切，另外酶切的时间要比质粒酶切长一些，可以过夜切，然后对酶切体系进行酶灭活就可以了。PCR产物酶切电泳是不好判断。但楼主可以先将PCR产物与T载体连接，转化。然后鉴定看有没有与T载体连接上。如果连接上了的话，就可以抽提这个重组质粒，然后酶切，会出现两条带。跟你目的片断一样大的那条带就是你要的目的片断，这样就可以直接拿去连接了，呵呵谢谢各位的回复和建议！但是有个问题：PCR如果用高保真的PFU酶的话，是无法加上POLY（A）尾的，如果用TAQ酶的话，变异的可能性比较大，会影响到后续的表达分析，因此用T载体是否适合？个人觉得有几点需要注意: 1.
PCR产物进行双酶切,说明你在PCR引物中加入了酶切位点,所以酶切位点后的保护碱基是否恰当,比如保护碱基数目等.因为不同酶切位点后面需要加入的保护碱基是不同的,这直接影响酶切效率.2.
你的PCR产物进行了纯化,那你在纯化过程中是否有乙醇残留(如果是试剂盒的话漂洗液中一般也含有乙醇),如果纯化过程乙醇没有除尽,那直接会影响你后续的酶促反应,肯定影响切割效率3.
用 Pfu酶扩增后的产物可通过加A反应使其末端加A,这样就可以进行T-A克隆了最后祝你好运!TO 游来游去 ：用KIT纯化PCR产物最后一步是用水溶，而且我经过了3遍的水洗，我想应该不会有乙醇残留了吧。另外，我想请教：1，PFU扩增后怎么加A尾？效果如何？2，引物设计具体操作步骤是什么样的？（因为我从来没有自己设计过引物，还只是菜鸟呵呵。）谢谢！加A体系：加入回收的PCR产物1~7微升，Taq酶buffer 1微升Taq酶1微升dATP至终浓度0.2mM补水至10微升放入pcr仪，70度，30min就可以了。这个反应是利用Taq酶的末端转移酶活性，因为不是Taq酶的主要活性，所以酶量要比pcr反应来的高得多。至于Taq酶，我试过1块钱20微升的烂酶，都毫无问题。祝你成功。TO griffin_zhou：谢谢你的指教！受用。另外，我还是请求哪位高人帮忙解答一下：引物设计具体操作步骤是什么样的？（因为我从来没有自己设计过引物，还只是菜鸟呵呵。）谢谢！liaoli1115 wrote:另外，我还是请求哪位高人帮忙解答一下：引物设计具体操作步骤是什么样的？（因为我从来没有自己设计过引物，还只是菜鸟呵呵。）谢谢！在论坛搜索！liaoli1115 wrote:如果是PCR产物进行双酶切，有没有什么方法判断是否酶切开了？我觉得如果不想通过上面有人说的连接T载体再酶切的话，可以像以下这样做来验证双酶切是否成功，我也是这么做的：1）确保PCR产物的酶切位点有保护碱基2）拿具有同样两个酶切位点的空质粒载体做试验，设三管，
一种酶一管，第三管双酶切，三管缓冲体系一样。如果三管都能得到线性载体的话，说明这个双酶切应该是没问题的。（当然这需要另外提取这种验证载体，我常常备有这样的载体，所以做起来方便）TO BOCON：TO BOCON：我没有明白你这样做是为了验证质粒载体是否双酶切开，还是PCR产物是否双酶切开？好象你是在验证质粒载体是否双酶切开吧？
但我想知道的是PCR产物是否双酶切完全。这对后面的连接以及克隆成功与否非常关键。我曾经花了半年的时间想将PCR的片段双酶切后与质粒连接都无果，后将PCR
连到T 载体后再连载体，很快就连上了，期间我还摸过时间梯度，为了保证酶切完全，可是还是无果，连上后测序突变了三次，后用PFU酶扩后，100ul的体系结束后直接加了0.3UL的EX TAQ 酶，72度10分钟加A尾，再回收后T 连接，筛到阳性后测序，结果很好，建议可以试试我的这个笨方法啊～哦谢谢你提供的方法和思路。我用50微升的双酶切体系对PCR产物酶切时，摸索时间由原来的4小时切到20小时，结果20小时的酶切后，有时能做出来有时却做不出来，而以同样的方法再重复一遍时却有的又可以做出来，真的好象抽奖一样，是概率问题。似乎一点也不稳定，全靠运气。To chenjun2005:你的方法很好啊！这样在加A尾的过程中是否就不需要再额外加dATP了呢？1、PCR产物酶切效率肯定比T连后的酶切效率低。主要是酶的位点识别问题，DNA的二级结构使处于两端的酶切位点序列处于隐蔽状态。2、酶切产物最好用10Xloading buffer上样跑胶，不要用6Xloading buffer,以避免内切酶占位，影响连接。3、T载体是克隆试验中很好的工具，利用的好能节约很多事。4、probest酶的保真性好，但效率不理想，而且因为具有外切酶活性，产物T连前要加A,其实LA taq酶保真性也不错，但效率不是probest酶可比的。呵呵，还需要多多学习。我也正在学习rt-pcr，我做的克隆都是双酶切连接的，其实也不难。可能有几点注意：1. 注意添加保护碱基，可以参照NEB手册，不要图省钱，还是按里面需要的碱基数加上；2. 纯化：我都是柱纯化（或玻璃奶）的，效果也很好，不一定非得切胶，节省时间，而且保护自己（呵呵，切胶很烦）；3. 双酶切： 要加入足量的酶，我一般是加入等量的两种酶，总体积不超1/10，主要是防止甘油&5％，同时酶又是足量的，1－3小时足矣；4. 还是柱纯化，呵呵；5. 连接：注意按分子克隆的操作步骤做，尤其是先45度水浴，置冰上，再连接。同时做好对照，可以了解双酶切和连接的效果，如：(1) plasmid(2) plasmid + ligase(3) pcr + plasmid + ligase等To:smartkevin"45度水浴，置冰上，再连接"为什么 ,有什么好处?
