赵宇,陆应麟,乔群,杜芝燕,徐元基,戚可名,
安徽医科大学附属医院整形外科,中国协和医科大学整形外科医院,军事医学科学院基础医学研究所,
医药、卫生
目的 绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体转染人骨髓间充质于细胞(MSCs)及其表达情况。方法 pEGFP与逆转录病毒载体经过酶切、连接等构建重组的EGFP-逆转录病毒载体，转染PA317细胞，用G418筛选出抗性克隆，获病毒上清(滴度达到8．5×10^5cfu／ml)并感染人MSCs。流式细胞仪测定转染效率后加入成骨细胞分化培养夜(地塞米松(10^-7mol／L）、β-甘油磷酸钠(10mmol／L)、维生素C(50mg／L))，2周后观察转染细胞的分化情况。结果 48h后细胞转染效率为7％，G418筛选2周后约97％细胞出现抗性克隆，表达维持4周。基因转染细胞能够分化为成骨细胞。结论 重组EGFP逆转录病毒载体能转染MSCs，且不影响细胞的功能。文章快速检索
罗首鸣，冯媛媛，杨 攀，宋治远. hox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化[J]. 第三军医大学学报, ): 869-875
Luo Shouming, Feng Yuanyuan, Yang Pan, Song Zhiyuan. Expression profiles of HCN4 in canine mesenchymal stem cells after Shox2 transfection[J]. J Third Mil Med Univ, ): 869-875.
hox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化
宋治远&&&&
(400038 重庆，第三军医大学西南医院心血管内科，重庆市介入心脏病学研究所)
通信作者: 宋治远，电话：(023)，E-mail：
摘要：目的 探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2，Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,cMSCs)体外诱导分化的影响。 方法 分离培养犬骨髓间充质干细胞，用包装好的两种慢病毒载体pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP分别转染第3代cMSCs，收集转染阳性的cMSCs与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes，NRVMs)共培养。实验分4组：A组(RFP-cMSCs组)、B组(RFP-cMSCs+NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-cMSCs组)、D组(Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组)。共培养诱导分化5 d后，利用嘌呤霉素对cMSCs进行纯化，运用全细胞膜 片钳检测诱导出内向电流的动力学特征，运用实时荧光定量PCR、Western blot检测HCN4、Tbx3、Cx45/43、 Nkx2.5等标志性基因mRNA和蛋白的表达情况，并行免疫荧光检测。结果 Western blot及RT-PCR检测结果显示，D组细胞Shox2、HCN4、Tbx3、Cx45窦房结细胞特异性基因的表达较A、B、C组明显增高(P<0.05)，B组细胞Cx43及Nkx2.5较C、D组细胞明显增高(P<0.05)；免疫荧光结果显示，在Shox2基因调控作用下，cMSCs有HCN4通道生成；膜片钳检测结果显示，C、D组细胞产生了具有明显时间-电压依赖性的内向电流，且对细胞外Cs+敏感，符合起搏离子流If的动力学特征；而A、B组未检测出此电流。结论
经mShox2基因修饰的cMSCs通过体外诱导，产生了起搏离子流If并高表达窦房结标志性基因，成功向具有一定自主搏动能力的窦房结样细胞分化。
共培养&&&&
间充质干细&&&&
起搏离子流&&&&
Expression profiles of HCN4 in canine mesenchymal stem cells after Shox2 transfection
Luo Shouming,
Feng Yuanyuan,
Song Zhiyuan &&&&
(Department of Cardiovascular Diseases, Chongqing Institute of Interventional Cardiology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China)
Abstract:Objective To determine the effect of exogenous gene short stature homobox 2 (Shox2) on the differentiation of canine bone marrow mesenchymal (cMSCs) in vitro. Methods cMSCs were isolated by gradient centrifugation, and the cells at passage 3 were transfected with the lentiviral vector pLentis-mShox2-RFP and pLentis-RFP respectively. Then the cells were divided into 4 groups, that is, the cMSCs transfected with RFP (group A as control), the cMSCs transfected with RFP and co-cultured with rat ventricular myocytes (NRVMs, group B), the cMSCs transfected with mShox2-RFP (group C), and the cMSCs transfected with mShox2-RFP and co-cultured with NRVMs (group D). Patch-clamp technique were introduced to detect the If current characteristics, while qPCR, Western blotting and immunofluorescence assay were used respectively to test the mRNA and protein expression levels of HCN4, Tbx3, Cx45/43 and Nkx2.5, etc. Results
Western blotting and PCR results suggested that the expression of HCN4, Tbx3 and Cx45, mainly expressed in sinus node cells, were significantly higher in the group D than in the other groups (P<0.05). Meanwhile, the expression of Cx43 and Nkx2.5 was remarkably higher in the group B than the groups C and D (P<0.05). Besides, immunofluorescence assay suggested that Shox2 promoted the generation of HCN4 in the cMSCs. Furthermore, the patch-clamp test indicated that the cMSCs in the groups C and D displayed a hyperpolarization-activated inward current that was highly sensitive to Cs+ and showed obviously voltage and time dependences, which met the If current characteristics. But no such current was found in the cells from groups A and B. ConclusioncMSCs transfected with mShox2 generate If current and express highly the sinus-node-cell-like genes, which indicating that those cMSCs are successfully differentiated into sinus node-like cells with pacing function.
