用清洁剂和酒精提取DNA的原理是什么？_高中生物吧_百度贴吧
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用清洁剂和酒精提取DNA的原理是什么？收藏
书上写：将切碎的材料加入少许食盐和温水，研磨，过滤。加清洁剂，轻摇（不要出泡），再注入外用酒精，静置5分钟，液表絮状物就是DNA粗提取物。为什么？
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洗涤剂是溶解细胞膜。冷酒精析出DNA
= =能不能问一下~~依怎么消失了？
能详细点么？谢谢～
消失了吗只是彻底伤心罢了
= =谁又惹你了？？感觉这两天很平静啊
不小心瞅到了某人的话上次那位反正不会有第三次了
你无视了啊！！！！！！！跟他你计较什么？？？？？我晕~~~~~~~~
……一只咬人的狗而已，不必和他计较的
有机物酶溶解
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【交流】有关小鼠组织基因组DNA抽提方面的问题及其解决方案（080701更新）&[精华]
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这个帖子发布于8年零296天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人做小鼠基因组DNA抽提已经很长时间了，实验目的是做DNA Ladder，所以完全溶解和很纯的DNA是实验成功与否的关键，总体来说，实验多次是成功的，但有时也出现一些预想不到的结果，现把该试验中出现的一些问题整理出来，与各位老师和同学进行交流，欢迎大家多提建议，谢谢。望大家不吝赐教！1、组织DNA抽提的实验原理是什么？2、有时氯仿萃取DNA离心后有的管内析出上清很少，什么原因和如何解决？3、为什么氯仿萃取时不能摇得太剧烈和摇到什么程度即可以停止？4、上清与预备液（precipitation solution）的最佳比例是多少？有时颠倒混合液数次后，发现析出的DNA不多时，再继续加上清，未能更进一步析出絮状物，什么原因？5、RNase一般孵育温度和时间最佳是多少，以便彻底地消除RNA而不影响DNA产量？6、冰乙醇与DNA样品的最佳比例是多少？摇到什么程度可以停止？7、乙醇清洗最后一次离心条件多少为佳？一般干燥多长时间为好？8、DNA含量与吸光值之间换算的公式是什么？测定DNA时要注意什么？9、DNA难以溶解（有时表现为拉丝）的原因是什么？10、DNA杂质污染的种类及其解决方法是什么？
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wh2008 edited on
为了针对问题进一步的探讨解决方案，我把我的操作指南发上来，以便于大家进行交流和讨论：一、
原理与意义先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（无需用酚抽提）、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、G+/G－细菌中快速抽提基因组DNA。抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验，如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、Southern Blot分析等。二、
试剂及其配制抽提试剂盒购于上海生工公司，内含以下试剂：1.
TE缓冲液：PH8.0，由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。2.
RNase A（3 mg）：使用前加入300 ul无菌双蒸水，煮沸10 min后使其自然冷却后使用，-20 ℃冻存。3.
Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 ul无菌水，分装成小份，-20 ℃冻存。4.
Cell Lysis Solution与Precipitation Solution：溶液出现絮状沉淀50 ℃加热溶解后使用。5.
1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自备。三、
实验器材水浴锅、普通冰箱、1.5/2 ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。四、
操作步骤1.
组织匀浆制备：取30 mg左右新鲜组织，加600 ?l TE缓冲液，手工匀浆数次。2.
细胞裂解：吸取300 ul匀浆加600 ul Cell Lysis Solution，混匀。3.
消化蛋白：再加入9 ul Proteinase K(可适当增加)混匀，置于55 ℃水浴30 min以上（可达2.5 h），其间上下混匀几次。4.
氯仿抽提：加入600 ul氯仿（用户自备），轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。5.
沉淀：在台式离心机上，10000转/分，室温离心2 min。此时应分成三层，基因组DNA在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀（可通过延长离心时间或增加离心速度获得上清）。取500 ul上清液，置于无菌1.5 ml离心管中，加入500 ul Precipitation Solution，混匀多次至出现絮状物，室温静置2 min。10000转/分，离心2 min。6.
去除RNA：弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。7.
沉淀DNA：加入300 ul冰冷乙醇（终浓度为75％，沉淀效果最佳），－20 ℃放置10 min。10,000转/分，离心2 min。倒掉乙醇，倒置室温干燥10～15 min。若DNA量多，可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或100 ul三蒸水溶解。五、
注意事项1.
应避免多次冻融样品，因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率。2.
加氯仿充分混匀，若离心后上清不到500 ?l，可适当延长离心时间或增加离心速度。3.
吸取DNA上清时，可用剪刀稍剪枪头尖部，以防止虹吸现象。4.
操作步骤中许多数值可进行成比例改变，如上清与预备液按1:1，氯化钠与无水乙醇按1:3等。5.