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【求助】从PCR—加A—与T载体连接，这几步中究竟哪些步骤产物是需要纯化的？
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这个帖子发布于9年零123天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是用Takara的primestar扩增，然后用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，再用Taq酶和dNTP做72度30min加A反应，反应完成后未经纯化回收，直接取3微升与Promega的T载体连接4度过夜，转化后只长出10个左右的蓝斑和2个白斑，2个白斑经鉴定没有插入片段是空载体。原因何在呢？
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这里面有几个问题:1,不知道你是否做过加A的效率是否足够高.一般应该可以,可能的话(片段不长不需要很高保真)请再用一般的Taq酶做一次PCR,那样就很肯定加A了2,反应后未经纯化回收:这个建议要纯化回收,因为该体系中含有Taq和A,混到连接体系中,A会把T载体的末端补平了,哪里还能做T连接?而且一般的Taq还有5'-3'外切的功能,会降低连接效率...3,一般的克隆关键步骤在于连接,但连接的前提是混合物都要纯,而连接缓冲液要新鲜,长期反复冻融的效率可能已下降...一般涉及酶的操作都要在低温进行,动作要快,尽量避免酶活下降...
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bonnenuit 我是用Takara的primestar扩增，然后用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，再用Taq酶和dNTP做72度30min加A反应，反应完成后未经纯化回收，直接取3微升与Promega的T载体连接4度过夜，转化后只长出10个左右的蓝斑和2个白斑，2个白斑经鉴定没有插入片段是空载体。原因何在呢？高保真酶扩出的PCR产物，经胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，再用Taq酶加A,其体系如下：Taq 酶
0.5ul10XBuffer
0.5ul回收产物
8ul再做72度20min进行加A反应，完成后不纯化，直接与T载体连接！转化后的菌落与平时的差不多！我们实验室一直都是这样做的！楼主没成功的原因可能是没加Taq酶Buffer吧！呵呵，祝你实验成功！
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谢谢楼上的二位！请问Bentz：我做连接反应是在4度，这么低的温度下taq酶也会把A加到T载体上吗？我不想回收的原因是PCR产物已经经过一次回收浓度下降了，再回收一次损失会比较大。回复Jgc95：我做加A用的是天根的taq酶和加A反应液，肯定不是忘加buffer的情况。谢谢你，我再试试。
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在4度可能Taq酶加A的效率很低.但你不能排除它不能加A的可能性啊,而且你操作的时候是在常温操作的吧,一般用A的浓度都较高吧,那已经可以反应了.连接酶能在4度连接,为什么taq不能加区区一个A呢?按你说我们做T克隆时,PCR产物不用纯化,直接跟载体连接应该也行了,但实际上这个效率奇低.这都是可能,如果实验结果成功了,说明这个影响不大,但如果结果不好,这可能请考虑进去吧.PCR做多几管,其实PCR产物量是很大的两次回收应还足够做连接.祝好运啊.
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加A后建议割胶回收（这可以排除很多不确定因素），和T载体在16度连接2h即可用于转化感受态！
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求助各位大侠，回收后检测，目的条带很亮，为什么每次加完A以后再检查条带就弱到看不见了？加A用的是如下体系：产物3微升，dNTP4微升，buffer1微升，taq酶1微升，dd水1微升，共10微升，然后在72°下保温15分钟。已经做了两次了都是这样，我觉得就算加不上也不应该影响条带亮度啊，下面的实验接不上了，愁死我了，各位大侠帮帮忙啊！
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如果用的是EASY TAQ酶的花，不是可以自动在末端加A么？
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直接用TAQ 酶 就不用另外加A& &实验室一直用
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宝生物有高保真Taq酶
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生物秀探花
现在的Taq酶扩增出来末端都会有A的
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正常啊 你的PCR产物在这个操作过程中已经被稀释了啊~~
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通常不用特别地加A。
提到的问题：
1）调节检测量重新检测
2）沉淀后恢复浓度检测
签到天数: 1 天[LV.1]初来乍到
你有pcr产物量太少了，我通常做的是20或者10ul的体系
72度25分钟
签到天数: 1 天[LV.1]初来乍到
连接不上，主要可能是产物浓度太低了
该用户从未签到
gotoprinceton
& & 用的是高保真酶，fermentas的pfu，要连接t载体的话必须要加A 啊
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