Key words:
mesenchymal stem cells&&&&
co-culture&&&&
funny current&&&&
超极化激活的环核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN)的基因亚型HCN4及其介导的起搏离子流(funny current，If)是窦房结细胞4期自动去极化形成的关键环节[]。但既往研究表明，一系列围绕HCN基因开展的重建生物起搏点的实验方法，都不可避免地在移植过程中出现了起搏功能退化或消失的现象[,,]。由此可见，仅仅重建If的离子通道无法形成持久有效的生物起搏点。而近年来发现的参与胚胎心脏早期发育的矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2，Shox2)能够显著抑制Nkx2.5并有效上调HCN4的表达，是调控胚胎心脏细胞向窦房结分化而不向工作心肌细胞分化的关键因素[]。因此，利用Shox2作为转录调控因子诱导多能干细胞向具有一定起搏功能的窦房结样细胞分化，是生物起搏研究的一种理想选择。本研究采用慢病毒转染技术，将目的基因Shox2整合进犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,cMSCs)的基因组中，再与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养诱导其向心脏起搏样细胞分化，以检测在Shox2基因的影响下cMSCs生理生化特点的改变，并深入探讨Shox2基因作为生物起搏靶基因的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验动物
出生1～3 d的SPF级SD乳大鼠 20只(体质量50~60 g)，健康成年犬1只(体质量10~14 kg)，雌雄不限，由第三军医大学实验动物中心提供。
1.2 主要仪器和试剂
胎牛血清(美国Gibco公司)；α-MEM培养基、胰酶(美国HyClone公司)；PCR试剂盒 (日本TOYOBO公司)；兔抗小鼠Shox2多克隆抗体、兔抗犬HCN4多克隆抗体、兔抗犬Nkx2.5多克隆抗体(英国Abcam公司)；兔抗犬缝隙连接蛋白43(Cx43)、45(Cx45)多克隆抗体、兔抗犬Tbx3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；荧光倒置显微镜 (日本Olympus公司)；Zeiss LSM710激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)；Axonpatch
200B膜片钳放大器、Digidata 1440 AD/DA转换器(美国Axon公司)
1.3 实验方法
1.3.1 犬骨髓间充质干细胞分离纯化抽取健康成年犬骨髓，参照文献[]采用密度梯度离心法结合贴壁法分离出cMSCs，隔天换液培养并传代，选取生长旺盛的第3代细胞备用。
1.3.2 慢病毒载体构建根据NCBI小鼠Shox2 mRNA序列构建包装慢病毒载体pLentis-mShox2-红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)及pLentis-RFP，载体内携带嘌呤霉素抗药基因用于后续实验中细胞纯化。简述如下：使用全基因合成法获得小鼠Shox2的编码区DNA序列。用BamHⅠ和EcoRⅠ对mShox2合成序列和慢病毒载体pLentis-CMV-RTP-SFFV进行酶切，回收酶切产物，然后用T4 DNA连接酶连接载体和mShox2的编码区片段，连接产物转化感受态细菌，挑取长出的克隆，培养并提取质粒，然后将质粒进行酶切以及测序鉴定，确定构建正确的克隆(pLentis-CMV-RTP-SFFV-Shox2)用于后继实验。使用磷酸钙转染法转染293T细胞包装慢病毒颗粒，收集的病毒用于后面的细胞转染。
1.3.3 慢病毒感染cMSCs取对数生长期的第3代cMSCs分为4组：A组(RFP-cMSCs组)、B组(RFP-cMSCs +NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-cMSCs组)、D组(Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组)。将细胞接种于6孔板，
1.0×105/孔，在37 ℃、5% CO2孵箱内过夜，直至细胞达到60%融合后换液，按照MOI=20将所需病毒分别加入培养液中，每孔液体量为1 mL，摇匀使病毒液与细胞充分接触，孵箱内培养24 h后弃去病毒液并换液，72 h后荧光显微镜下观察其转染效率。
