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老龄apoe基因敲除小鼠主要动脉血管病理学研究
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老龄apoe基因敲除小鼠主要动脉血管病理学研究
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APOE基因检测与老年疾病
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&&基因是细胞遗传物质具有特定功能的核酸序列片段.基因突变是遗传物质在内外因素影响下发生基因碱基组成和序列改变,引起机体结构功能变化而发生疾病或生物进化的过程.APOE(载脂蛋白)基因位于19q13.2,全长3.7Kb,含4个外显子,它产生的APOE功能蛋白是低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒受体的配基.……
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请填写真实有效的信息，以便工作人员联系您，我们为您严格保密。Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法
专利名称Apoe基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法
技术领域本发明涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法和检测方法，尤其是利用多重PCR结合分子开关技术检测APOE酶活性相关的SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。
背景技术载脂蛋白E(apolipoproteinE, apoE)是血衆载脂蛋白一个重要组成部分，是1973年首先在正常人的极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的，由299个氨基酸组成的单一多肽链，相对分子量为34kD的糖蛋白。人类apoE主要存在于VLDL、LDL、CM和CM残骸(Chy1micronremm-ants)中，也存在于β -VLDL和HDL的亚类HDL1和HDLc中。它主要在肝脏合成，约占血浆apoE的2/3-3/4。ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，对血脂代谢起重要的调节作用，近年来研究发现，APOE基因多态与冠心病、老年性痴呆(Alzheimer’ s, AD)及老化等疾病有关。Apo E是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3和E4，其基因APOE上存在 2 个 SNP 位点:Cysl 12Arg(rs429358)和 Argl58Cys (rs7412)，野生型基因为 Cysll2、Argl58，表达为E3蛋白；E4蛋白为rs429358突变，即Argl 12 ;E2蛋白为rs7412突变，即Cysl58。ApoE的主要生理功能是通过与LDL受体结合并参与LDL代谢过程，APOE基因的变异可影响LDL受体结合活性而影响脂质代谢，进而影响疾病的发生。
APOE基因上两个中国人常见SNP直接影响APOE酶的活性，影响多疾病的发生。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术对APOE基因进行基因检测的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测 方法。本发明采用的技术方案:一种APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒包括检测基因APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。所述试剂盒包括检测APOE基因rs429358位点的两个正向引物、APOE基因rs7412位点的两个正向引物、APOE基因内参上游引物及一个反向共用引物。所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突变型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突变型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物:正向内参引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用弓I物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA。
所述的APOE基因检测试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和I个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是:内对照398bp，rsbp，rs7412129扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断2个SNP位点的基因型。所述的APOE基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，包括以下步骤:预变性由1次循环构成，其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94 °C，时间为30秒；退火:温度为65°C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对2个包含SNP位点的DNA片段和I个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2X扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本发明的试剂盒所提供的野生型和突变型2X扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，避免人为错误。扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加A loading buffer,操作方便快捷。