转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA，他们可能与DNA一起被分离出来。RNA的存在并不影响PCR反应。如果需要制备RNA-free的基因组DNA。可在第6步加入200 ul的RNase A，37 ℃保温10 min即可。6.
用分光光度计测量DNA含量按1 OD260=50 mg基因组DNA；进行0.7%琼脂糖凝胶电泳判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。本试剂盒可抽提长抵达50kb以上的DNA。一般在DNA样品中，OD260/OD280比值大于1.8，可能存在RNA；OD260/OD280比值小于1.6，可能存在蛋白质或酚。但RNA样品中OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白质或酚，均需要进一步纯化。7.
通常50ul体系PCR反应中用1～5 ul DNA。参照：上海生工生物工程技术服务有限公司提供小鼠基因组抽提试剂盒说明书。
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wh2008 edited on
针对问题9、DNA难以溶解（有时表现为拉丝）的原因是什么？ 我的分析如下：（1）最后一步离心后弃乙醇后倒置干燥时间不宜过长，否则用TE或水难以溶解；（2）当A260/A280的比值低于1.8时，这可能提示DNA不纯，可能含有蛋白质等杂质，从而使DNA很难溶解。有人做了一个比较实验：用经典沉淀方法提了一次血液基因组 DNA，想看一看核酸沉淀步骤对蛋白质残留的影响。首先将一大管“去除”了蛋白质的上清等体积分到若干小管中，再在小管中加入不同的试剂沉淀核酸。洗涤干燥后，用 10mM Tris 溶解核酸，发现溶解速度不同，具体地：溶解越快的，其 A260/280　越接近1.8；溶解越慢的，其 A260/280　越小于 1.8，有的甚至过夜也有不溶物残留。由于我使用的方法没有用到苯酚，影响 A260/280　比值的可以认为只有蛋白质残留，同时，干燥时也没有过分，所以可以得出下面的结论：蛋白质的残留过大，可以导致基因组 DNA 难溶解。（3）蛋白质污染原因很多：组织量太多、蛋白酶消化不全、吸上清时吸到蛋白沉淀等等。
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针对问题1：组织DNA抽提的实验原理是什么？1、DNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。2、经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如GIT、GuHCl等) 裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是基因组DNA抽提的主流。3、常用纯化方法，一是PC抽提+醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。
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呵呵,写得真好,多谢!我们一直用的Axegen的试剂盒,用柱子提的,但得率太低,关键是我上次提完以后测260/280,数值很高,所以想换别的方法.觉得你的方法还挺好的.但是想问一下:Cell Lysis Solution与Precipitation Solution可以自己配么?如果是在生工买的话,是多少钱啊?
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写的的确不错,,支持!
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生工的这个试剂很差，用天根的吧，效果非常好，我对比过
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lengxueli 生工的这个试剂很差，用天根的吧，效果非常好，我对比过天根公司的试剂好在哪个方面，请说出客观的依据？否则无说服力。我一直用生工公司抽提试剂盒（已经用了3个吧）总的来说，也发了肝脏相关的3篇SCI文章（内含DNA LADDER）——JOURNAL OF HEPATOLOGY/TOXICOLOGY/A P S,但说实在的，实验结果有时也出现我在第一个帖子出现的情况，所以拿出来与大家进行讨论——重复性不是100%，望大家对各个厂家的试剂盒进行客观的评价，以利于初学者进行很好的选择。
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请问楼上是用的生工Classic kit ,该试剂盒可以提取的细胞或组织的最小用量是多少。
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哪位有使用Trizol提取基因组DNA的经验，请介绍一下，谢谢！
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wh2008您好！我在用天根的试剂盒提取肝组织基因组DNA，用的以前剩下的试剂盒，结果不好，最大的条带有些弥散，而且260/280只有1.07几，抽提了两次都差不多，怀疑是试剂放久了，乙醇有挥发。您认为呢？另外，因为条带弥散，是有DNA降解吗？在提取过程中要求带口罩帽子吗？提取的基因组DNA凝胶电泳应该是什么样的呢？有多条条带吗？我是将DNA溶在水中的，不知您一般要放多久能充分溶解DNA？温度？问题有些多，期待回复！谢谢！
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limeidxy1234 wh2008您好！我在用天根的试剂盒提取肝组织基因组DNA，用的以前剩下的试剂盒，结果不好，最大的条带有些弥散，而且260/280只有1.07几，抽提了两次都差不多，怀疑是试剂放久了，乙醇有挥发。您认为呢？另外，因为条带弥散，是有DNA降解吗？在提取过程中要求带口罩帽子吗？提取的基因组DNA凝胶电泳应该是什么样的呢？有多条条带吗？我是将DNA溶在水中的，不知您一般要放多久能充分溶解DNA？温度？问题有些多，期待回复！谢谢！我分析如下：1、条带发生弥散，有几种可能：有RNA残留、DNA发生降解、本身样品组织发生坏死（均匀性弥散条带）、阶梯式弥散（典型的凋亡条带）。2、DNA提取一般对无菌要求不高，我一般不戴口罩、帽子等；但RNA抽提过程中要戴口罩、帽子和手套等；3、DNA最好用TE缓冲液溶解，一般轻轻混匀，30 min左右即可完全溶解，还可放置37度。但如果DNA不纯（蛋白质残留或组织裂解不全）易出现难溶解，且拉丝状。
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我发表在Journal of hepatology上的图片，主要含肝脏组织凋亡条带和正常组织条带。
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针对以上大多数问题，我提供很全面的参考答案，望大家能多多交流。核酸抽提及其相关知识