1.3.4 乳鼠心肌细胞共培养取新生1～3 d的SD乳大鼠，低温无菌条件下取出心脏，置于提前4 ℃预冷的D-Hanks液中，反复冲洗3次后，眼科剪剪成1～2 mm3体积的碎块，加入0.1%Ⅱ型胶原酶在37 ℃水浴锅中消化5 min，弃去上清后再次加入胶原酶进行分次消化，20 min/次，收集每次消化后的上清液，按1 ∶1 比例加入α-MEM完全培养基终止，经200目筛网过滤成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量培养基差速贴壁30 min，收集上清计数后接种于100 mm培养皿中。37 ℃、5% CO2培养24 h后，将转染阳性的cMSCs按照cMSCs：乳鼠心肌细胞1 ∶4的比例加入到培养皿中进行共培养，5 d后予5 μg/mL嘌呤霉素加压筛选72 h，PBS冲洗3次，收集存活贴壁的Shox2-RFP-cMSCs或RFP-cMSCs进行检测[]。
1.3.5 定量RT-PCR分析TRIzol提取筛选后细胞内的总RNA，使用荧光定量逆转录盒转录为cDNA，按照SYBR法实时荧光定量PCR试剂盒及Agilent公司Stratagene Mx3000P实时荧光定量PCR仪的使用说明书进行实验操作[]。使用引物见表 1。
表 1 各基因的引物序列片段及长度
基因引物序列扩增片段(bp)
mShox2上游 5′-ACTATCCAGACGCTTTCATGCG-3′下游 5′-TTCGATTTTGAAACCAAACCTGTAC-3′192
cNkx2.5上游 5′-CCGAGCCTGGTAGGAAAGGG-3′下游 5′-AAATCCAAGGGACGTGGAGACA-3′120
cTbx3上游 5′-GTAAGATGTTCTGGGCTGGATAAA-3′下游 5′- GTAGCAGGGCTGTCTGGGTG-3′167
cHCN4上游 5′-AGGGCACCATCGGCAAGA-3′下游 5′-CCACGCTCAGCGAATACAGG-3′186
cCx45上游 5′-CAGCAGACTTCCTTGCCCTCATA-3′下游 5′-CTTAGCATTGGACAGTTCGGTGT-3′298
cCx43上游 5′-TGCTATGACAAATCCTTCCCAATC-3′下游 5′-GCCGTGCTCTTCAATTCCATACTT-3′237
cGAPDH上游 5′-GAGATCCCGCCAACATCAAA-3′下游 5′-GGCATCAGCAGAAGGAGCAG-3′146
1.3.6 Western blot检测用RIPA裂解液提取cMSCs的总蛋白，BCA试剂盒测蛋白浓度，
接着行SDS-PAGE电泳，上样30 μg/孔，电泳后转移至PVDF膜上，5%牛血清蛋白室温封闭1 h后加入一抗(兔源Shox2、HCN4、Nkx2.5、Tbx3、Cx43、Cx45和GAPDH)4 ℃ 摇床孵育过夜，二抗孵育1 h。
1.3.7 免疫荧光检测将cMSCs制成细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定15 min，用含0.2% Triton X-100和0.3% H2O2的甲醇溶液封闭15 min，山羊血清封闭15 min后加入一抗(兔源Shox2、HCN4、Nkx2.5、Cx30、Cx45)4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h，抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜检查。
1.3.8 全细胞膜片钳检测将共培养后的MSCs放入灌流槽，灌流细胞外液，电极现拉现用，充灌电极内液后阻抗为4～6 MΩ，室温控制在(25±1)℃，应用Clampex程序采样，电压钳方式进行电流记录，钳制电位-30 mV，给予幅值-40 mV到-160 mV的超极化脉冲，步阶为10 mV，最后回归到+20 mV，在+20 mV处测量尾电流。封接破膜后形成全细胞记录模式，所有记录数据应用pCLAMP10.1软件进行处理，并用Boltzmanne方程Itail/Imax=A/{1.0 +exp[(V-V1/2)/k]}拟合If电流的激活曲线，并求算出半激活电压(V1/2)及曲线的斜率(k)。
1.4 统计学分析
应用SPSS 18.0统计软件，数据用x ±s表示。组间比较采用单因素方差分析。
cMSCs的形态学观察和慢病毒转染MSCs的效率
cMSCs传代至P3时，已基本纯化，呈均匀的长梭形或多边形，折光性好。慢病毒转染(MOI=20)72 h后，4组cMSCs转染效率可以达到(85.0±4.5)%(n=5)，慢病毒转染能力较好。细胞形态及生长活性未见明显改变。
2.2 转染阳性细胞诱导后相关基因mRNA的表达
Shox2基因转染成功，Shox2-RFP-cMSCs组及Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs共培养组均过表达Shox2。Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs共培养组细胞经过共培养诱导分化后心脏传导系统特异性基因HCN4、Cx45、Tbx3的表达较其他组明显增加(P<0.05)，而Nkx2.5及Cx43的表达较RFP-cMSCs +NRVMs共培养组明显减少(P<0.05，图 1)。