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本发明APOE基因检测试剂盒，所述试剂盒可同时对APOE基因上的rs429358位点和rs7412位点进行扩增分型检测，以APOE基因为内参来检测扩增条件；野生型2X缓冲包含上述2个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和上游内参引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2 X缓冲液包含上述2个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和上游内参引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突变型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突变型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因内参上游弓丨物和共用下游引物:正向内参引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用引物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA本发明试剂盒的组分和含量包括:野生型2 X扩增缓冲混合液，突变型2 X扩增缓冲混合液，高保真聚合酶。本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例步骤1:全血细胞裂解液的制备取受检者外周静脉血300 μ 1，加入700 μ I细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心I分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加Λ 300 μ I双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。步骤2 =PCR扩增反应1、配置野生型反应体系:PCR管内加入细胞裂解悬液4.8 μ 1、加入5 μ 12Χ野生型扩增缓冲液和0.2 μ I聚合酶(2.5U/ μ I)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，具体见下表:
1.一种APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因APOE rs429358位点和rs7412位点的引物及内参引物。
2.根据权利要求1所述的APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测APOE基因rs429358位点的两个正向引物、APOE基因rs7412位点的两个正向引物、APOE基因内参上游引物及一个反向共用引物。
3.根据权利要求2所述的APOE基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测APOE基因rs429358位点的引物碱基序列如下所示:
正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT
正向突变型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC
所述检测APOE基因rs7412位点的引物碱基序列如下所示:
正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC
正向突变型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT
所述APOE基因内参上游引物和共用下游引物:
正向内参引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG
反向共用弓 I 物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA
4.一种权利要求1所述的APOE基因检测试剂盒所采用的检测方法，其特征在于，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对2个目的片段和I个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是:内对照398bp，rsbp，rs扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断2个SNP位点的基因型。
5.一种权利要求1所述的APOE基因检测试剂盒的多重PCR扩增方法，其特征在于，包括以下步骤:
预变性由I次循环构成，其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；
PCR扩增由30次循环构成，其条件为:
变性:温度为94°C，时间为30秒；
退火:温度为65°C，时间为30秒；
延伸:温度为72°C，时间为90秒；
扩增结束后于4°C保存至电泳检测。
本发明公开了一种APOE基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法。所述试剂盒对APOE基因上明显改变其产物活性的两个常见的多态性位点进行分型，包括rs429358SNP位点和rs7412SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述两个SNP位点的分型，从而对APOE基因进行基因分型，为该基因所表达的酶的活性的预测提供分子生物学依据。
文档编号C12Q1/68GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者韩俊领, 杜宏伟, 周毓玲, 崔丽娟 申请人:协和干细胞基因工程有限公司, 天津滨海协和基因科技有限公司→ 载脂蛋白e偏高的原因是什么？
载脂蛋白e偏高的原因是什么？
健康咨询描述：
我最近老是感觉头晕，全身无力，整个人显得没精打采的。后来我去医院，医生让我做了几项检查。结果说是载脂蛋白e偏高，其他的都正常。不知道这个会不会引起肝病。
想得到怎样的帮助：载脂蛋白e偏高的原因是什么？