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wh2008您好！今天用新的天根试剂盒重新抽提了组织基因组DNA，跑了0.5%TAE琼脂糖凝胶电泳，最上面是量一些，但还是有拖尾，如果的RNA残留的不会对后面的PCR和测序有什么影响吧（正是因为要测序，所以用水（PH7.0-8.5）溶的，测序公司都说TE会影响测序）。如果后面PCR扩增能扩出 我要的目的序列，是不是就可以不用管基因组DNA的条带问题了？我现在都是在56度消化2-3个小时，蛋白应该消化的可以了吧，最后DNA挺好溶的，不拔丝也不粘稠。今天测的260/280是1.444，虽然没达到1.8，但比以前好些了。看了您的图片，不知哪些是凋亡条带，D和F吗？凋亡条带是怎么回事啊？谢谢！
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这是我跑的图，左边是组织基因组DNA,右边是marker 15kb的
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wh2008您认为我这个是凋亡条带吗？看了您的“核酸抽提的基础知识”，很有用啊！非常感谢！
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上面那图实在是难为情，调了下再看看哈！
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从你的图片来看，你的DNA含量较低，可能丢失过多；而且marker条带怎么只看到1个带，一般至少5条带，是不是电泳也存在问题？
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我也准备提小鼠dna 谢谢 你的帖子很有用！ps：marker你们一般是用多大的？
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我也在做小鼠的DNA呢，不过不是用的试剂盒（觉得太浪费了）采用的经典的提法：DNA提取－－PK－－酚抽提－酚氯仿抽提－－氯仿抽提－－无水乙醇沉淀。用的是耳组织，但抽提完溶解后总是有一块粘粘的东西且溶解不了，最严重时在抽提过程中就有粘粘的拉丝现象是，有时都吸不动。可否告知一下解决方案。谢谢！！
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还想请问楼主，在你的帖子中提到“6.
去除RNA：弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。7.
沉淀DNA：加入300 ul冰冷乙醇（终浓度为75％，沉淀效果最佳），－20 ℃放置10 min。10,000转/分，离心2 min。倒掉乙醇，倒置室温干燥10～15 min。若DNA量多，可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或100 ul三蒸水溶解。”一般情况下都是加上冰预冷的无水乙醇沉淀）有时加点醋酸氨等助沉，然后溶解沉淀，溶解时加入RNA酶。想问楼主为什么采用先加盐和RNA酶再沉淀？
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去除RNA：弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。虽说是试剂盒说明书，但是我就是不明白，加rna酶有何用？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？rna酶起到的作用是降解，切割，最多把它切碎，但那还是rna啊？此步骤有何意义？？？？
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您好！看了 您发的帖子，获益菲浅，谢谢！想问一下，您小鼠基因组DNA用手工（非试剂盒）提过吗？用生工试剂盒每个样本得率多少呢？该试剂盒价格多少?再谢！
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请问有哪位同仁抽提过蜡块组织DNA没有，好像比新鲜组织难提多了，有的话请分享经验
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谢谢分享！
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这样的帖子就得顶！
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感谢分享，我下一个实验就要提小鼠的DNA，太有用了。
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帖子很好，很受用
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正在找呢 非常感谢
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很专业，关于原理写得灰常清楚，对即便用试剂盒的实验员，也很受用！
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最近正在提，实用。
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关于丁香园君，已阅读到文档的结尾了呢~~
DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分
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DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分
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3秒自动关闭窗口碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。）
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料, 架，枪头及盒、卫生纸。
微量(20&l,200&l,1000&l)， 台式高速，恒温振荡， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温锅，双蒸水器，冰箱，等。
易生物仪器库：
易生物试剂库：
三、试剂准备
1、 LB液体培养基：称取(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM -HCl(pH 8.0)，10mM (pH 8.0）。
配制方法：1M -HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M （pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% 。
配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。
配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
6. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
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