1：RFP-cMSCs组；2：RFP-cMSCs +NRVMs共培养组；3：Shox2-RFP-cMSCs组；4：Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组
A:Shox2基因；B:Tbx3基因；C：Cx45基因；D：HCN4基因；E：Cx43基因；F：Nkx2.5基因
a：P<0.05，与RFP-cMSCs组比较；b：P<0.05，与RFP-cMSCs +NRVMs共培养组比较；c：P<0.05，与Shox2-RFP-cMSCs组比较图 1 4组细胞相关基因的mRNA表达
2.3 转染阳性细胞诱导后相关蛋白的表达
Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组细胞相关蛋白HCN4、Cx45、Tbx3的表达均较RFP-cMSCs明显增加，工作心肌细胞相关的Nkx2.5及Cx43较RFP-cMSCs +NRVMs共培养组明显降低(图 2)。
1：RFP-cMSCs组；2：RFP-cMSCs +NRVMs共培养组； 3：Shox2-RFP-cMSCs组；4：Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs 共培养组图 2 Western blot检测4组细胞相关蛋白的表达
2.4 免疫荧光检测HCN4通道蛋白的表达
经激光共聚焦显微镜检测结果显示，Shox2-RFP- cMSCs组和Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组细胞均有HCN4通道蛋白的形成，且沿细胞膜表面均匀分布，而RFP-cMSCs组和RFP-cMSCs +NRVMs共培养组仅见RFP荧光表达，无HCN4蛋白形成(图 3)。
A~D：RFP-cMSCs组；E~H：RFP-cMSCs +NRVMs共培养组；I~L：Shox2-RFP-cMSCs组；M~P：Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组；A、E、I、M：DAPI；B、F、J、N：转染病毒携带的红色荧光；C、G、K、O：HCN4；D、H、L、P：融合图像图 3 4组细胞免疫荧光检测HCN4通道蛋白的表达
(激光共聚焦显微镜)
2.5 Shox2-cMSCs转染组细胞的通道电流测定
全细胞膜片钳结果显示，转染Shox2的Shox2-RFP-cMSCs组和Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组细胞均可以记录到超极化激活的内向电流，该电流具有明显的时间及电压依赖特性(图 4A)，且对Cs+ 敏感，当细胞外液中加入CsCl(4 mmol/L)阻断剂后，该内向电流被阻断，当细胞外液中的CsCl被洗脱后，内向电流又迅速恢复(图 4B、C)。根据记录到的尾电流重建该内向电流激活曲线(图 4F)和翻转电位(图 4D、E)，并进行计算，得到膜片钳实验数据(表 2)。而仅转染RFP的RFP-cMSCs组和RFP-cMSCs +NRVMs共培养组细胞，均未能记录到超极化激活的内向电流。
表 2 Shox2-RFP-cMSCs组和Shox2-RFP-cMSCs +NRVMs共培养组细胞膜片钳数据
组别检出率(%)电流幅值(pA，-140 mV)膜电容(pF)电流密度(pA/pF，-140 mV)半数最大激活电压(mV)斜率时间激活常数(ms)翻转电位(mV)
Shox2-RFP-cMSCs组15(3/20)-1 014.6±17.824.0±6.5-41.3±7.6 -92.3±6.2-16.7±1.7421.0±61.0-27.4±3.8
Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs共培养组76(19/25)-1 078.1±13.424.7±7.8-43.6±5.3-89.4±3.7-16.3±1.5415.3±58.0-28.9±6.7
A:Shox2-MSCs记录到的内向电流；B：CsCl阻断和洗脱；C：电流-电压关系；D：翻转电位；E:翻转电位求算曲线;F：If电流激活曲线
Shox2基因是近年发现的与胚胎心脏发育分化密切相关的转录调控因子。在胚胎心脏发育的过程中，Shox2基因在窦状角区域的特异性表达，能够显著抑制Nkx2.5。Shox2基因的无效突变或Nkx2.5在窦房结的异位表达，都将使窦房结区域的发育严重受损，HCN4和Tbx3的表达明显降低，心脏搏动频率减慢。而Shox2在右心房区域的异位表达，将导致窦房结区域的扩大[,,]。可以认为，Shox2基因的正常表达，是胚胎时期窦房结正常发育的关键保障。
在胚胎心脏发育的过程中，高表达Tbx3的区域最终会形成包括窦房结在内的心脏传导系统[,]；相反，转录调控因子Nkx2.5只局限于工作心肌区域表达，窦房结等传导系统表达阴性[]；而缝隙连接蛋白Cx43和Cx45的主要区别在于对电信号的传导性不同，Cx43具有较高的传导性，易受外来电信号影响，集中在工作心肌细胞中表达；Cx45的传导性较低，能形成较高的细胞内阻抗，主要在传导系统内表达[]。本研究选用的Tbx3、Cx43、Cx45等窦房结细胞标志物均具有较高的特异性，受到Shox2基因的调控，可以用来鉴别MSCs细胞的分化方向。
