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PCR-DGGE在造纸废水微生物检测中应用
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造纸工业的迅速发展造成了严重环境污染，利用生物处理技术来降解污染物是制浆造纸废水中的最重要的方法之一，但目前的研究主要几种在处理工艺的选择及工艺参数的和设计参数的优化，面对其中微生物的研究涉及很少。但生物处理系统中微生物的种群结构以及微生物多样性，结构稳定性和功能稳定性在污水处理系统有效性中起着重要作用。研究水处理工艺中微生物的组成结构、数量以及多样性对于提高废水生物处理效果，研究生化反应的机理，、污染物降解和转化途径具有非常重要的意义。但是传统的微生物法用于环境生物学研究时环境中只有不超过10%的微生物可以培养，并且由于常规检测方法受到采样和分析条件的影响，不仅检测时间厂，结果准确率差，而且有些种类分离比较困难。因此，传统的方法不能充分揭示微生物群落多样性的变化来迅速判断环境的变化。　　近年来，分子生物学的迅速发展使得微生物不需要经过长时间的分离培养，而直接从样品里提取DNA来对复杂微生物生态系统进行研究，能够快速反应生物学方法具有简便、快速、灵敏、特异等优点已被广泛采用，主要的方法有核酸探针杂交检测方法、荧光原位杂交（FISH）、聚合酶链式反应（PCR）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和脂肪酸指纹法等。将PCR-DGGE结合起来可以使我们能够快速、准确地鉴定微生物个体，并进行复杂微生物的群落多样性和动态性、特殊基因的跟踪与表达的分析，尤其适合对不同的研究对或者不同时空的某一对象内微生物的组成分析，已被广泛应用于生物、环境、食品、医药等微生物的检测中，但是在制浆造纸废水处理微生物的检测中的应用在国内还鲜见报道，将其应用于制浆造纸废水处理的微生物检测中有助于理解微生物的作用机理，对制浆造纸废水的处理具有非常重要的意义。　　1 PCR-DGGE的发展　　20世纪70年代初，Kteppe等就提出了PCR的工作原理。1985年Cetus公司的Mullis等建立了一套大量快速扩增特异DNA片段的系统，获得了大量染色体DNA单拷贝基因，但是使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow不耐热。1988年，Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到耐热的TaqDNA多聚酶，并引入了PCR系统，结果发现TaqDNA聚合酶经过多次循环后仍具有活性，反应体系可以自动往复多次循环后仍具有活性，反应体系可以自动往复多次的对所需DNA片段进行酶促合成。1993年，Mullis采用定向酶促扩增法选择性的富集某一特异性DNA序更10的六次方倍，可以从100万个细胞中检测到一个靶细胞。自此，PCR技术就开始就开始在各个相关领域得到了迅速而广泛的应用。　　DGGE是由Fischer和Lerman最先提出的用于检测点突变的一种电泳技术，1985年，Myers等首次采用“GC夹板”技术并使用异源双链技术，Sheffield等于1989年将“GC夹板”技术与PCR技术相连接，1993年Muyzer首次将其引入分子微生物学的研究中。目前PCR-DGGE已经成为一项常规的分子生物学研究方法，在微生物群落结构和多样性分析上有广泛的应用。　　2 PCR-DGGE的原理和特点　　PCR是一种体外酶促扩增特异DNA序列的技术，是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。PCR反应包括模板DNA链的热变形、引物退火复性和在DNA聚合酶作用下引物的延伸三个阶段。模板DNA加热到94摄氏度左右反双链解离成单链，在一定的温度下，两个人工合成的寡核苷酸引物分别与模板DNA的两条链互补结合，结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，按照碱基配对与半保留复制的原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。由于反应循环可以进行一定次数（通常为25-30个循环），所以在短时间内就可以获得大量目的基因。　　DGGE可分离长度相同但是碱基不同的DNA片段的混合物，DGGE胶在聚丙烯酰胺胶中添加了线性梯度的变性剂甲酰胺。，这样就可以形成从低到高的线性梯度。通常采用琼脂糖凝胶电泳来检验PCR的结果。将PCR和DGGE结合起来在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统分析可以在一定成都上反应样品的复杂性。