 上传我的文档
 下载
 收藏
该文档贡献者很忙，什么也没留下。
 下载此文档
正在努力加载中...
德式乳杆菌保加利亚亚种分解代谢控制蛋白CcpA基因敲除突变株的构建
下载积分：954
内容提示：德式乳杆菌保加利亚亚种分解代谢控制蛋白CcpA基因敲除突变株的构建
文档格式：PDF|
浏览次数：1|
上传日期： 22:26:49|
文档星级：
该用户还上传了这些文档
德式乳杆菌保加利亚亚种分解代谢控制蛋白CcpA基因敲除
官方公共微信君，已阅读到文档的结尾了呢~~
[精品论文]
肠癌细胞中pten基因缺失对姜黄素类药物的敏感性研究
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
[精品论文]
肠癌细胞中pten基因缺失对姜黄素类药物的敏感性研究
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer--144.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口吉锐产品技术服务资源共享
CRISPR您的位置：
【阳性克隆筛选】Cruiser(TM)酶切筛选阳性克隆→阳性克隆测序！
作者：Genloci&&&&浏览：462&&&&发布时间： 14:29:38
■有限稀释法挑单细胞克隆1.收集适应性培养基：培养同源细胞(未克隆前时的同一细胞株) 至半汇合状态，更换一次培养液，再培养 24 hr；吸出所有培养液，以 3000r/min 离心；再经直径 0.122 μm 滤孔的滤膜过滤；2.应用液：取一份适应性培养基加 2 份培养液；3.取一瓶处于对数生长期的细胞,按常规消化、离心、计数；4. 稀释：将细胞稀释成每 100 μL 约含 50 个细胞,打匀；5.点种：用 20 μL 移液枪吸取细胞悬液先点几个孔,每孔约 2 μL ，其液滴如芝麻大小，然后在倒置显微镜下观察，如每孔 1～2 个细胞，说明细胞浓度合适，则可一次点完 96 孔板。若不然，则可使液滴增大或缩小，或者再加细胞，或者再加培养液稀释；6.记录：在倒置显微镜下观察 96 孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养液 200 μL，置二氧化碳培养箱培养。如果需要吉锐生物研发部的有限稀释经典 protocol，可以联系吉锐生物的技术支持。■敲除后阳性克隆的筛选为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化：1、尽可能提高单细胞的存活率。a)对于单个细胞很难存活的细胞，如果是贴壁细胞，可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂；而对于悬浮细胞，则推荐采用 Cell Plaza(TM)（共培养的原理），都可以极大的提高细胞的存活率；b)对于很容易老化的细胞，推荐对细胞进行永生化改造，永生化的方法有很多，这里不做具体推荐。2、采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒。这样的试剂盒，市面上也比较多，但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒，建议选择 QIAGEN 或者 Genloci 的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN 是老品牌，Genloci 这家公司是主要做基因重组的，所以，他们开发的一些产品针对性比较强，而且价格便宜，建议优先使用。3、设计合理的引物和选用高保真的 Taq 酶；引物设计推荐选择靠近靶位点上游 100 bp 和下游 200 bp 处，或者上游 200 bp 和下游 100 bp 处，这样的好处是后面进行酶切分析的时候，对于阳性的克隆，可以很容易观察到 2 条分开的条带。Taq 酶，建议是用 NEB 的 Phusion 或者 Q5，毕竟敲除本身很大可能也就是 2-3 个碱基的缺失，所以，高保真是必要的，防止产生假阳性的结果。4、选择高特异性的错配酶；目前用的比较多的是 CEL I 和 T7E I 两种酶，CEL I 是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。目前市面上只有 Surveyor 和 Cruiser(TM) 两个品牌。其中 Surveyor 是进口代理产品， 价格较贵，货期较长；Cruiser(TM) 比较便宜些，同时货期短，国内可以 2-3 天内到货。T7E1 是 NEB 的产品，最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是切割特异性比较差。5、选择服务好的测序公司测序公司往往是比较容易忽略的一个环节，很多人送测序后，拿到的测序结果经常发现没信号，就认为是自己的样品有问题，而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式，测序是苦力活，人员流动比较大，所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好，实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以，一定要找一些资质比较好的测序公司，同时，发现问题的时，可以考虑换一家公司再测一遍。■&Cruiser(TM)筛选阳性克隆流程■实验步骤将靶细胞有限稀释后，分到 96 孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用 Cell Plaza(TM) (Cat.No.:GP5036) 培养细胞，待细胞长好后，取 1000 个左右的细胞，提基因组，推荐使用 Genloci TNA 抽提试剂盒 (Cat.No.: GP0155，GP0156)。然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用 Genloci Cruiser(TM) 基因敲除检测试剂盒 (Cat.Nos.: GP0102, GP0103)。■实验结果■敲除序列分析对 Cruiser 筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。您所在位置： &
&nbsp&&nbsp&nbsp&&nbsp
兽疫链球菌基因敲除系统的建立及hasE功能研究.pdf79页
本文档一共被下载：
次 ,您可全文免费在线阅读后下载本文档。
文档加载中...广告还剩秒
需要金币：200 &&
兽疫链球菌基因敲除系统的建立及hasE功能研究
你可能关注的文档：
··········
··········
分类号：Q933 学校代码：10057 密级：公开 研究生学号： 兽疫链球菌基因敲除系统的建立及base功能研究 ofaGeneDeletionfor Development SystemStreptococcus ofbasEGene andFunctionalCharacterization zooepidemicus 专业名称：发酵工程 指导教师姓名：刘浩教授 研究生姓名：孙晓燕 申请学位级别：工学硕士 论文提交日期：2014年5月 论文课题来源：科技部国际合作项目 学位授予单位：天津科技大学
万方数据 天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的 成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体己经发 表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：椿碣国． 日期：勘IV-年b月fD日 知识产权和专利权保护声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持 下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属天津科技大学； 所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后， 以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技 大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：劭如魂瓢 日期：
厶fV年‘月J口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，同意公布论文的全部或部分内容， 允许论
正在加载中，请稍后...君，已阅读到文档的结尾了呢~~
嗜酸性喜温硫杆菌中硫氰酸酶的性质鉴定和基因敲除,基因敲除,基因敲除技术,基因敲除步骤,基因敲除原理,条件性基因3ab4敲除,条件基因敲除,基因敲除小鼠,apoe基因敲除小鼠,诱导性基因敲除
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
嗜酸性喜温硫杆菌中硫氰酸酶的性质鉴定和基因敲除
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口}