MSCs作为一种便于取材、易于分离培养，理想的组织修复种子细胞，具有稳定的自我更新能力和多向分化潜能，可在体内外不同诱导方法下(如化学试剂、电刺激微环境、心肌环境、组织工程等方法[,,,])分化为心肌细胞。但单纯地利用上述诱导方法，只能使MSCs分化成为工作心肌细胞，并不能生成具有自主搏动能力的起搏样细胞。因此，选用具有分化调控能力的Shox2基因来尝试促进MSCs向起搏样细胞分化，可以为探索生物起搏治疗提供一种新的思路。
本研究采用慢病毒载体将Shox2基因转染到cMSCs 的基因组中，目的就是利用Shox2基因的调控作用，在cMSCs与NRVMs共培养的诱导分化过程中，促进cMSCs向具有相对完整起搏功能的“窦房结样”细胞分化，而不是仅仅依靠HCN基因来重建If的离子通道。研究结果显示，仅仅将Shox2基因整合进MSCs的基因组中，并不能诱使MSCs完整有效地向起搏样细胞分化，只有在转染了Shox2基因的同时再通过一定的方法进行诱导，MSCs才能较好地形成具有明显的电压依赖性与时间依赖性的超极化激活的If并且高表达HCN4、Tbx3、Cx45等窦房结标志性基因。
综上所述，在心肌微环境的诱导条件下，携带外源基因Shox2的cMSCs通过表达HCN4基因产生了生物起搏离子流If，获得了一定的起搏功能，成功向窦房结样细胞分化。但关于其获得的起搏功能是否能在宿主体内维持，仍有待进一步体内实验验证。我们将继续利用能稳定表达Shox2的MSCs进行动物实验，验证利用Shox2基因重建生物起搏点的可行性。
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中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准，由第三军医大学主管、主办
罗首鸣，冯媛媛，杨 攀，宋治远
Luo Shouming, Feng Yuanyuan, Yang Pan, Song Zhiyuan
hox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化
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稳表达人HSP72的人脐带间充质干细胞株的构建
　[摘要]目的 构建含人HSP72的慢病毒，筛选获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。方法 采用PCR方法从MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA中调取HSP72基因的完整序列，利用双酶切及体外重组的方法获得pLV-HSP72-EGFP（2A）质粒，经PCR、测序方式鉴定成功后，对病毒进行包装。用病毒感染hUC-MSC，并用Puro进行抗性筛选可稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。结果 构建的pLV-HSP72-EGFP（2A）测序结果与GenBank收录序列一致，包装得到pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒，筛选获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系，ELISA方法检测显示获得的细胞株可过表达HSP72。结论 构建了获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。&
　　[关键词]HSP72；人脐带间充质干细胞；慢病毒载体；转染&
　　[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] （2016）09（b）-0004-05
　　[Abstract]Objective To construct Lenti-viral Vector carrying human HSP72 gene，and to screen the hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72.Methods The human HSP72 cDNA was amplified from &MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA& by PCR.pLV-HSP72-EGFP （2A） plasmid was obtained by double enzyme digestion and in vitro recombination，then was confirmed by PCR and DNA sequencing.The pLV-HSP72-EGFP （2A） virus was packaged.hUC-MSC was infected by the