条带的多少能反应样品中微生物组成的差异，条带的亮度能反应样品中微生物的多少。由于PCR-DGGE具有以上优点，目前该技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得到了广泛应用。　　3 PCR-DGGE在环境微生物检测中的应用　　制浆造纸废水中含有大量的糖类、木素等有机化合物，通常采用活性污泥法来降解污染物，将PCR-DGGE用于活性污泥中微生物的研究已经有很多报道。Marsh等利用PCR-DGGE分析并获得了油菜花活性污泥中真核生物的种群变化情况，王峰等采用PCR-DGGE技术对城市污水化学生物的絮凝处理中活性污泥和生物膜中微生物种群惊醒了分析，结果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生了很大的变化。　　制浆含氯漂白的过程中会产生多种有机氯化物，尤其是产生的氯代酚类具有很强的毒性、致癌、致畸、致突变性，很难生物降解，因此筛选出降解这些物质的优势菌并理解他们的作用机理具有非常重要的意义。任艳红等采用PCR-DGGE技术对降解五氯酚的厌氧生物反应器中微生物群落结构进行了研究，结果表明随着PCR负荷的与污泥的颗粒化，污泥真细菌和古细菌组成都发生了变化。　　PCR-DGGE不仅仅用于废水活性污泥中微生物的检测，在土壤和其他方面也有广泛应用。Mphekgo p.Maila等研究了地理未知和碳氢化合物污染两种因素对土壤微生物的群落结构和功能的影响，结果显示污染物对微生物造成的影响更大。赵璇等研究了被氯酚污染的土壤中微生物群落的变化，发现未受氯酚污染和受氯酚污染的土壤中有共同的DNA谱带，但强度有显著差异。　　此外，PCR-DGGE还可以用于检测细菌和跟踪某些细菌的基因。Nicolaisen等利用PCR-DGGE技术发现Nitrosomonas-like细菌是商流式好氧流化床颗粒污泥中的主要氨氧化菌。刘新春等应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌家中的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。　　4 PCR-DGGE技术的发展前景
　　由于PCR-DGGE技术无需长时间的培养，准确率高，快速简便，能克服传统方法分析微生物群落的限制，目前已经成为微生物分析技术的一种重要手段。但是PCR-DGGE存在可分析的样品容量小、不能对样品中所有的DNA片段进行分离等局限性，为了充分全面的揭示微生物的群落结构，往往将DGGE与其他技术结合起来进行分析。将PCR-DGGE与其他分子生物学技术以及微生物学方法结合起来可以减少不同技术的弊端和局限性，综合各种技术的优势，可以更准确的揭示微生物群落结构和功能。将PCR-DGGE与其他技术联合起来，用于制浆造纸废水生物处理系统中微生物群落的分析，，对于揭示微生物降解污染物的机理有指导意义，并具有良好的应用前景。
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PCR-DGGE技术及其在微生物群落结构研究中的应用
【摘要】：PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,是一种被广泛应用于环境生态学中微生物群落多样性、动态性分析和功能细菌跟踪的指纹识别技术。本文介绍了PCR-DGGE分析技术的基本原理和方法,并就该方法在对生态环境中、动物和人体内微生物群落结构的研究应用情况做了综述,并对该技术自身存在的局限性和应用前景进行了评价。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：Q938【正文快照】：
变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析技术最初是由Lerman等于20世纪80年代初期发明的,起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究,后又发展出其衍生技术温度梯度凝胶电泳[1]。此后十几年间,该技术被广泛用于土壤、活性污泥、生物膜、
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-> 微生物结构
1)&&microbial structure
微生物结构
The aspects discussed include the general characteristics and microbial structure of aerobic granules,major factors influencing granulation,models of sludge granulation,and their applications.