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王医生医师
&&&&&&病情分析：载脂蛋白e(ApoE)生理功能有：&&&&&&①是LDL受体的配体也是肝细胞CM残粒受体的配体它与脂蛋白代谢有密切相关性；&&&&&&②ApoE具有多态性多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关；&&&&&&③参与激活水解脂肪的酶类参与免疫调节及神经组织的再生.&&&&&&人类ApoE主要在肝脏和脑组织合成在其他组织包括单核细胞（含巨噬细胞）也有合成能力人的肾上腺、卵巢颗粒细胞也能合成ApoE脑中ApoE的mRNA表达总量是肝脏的1/3星形细胞是其主要合成部位脑中生成的ApoE的作用可能是使细胞内的脂类重新分配而保持脑环境中的胆固醇平衡脑肿瘤中发现有高浓度的ApoE推断它可能作为神经胶质细胞瘤的标记.&&&&&&指导意见：建议暂时饮食控制，平时清淡饮食，多吃蔬果，少吃辛辣油腻的食物，禁烟酒等。多运动对控制脂蛋白升高也有一定的帮助。
擅长: 高血压,冠心病,甲亢,呼吸衰竭,心绞痛,心律失常,
帮助网友：8825称赞：30
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&&&&&&病情分析：载脂蛋白e(ApoE)多态性与老年性痴呆病（AD）的关系。1993年，Rose研究发现，晚发性家族型AD病人ε4频率增多，还发现ApoE和来源于淀粉样前体蛋白的小多肽Aβ的亲和力很高。其后陆续发现AD病人中携带ε4等位基因者占46.2%，而对照组占13.2%。还发现携带二个ε4等位基因的研究对象比携带一个ε4的研究对象发生AD年龄早，比不携带ε4等位基因的研究对象发生AD年龄更早，1994年，Schacher等人相继报道百岁老人普遍携带ε2基因。这一发现使ApoE多态性和研究向前迈出了一大步。有报道高老年人携带ε2等位基因数量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不仅可以保护人们免患AD，而且还与长寿有关。ApoE多态性与AD的关系，目前的研究主要集中在脑代谢中与Aβ或Tau蛋白以及神经元生长和分枝等有关。&&&&&&以上是对“载脂蛋白e偏高的原因是什么？”这个问题的建议，希望对您有帮助，祝您健康！
黄医生爱心医生
&&&&&&病情分析：载脂蛋白E是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，与许多眼科疾病发病有关，对ApoE及其基因多态性的研究是目前医学研究的热点之一，探讨两者之间的内在联系，对眼病的预防、诊断及治疗具有重要的临床应用价值。载脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中， 正常人血浆ApoE浓度为0.03～0.05g/L。Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。血脂检查中主要观察的是低密度脂蛋白，甘油三酯以及胆固醇的水平，明确有无动脉硬化的基础性危险因素的。&&&&&&建议意见：载脂蛋白本身是意义不大的，不要紧张。
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黄医生爱心医生
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&&&&&&病情分析：&&&&&&载脂蛋白E(ApoE)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，载脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中，正常人血浆ApoE浓度为0.03～0.05g/L（3.0-5.0mg/dl）。ApoE的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。是一种富含精氨酸的碱性蛋白，&&&&&&指导意见：&&&&&&就你的情况看，载脂蛋白E偏高，轻度。但是存在动脉硬化，高脂症可能性。也不必担心什么的。首先得注意均衡的饮食，不要吃过多的淀粉类的东西，不要吃过多的脂肪，尤其是饱和脂肪酸特别多的东西，比如肥肉、内脏这些食品、含胆固醇比较高的食品，要尽量减一些。另外需要保持良好的心情，适当进行锻炼，减肥等，如果这些方法还不能使血脂恢复正常就得考虑用药物了。常用的药物是他汀类，烟酸类、氯贝丁脂类等，需要在医生指导下选用。&&&&&&以上是对“载脂蛋白e偏高的原因是什么？”这个问题的建议，希望对您有帮助，祝您健康！
疾病百科| 肝病
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下载APP，免费快速问医生& APOE基因多态性与脑血栓形成的关系
APOE基因多态性与脑血栓形成的关系
摘 要：1973年在人类血浆的极低密度脂蛋白（VLDL）中首先发现载脂蛋白E基因。人类血浆APOE是一个由299个氨基酸组成的单一多态链，是一种糖蛋白。APOE在人体内血浆脂蛋白的代谢，尤其在富含甘油三酯和胆
【题　名】APOE基因多态性与脑血栓形成的关系
【作　者】吕晶 曲芳 王金华 曹德生
【机　构】大连市第二人民医院,辽宁大连116011
【刊　名】哈尔滨医药,
2007(2): 9-11
【关键词】APOE基因多态性 脑血栓形成 载脂蛋白E基因 血浆脂蛋白 脂蛋白代谢 极低密度脂蛋白 致动脉粥样硬化 人类大脑
【文　摘】1973年在人类血浆的极低密度脂蛋白（VLDL）中首先发现载脂蛋白E基因。人类血浆APOE是一个由299个氨基酸组成的单一多态链，是一种糖蛋白。APOE在人体内血浆脂蛋白的代谢，尤其在富含甘油三酯和胆固醇的脂蛋白代谢中，对致动脉粥样硬化残骸的清除很重要。人类大脑是APOE合成分泌的主要器官之一。APOE在脑内主要作用是参与脑磷脂的代谢，维持了细胞间脂类的重新分布及胆固醇内环境的稳定，并参与神经的发育及神经细胞的损伤后的修复、再生时的脂质活动以及脂质免疫调节和细胞调节。1975年Utermann等在研究Ⅲ型高脂血症病人的血样时，发现载脂蛋白E存在具有遗传多态性。近年来，人们发现血管病有家族聚集现象，符合多基因遗传方式。脂代谢相关的基因突变被认为与脑梗死密切相关。APOE基因多态性是研究的主要候选基因。
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