virus，and the hUC-MSC cell lines stably expressing HSP72 were screened by Puro.Results The recombinant pLV-HSP72-EGFP （2A） was constructed.The sequence was consistent with that reported in GenBank.The pLV-HSP72-EGFP （2A） virus was packaged and infected hUC-MSC.By ELISA，it was confirmed that the HSP72 protein could be expressed and secreted into the supernatant of hUC-MSC strain culture.Conclusion hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72 is constructed.&
　　[Key words]Heat shock protein 72；Human umbilical cord mesenchymal stem cell；Lenti-viral Vector；Transduction&
　　阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年痴呆中最常见的一种类型，其患病率随年龄增高而升高，在65岁以上人群中约为5%，85岁以上人群中约为20%[1]。有研究结果发现，分子伴侣的主要成分HSP72可以通过减少A&的聚集，促进A&的清除，减少tau蛋白的过度磷酸化，减少神经元的丢失，促进神经突触的可塑性等途径参与AD发病进展的多个环节，是防治AD的非常有价值的靶点之一[2]。基因治疗是近年来研究热度非常高的一种治疗策略，借助基因治疗，寻找一种稳定、长效脑内表达HSP72的给药方法和策略值得进一步探讨。本研究通过第三代慢病毒载体系统，将HSP72插入慢病毒载体，并选择具有神经细胞分化潜能、来源丰富、无学争议的人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）作为工具细胞，建立一种HSP72过度表达与hUC-MSC移植结合起来的治疗方法和策略，为进一步动物实验疗效评估和应用安全性评估奠定基础。&
　　1材料与方法&
　　1.1材料&
　　hUC-MSC是本实验室从健康新生儿脐带卡通式胶中分离纯化培养所得，DMEM培养基（Hyclone公司，SH30021），胎牛血清（Gibco公司，8180833）；CD105-PE、CD73-PE、CD90-PE（BD公司，65414），mouse IgG1-PE（BD公司，78454），CD45-FITC、CD34-FITC和HLA2DR-FITC（BD公司，89470）、mouse IgG1-FITC（BD公司，87592）和mouse IgG2a-FITC（BD公司，86738）；MSC成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞分化试剂盒（Cyagen公司分装）；MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA（Open biosystem，Thermofisher公司，2933），pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒载体（北京英茂盛业科技有限公司，VL3404），EcoRI限制性内切酶（Takara公司，D1040A），BamHI限制性内切酶（Takara公司，D1010A），T4DNA连接酶（Thermo公司，EL0011），DNA回收试剂盒（美基生物科技有限公司），KOD Plus DNA聚合酶（TOYOBO公司，201）、XL1-Blue MRF&感受态细胞（辉骏生物科技有限公司冻存），慢病毒转染试剂（辉骏生物科技有限公司分装）；HSP72 ELISA检测试剂盒（武汉新启迪生物科技有限公司，EIA05352）。　　1.2方法&
　　1.2.1 hUC-MSC的培养及鉴定 经产妇知情同意后，留取健康新生儿近脐端5～10 cm，小心剔除两条脐动脉，一条脐静脉，保留卡通式胶，剪碎至1 mm3，接种于培养瓶。待细胞自组织块爬出并融合至60%时，去除组织块继续培养，常规1∶2传代。取第三代hUC-MSC用荧光抗体标记和流式细胞仪检测的方法进行表面标志物的鉴定，并按说明书要求的步骤进行向骨、脂肪、软骨方向分化能力的诱导和鉴定。&
　　1.2.2 目的基因调取 以MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA为模板，设计两条引物，分别为序列5&-3&AT GAATTCATGGCCAAAGCCGCGGCGATC（含EcoRI酶切位点）和序列5&-3&AT GGATCC CTAATCCACCTCCTCAATGGTGGGG（含BamHI酶切位点），引物序列送广州辉骏生物科技有限公司合成，做PCR调取目标片段HSP72并纯化回收。&