综述了好氧污泥颗粒化技术在废水生物处理中的研究进展,着重讨论了好氧颗粒污泥理化特性及微生物结构、污泥颗粒化主控因子、颗粒污泥形成机理及其应用潜力等方面的研究,旨在阐明多种工艺操作条件下好氧污泥颗粒化过程。
2)&&biomicrostructure
生物微结构
3)&&bacterial community structure
微生物群落结构
To enhance the efficiency of A/O process for petrochemical wastewater treatment,the relationship between bacterial community structure and the pollutants loading/degrading rates are analyzed by the polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) technique.
为提高石油化工污水厂厌氧—好氧(A/O)工艺净化效能,应用聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)与常规技术相结合的方法分析了石化废水处理系统生化池中微生物群落结构变化与污染负荷和主要污染物降解效果变化的关系。
4)&&microbial community structure
微生物群落结构
Research progresses on analytical technologies used in microbial community structure
微生物群落结构和多样性解析技术研究进展
Remediation of chromium-contaminated sediments by zero-valent iron and its effects on microbial community structure
零价铁对铬污染底泥的修复及其对微生物群落结构的影响
In order to examine the influence of lead (Pb) contamination on microbial biomass, two ecophysiological parameters and microbial community structure in soil during the growth of Chinese Cabbage (Brassica chinensis), a 60 days-growth experiment of the plant was conducted in two different soils, namely, marine sediment silty loam (S1) and yellowish red soil (S2).
对21种磷脂脂肪酸(PLFA)的图谱进行分析,结果表明,受铅污染土壤的微生物群落结构组成伴随着功能参数的变化而发生了改变;随着铅污染程度的增强,指示真菌和放线菌类的脂肪酸增加,而革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌脂肪酸比值下降。
5)&&biological micro-structure
生物微细结构
6)&&microbial community structure
微生物种群结构
Analysis of microbial community structure with DGGE sludge compost technology.;
DGGE污泥堆肥工艺微生物种群结构分析
The accumulation of acetate and variation of microbial community structure during anaerobic fermentation of sludge were studied by using a special inhibitor-2-bromoethanesulfonate (BrCH2CH2SO-3, BES) to inhibit methanogens.
研究了污泥厌氧发酵过程中产甲烷菌被特异性抑制剂——2-溴乙烷磺酸盐(BrCH2CH2SO3-,BES)抑制时乙酸的累积,并采用一种新的微生物分子生态学手段——末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)研究乙酸累积状态下的微生物种群结构。
The influence of Fe~(2+) and Ni~(2+) metal ions on microbial community structure in(2-chlorophenol)(2-CP)-acclimated anaerobic granular sludge was investigated with modern molecular biological techniques.