　　1.2.3慢病毒载体的构建及包装 用EcoRI和BamHI酶切HSP72纯化产物和慢病毒表达载体，基因片段与载体做连接反应，获得pLV-HSP72-EGFP（2A），转化感受态细胞包装，挑取检测阳性的菌落摇菌，抽提质粒阳性克隆送测序验证。按慢病毒表达系统操作手册对构建的慢病毒载体进行包装，进行滴度测定，分装冻存。&
　　1.2.4慢病毒转染及稳表达细胞株的构建 第1天将hUC-MSC接种至6孔板中，常规培养基培养过夜，添加含pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒的细胞培养液（计算MOI值为200），感染6 h后，弃去含病毒的培养液，更换常规培养液继续培养，第4天传代后观察转染率可达50%～60%，第5天更换含0.5 &g/ml Puro的培养液继续进行抗性筛选，3 d换液一次，以未感染病毒的hUC-MSC做对照，筛选持续到第12天，此时对照组未感染病毒的hUC-MSC几乎全部死亡，可获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞株。&
　　1.2.5 HSP72蛋白表达 用ELISA的方法检测该细胞株培养上清液HSP72的过表达情况，实验方法依照说明书进行。以pLV-EGFP（2A） hUC-MSC和未感染病毒的hUC-MSC做对照。&
　　2结果&
　　2.1 hUC-MSC的获得和鉴定&
　　自第7天开始有hUC-MSC从组织块中爬出，细胞不断增殖并传代，细胞呈成纤维细胞样克隆性生长，培养至2周左右，细胞呈均一的纺锤形，呈旋涡状生长。流式细胞仪检测显示CD105、CD73、CD90阳性标志物表达量均&95%，而阴性标志物CD45、CD34和HLA2DR均&1%。提示hUC-MSC成骨、成软骨、成脂诱导分化后，均有阳性物质检出。&
　　2.2质粒的构建与鉴定&
　　经EcoRI和BamHI双酶切，在2000 bp&、1000 bp&处可获得两条预计条带，分别与1926 bp的HSP72和9549 bp的pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒载体相一致。基因片段与载体做连接反应，获得pLV-HSP72-EGFP（2A），转化感受态细胞包装，挑取检测阳性的菌落摇菌，抽提质粒阳性克隆送测序验证，分5段测序，拼接后与目的基因序列一致。&
　　2.3稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞株的获得&
　　感染第4天，可看到感染组绿色荧光表达，表达率为50%～60%，加入Puro进行抗性筛选后hUC-MSC对照组的细胞陆续坏死消融，pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC和pLV-EGFP（2A） hUC-MSC组未转染成功的细胞坏死，转染成功的细胞不断增殖，荧光显微镜下显示绿色荧光表达量逐渐增多，筛选至12 d停止抗性筛选，收集细胞冻存备用（图4）。&
　　取pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC、pLV-EGFP（2A） hUC-MSC和hUC-MSC对照组培养液上清进行ELISA检测，结果显示pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC细胞上清中的HSP72浓度为（14.14&1.76）pg/ml，明显高于pLV-EGFP（2A） hUC-MSC对照组和hUC-MSC对照组（P&0.05），而pLV-EGFP（2A） hUC-MSC和hUC-MSC两组表达量比较，差异无统计学意义（P&0.05）。&
　　3讨论&
　　随着人口老龄化的进程，AD发病率逐年提高，其特征性病理特征为：神经元胞外&淀粉样蛋白沉积形成的老年斑（SP），tau蛋白过度磷酸化形成的神经元内神经纤维缠结（NFTs），神经元、突触的大量丢失[3]。Di等[4]在AD进展的调查中进行了一个细胞应激反应，结果显示，轻度认知障碍的患者海马区、颞叶脑区内的伴有多种HSPs（HSP27，HSP32，HSP60，HSP70，HSP90）表达量的增加，并建议HSPs作为AD的早期诊断监测指标，HSPs也可能成为治疗AD的合适靶点之一。国内外学者研究显示HSP70参与AD多个环节，可减少A&聚集、促进A&清除、减少tau蛋白过度磷酸化、减少神经元丢失，拮抗AD[5]。有研究显示，替普瑞酮能诱导大鼠海马区HSP70表达，进而抑制线粒体凋亡途径及部分死亡受体凋亡途径的激活发挥抗凋亡作用，神经元损伤下调，可见HSP70不仅作为细胞内蛋白发挥作用，还可以通过旁分泌的途径从免疫调节等其他方面发挥拮抗AD的作用[6]。本课题组在AD的防治方面进行了大量的前期工作，提出通过基因转导的方式构建过表达HSP70的干细胞，移植后可长期稳定地表达HSP70，可能是治疗AD的有效途径。前期研究构建腺病毒质粒转染HSP70至大鼠神经干细胞，离体和在体动物实验均显示可提高学习记忆功能，拮抗AD进展[7]。但腺病毒存在免疫原性高，易被机体清除的致命弱点，故本研究将从寻找更佳的工具细胞（无创获取、多代次传代、可在体内长期存活、具备神经再生功能、易推广）和更佳的转染方式（长期稳定的表达目的蛋白）入手，进一步探讨。　基因治疗已经作为一种手段进行临床疑难疾病的治疗，初显成效。其中工具细胞的选择至关重要，间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）作为间叶组织的干细胞，既可以自我更新和繁殖，也可以分化成为多种组织成分，且其免疫原性低，在异体移植时不易发生免疫排斥反应，这些特性使MSC成为组织工程研究的热门工具细胞。文献报道从骨髓、脐带血、脂肪、胎盘、脐带等多种组织均能分离得到MSC，目前，用于构建组织工程的工具细胞常选择骨髓MSC，但随着年龄的增长，骨髓MSC细胞数量和增殖能力均显著下降。本研究选择hUC-MSC作为工具细胞有三方面优势：①脐带来自产妇生产过程中的废弃物，获取方便，不存在学争议。②hUC-MSC免疫原性低，甚至有报道显示MSC有类似免疫抑制剂的作用，目前已有大量关于MSC与造血干细胞联合应用，减少移植物抗宿主病的文献报道[8]，hUC-MSC已被批准异体应用于预防GVHD。故异体移植后能长期存活在患者体内，表达目的基因，持续发挥治疗效果。③hUC-MSC在体内外因素的诱导下，可分化为神经样细胞[9-10]，主要包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，且已有hUC-MSC治疗脑伤损性疾病的临床试验研究报道，结果显示有一定临床应用价值[11]。分化后的神经样细胞除了继续表达转染的基因发挥治疗效果外，分化后的细胞本身对AD也起到神经修复作用。本研究选择hUC-MSC作为工具细胞，并根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会标准[12]，对获得的hUC-MSC从形态学、表面标志物、多向分化潜能方面进行鉴定。&
　　基因治疗的另一关键问题在于如何将目的基因准确无误地导入靶细胞，并使其在宿主细胞中高效稳定地表达，因此，理想的载体应具备以下条件：①转染能力强，能够转染处于分裂期和非分裂期的各种细胞；②细胞毒性低或无细胞毒性；③能够保证目的基因高效转染和长期表达；④载体容量大，可用于构建多基因的共表达系统；⑤易合成，稳定性好，便于浓缩和纯化；⑥缺乏自我复制能力，可控性高。目前，常用的基因转移载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等，这些转移介质中，质粒转导效率很低，使用价值不大。逆转录病毒载体则难以达到高滴度，只能转染处于分裂期的靶细胞，而且它可以整合至靶细胞染色体的任意位置，有插入突变的潜在危险，不适合临床应用。腺病毒虽然能够转染分裂期和非分裂期的细胞，但因其只能实现瞬时表达，不能发挥远期疗效，且反复应用易引起严重的免疫反应，从而导致疗效下降。近年来发展起来的慢病毒载体克服了上述转染载体的诸多劣势，其转染能力强，载体容量大，此外还具备免疫反应小，无复制能力等诸多优点，被广泛应用[13-14]。苏玉金等[15]的研究显示，腺病毒载体介导的基因转染率骨髓MSC的转染率仅为49.1%，远远低于慢病毒载体的91.4%（P&0.01），提示以慢病毒为载体的转染方式更适合干细胞的基因导入。&
　　本研究从GeneBank中获取了人类HSP70家族的主要成分HSP72的基因[基因名称HSPA1A，piens heat shock 70kDa protein 1A，mRNA（cDNA clone MGC：15236 IMAGE：4123837）]，选择新一代的非融合性、双启动子pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒载体，通过酶切和重组的方式获得了pLV-HSP72-EGFP（2A），经PCR、多酶切鉴定及测序的方式比对正确后，采用感受态细胞对该病毒进行包装。pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒感染hUC-MSC，用puro抗性基因筛选三代后，获得稳表达HSP72的pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC细胞系。ELISA检测结果显示，pLV-HSP72-EGFP（2A） hUC-MSC培养液上清中的HSP72表达量明显高于pLV-EGFP（2A） hUC-MSC细胞和hUC-MSC对照组，而pLV-EGFP（2A） hUC-MSC细胞和hUC-MSC对照组培养上清液中的HSP72表达量无明显差别。pLV-HSP72 hUC-MSC细胞系的建立，为进一步HSP72治疗AD的实验研究提供工具和基础。&
　　[参考文献]&
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