采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究Fe2+,Ni2+金属离子对经2-氯酚(2-CP)驯化后的厌氧生物反应器颗粒污泥的微生物种群结构的影响。
补充资料：氨基酸发酵微生物
&&&&　　发酵生产氨基酸的微生物。1950年发现了大肠肝菌能分泌少量的丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸，以及加入过量的铵盐可增加氨基酸积累量的现象。1957年,日本的木下祝郎等采用谷氨酸棒状杆菌进行L－谷氨酸发酵取得成功。不久，利用该菌的突变株又发酵生产了L－赖氨酸、L－鸟氨酸和L－缬氨酸等。中国于 1958年开始研究L－谷氨酸,随后分别报道了酮戊二酸短杆菌2990-6的L-谷氨酸发酵及其代谢的研究结果。1965年把北京棒状杆菌ASI299和钝齿棒状杆菌ASI542先后应用于L－谷氨酸发酵的工业生产,接着在选育其他氨基酸的优良菌株方面也取得一定成果，逐渐形成了中国的氨基酸发酵工业。　　　　近20种氨基酸均可用微生物发酵法生产。但是，微生物的细胞具有代谢自动调节系统，使氨基酸不能过量积累。如果要在培养基中大量积累氨基酸，就必须解除或突破微生物的代谢调节机制。氨基酸发酵就是人为控制这种机制所取得的重大成果。从自然界中分离筛选野生菌株,控制其胞膜通透性，使之有利于分泌大量L－谷氨酸,这也是获得L－谷氨酸发酵微生物优良菌株的重要途径。其次通过对产L－谷氨酸菌株的人工诱变,选育产氨基酸的各种突变株，是获得其他氨基酸发酵微生物优良菌株的有效方法。　　　　L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、微杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具有下述共同特性：①细胞形态为短杆至棒状；②无鞭毛，不运动；③不形成芽孢；④革兰氏阳性；⑤要求生物素（利用石蜡为碳源的要求硫胺素）;⑥在通气培养条件下产生大量L－谷氨酸。此外，其他细菌、放线菌和真菌中的一些属种也有产L－谷氨酸的菌株，但产酸率较低。　　　　产其他氨基酸的微生物,主要是对上述产L－谷氨酸的优良菌株进行人工诱变后选育出的各种突变株：①营养缺陷型突变株。利用营养缺陷型突变株发酵生产氨基酸的关键是限制某种反馈抑制物或阻遏物的量，以解除代谢调节机制而有利于代谢中间体或最终产物的过量积累。因此，不同氨基酸缺陷型生长在含有限量的所要求氨基酸的培养基中，往往能产生和积累大量某种氨基酸。例如,L－赖氨酸的生产菌株多采用高丝氨酸缺陷型突变株，而精氨酸缺陷型突变株往往产生鸟氨酸或瓜氨酸等；②调节突变株。采用调节突变株发酵生产氨基酸是成功的工艺之一，因为这类突变株一旦对氨基酸结构类似物具备了抗性之后，其正常代谢调节机制即被解除，因而能够积累大量的相应的氨基酸；③营养缺陷型与抗反馈调节多重突变株。采用这类多重突变株对提高某些氨基酸的发酵产率有明显的效果。例如，生产L－精氨酸、L－色氨酸、L－苯丙氨酸、L－酪氨酸、L－白氨酸和L－苏氨酸等就常采用多重突变株。　　　　此外，还可利用添加前体物和酶转化法生产氨基酸。特别是遗传工程技术的应用，在获得或改造氨基酸发酵微生物高产菌株方面，出现了可喜的进展。　　
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官方公共微信PCR-DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究--《生态学报》2006年11期
PCR-DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究
【摘要】：采用PCR-DGGE分子指纹图谱技术比较南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构,研究结果表明,三湖泊沉积物微生物的16S rDNA的PCR扩增结果约为626 bp,为16S rDNA V3~V5区特异性片段。玄武湖和莫愁湖表层沉积物中大约有20种优势菌群,且同一湖泊不同采样点DGGE图谱的差异性不大,细菌群落结构具有较高的相似性,而太湖样品DGGE条带的数目和位置表现出明显差异,且不同采样点图谱的差异性较大。三湖泊除具有特征性的微生物种属外,还分布约5个相同的细菌种群,可能与沉积物的理化性质和水生植被的影响相关。对DGGE图谱中7条主带进行回收、扩增和测序,结果显示其优势菌群具有不同的序列组成,其中5个序列与Genebank中已登录的细菌种群的同源性≥99%,2个序列的同源性为96%和93%,其中2个相似的细菌类群目前尚未获得纯培养。
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【分类号】：Q938.8【正文快照】：
变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术最先由Fischer和Lerman提出并用于DNA突变检测,1993年Muyzer将该技术首次应用于微生物生态学研究,现在该技术在微生物群落多样性和种群动态监测中得到广泛使用[1]。这种方法基于从样品中直接提取微生物群
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