胰腺干细胞及转分化过程的免疫学特性研究--《暨南大学》2007年硕士论文
胰腺干细胞及转分化过程的免疫学特性研究
【摘要】：
目的：分离、纯化、扩增大鼠胰腺导管上皮细胞，在体外诱导转分化为胰岛样细胞，分离、纯化大鼠胰岛，比较胰腺干细胞、转分化胰岛样细胞与天然胰岛的免疫学的特性，探讨胰腺干细胞在临床应用中免疫学问题，为干细胞临床应用打下基础。
方法：(1)分离消化SD大鼠胰腺，用差异性贴壁、低血清培养等方法纯化出大鼠胰腺导管上皮细胞，通过含KGF、EGF、ITS等细胞因子的基础培养基使其有效扩增，观察细胞增殖能力，并绘制生长曲线，免疫细胞化学染色法鉴定其表面标志CK-19的表达。当细胞扩增、融合至80％—90％时，改变细胞培养方案，通过含有exendin-4、KGF、NIC等细胞因子和葡萄糖的培养基，使胰腺导管上皮细胞转分化胰岛样细胞。(2)观察细胞生长状态并摄片。对转分化4周后的胰岛样细胞进行DTZ染色鉴定。(3)分离纯化SD大鼠天然胰岛，DTZ染色鉴定。(4)分离SD大鼠外周血淋巴细胞，分别地与胰腺干细胞、转分化的胰岛样细胞、天然胰岛细胞混合培养，用ELISA检测培养上清中IL-2的水平，Elispot检测IFN-γ的分泌水平，流式细胞术检测共培养后的淋巴细胞的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达。(5)把胰腺干细胞、转分化的胰岛样细胞、天然胰岛细胞分别注入大鼠大腿内侧肌，5d后处死，做病理切片，HE染色，观其炎症反应。(6)制备1型糖尿病大鼠模型，将胰腺干细胞、转分化的胰岛样细胞、天然胰岛细胞移植到糖尿病大鼠模型皮下，分别在1d、3d、5d、7d采取大鼠未静脉血，流式细胞术检测MHC-Ⅱ的表达和ELISA检测血清中IFN-γ的水平。
结果：(1)成功分离、纯化了大鼠胰腺导管上皮细胞，使其有效扩增，并有效抑制了胰岛细胞和成纤维细胞的污染，纯化后大部分细胞CK-19(胰腺导管上皮细胞的标志)表达阳性。(2)诱导后细胞逐渐增大、变形，并出现类圆形小细胞，聚集成团，呈圆形或椭圆形的胰岛样团状结构，细胞团慢慢增大、增多，4周后细胞团DTZ染色阳性。(3)分离纯化的大鼠天然胰岛，DTZ染色阳性。(4)胰腺干细胞、转分化的胰岛样细胞、天然胰岛细胞分别与淋巴细胞共培养5d，上清中IL-2的水平分别为44.1pg／ml、230.7pg／ml、317.6pg／ml，Elispot检测IFN-γ斑点依次增多，MHC-Ⅰ的表达分别为15.0％、16.7％、17.9％，MHC-Ⅱ的表达分别为0.8％、转分化胰岛样细胞和天然胰岛细胞周围炎症反应依次加强。(6)糖尿病大鼠模型造模成功，移植后胰腺导管上皮细胞组MHC-Ⅱ表达未见差异，而转分化的胰岛样细胞组和天然胰岛组，MHC-Ⅱ的表达随时间延长而增加。血清中IFN-γ的水平，转分化的胰岛样细胞组和天然胰岛细胞组较高胰腺干细胞组显著升高(P＜0.05)。
结论：大鼠胰腺导管上皮细胞在体外可得到有效扩增并具有干细胞潜能，与天然胰岛细胞相比较，大鼠胰腺干细胞免疫原性较低，转分化的胰岛样细胞免疫原性逐渐升高，表明胰腺干细胞在转分化为胰岛细胞过程中，免疫原性逐渐增强，为探讨治疗性干细胞免疫应答提供了依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：暨南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：R392【目录】：
中文摘要4-6
英文摘要6-8
1 前言9-11
2 材料与方法11-22
2.1 材料11-16
2.2 实验方法16-22
3 结果22-32
3.1 原代培养的胰腺导管上皮细胞的动态观察22
3.2 纯化培养3天细胞22-23
3.3 胰腺干细胞纯化培养12d的观察23
3.4 生长曲线绘制23-24
3.5 胰腺干细胞免疫细胞化学染色鉴定24-25
3.6 胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞过程中细胞形态学变化25-26
3.7 转分化后胰岛样细胞团DTZ染色26-27
3.8 分离纯化的大鼠天然胰岛观察27
3.9 大鼠外周血淋巴细胞的分离、活性鉴定27-28
3.10 Elispot检测INF-γ结果28
3.11 流式细胞术检测淋巴细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的结果28-29
3.12 ELISA检测共培养的淋巴细胞IL-2的水平29-30
3.13 病理HE结果30
3.14 I型糖尿病大鼠模型30-31
3.15 ELISA检测大鼠血清中淋巴细胞INF-γ的水平结果31
3.16 流式细胞仪检测血液中单核细胞MHC-Ⅱ表达结果31-32
4 讨论32-39
4.1 胰腺导管上皮细胞的原代培养及鉴定33-34
4.2 胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞团34-36
4.3 胰岛样细胞团的鉴定评价36
4.4 天然胰岛的分离、纯化和功能评价36
4.5 胰腺干细胞免疫学特性的评价36-39
5 结论39-40
参考文献40-47
缩略词表47-48
附综述48-55
在校期间发表的论文55-56
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胰腺低分化腺癌怎么治疗？
胰腺低分化腺癌是胰腺腺癌中恶性程度很高的一种，其发病迅速，预后较差。相对于胰腺高分化腺癌及胰腺中分化腺癌来说，其癌细胞分化程度低。胰腺低分化腺癌怎么办？
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由于恶性程度高，胰腺低分化腺癌的治疗难度较大，发现时多已为中晚期。且由于胰腺位置较深，与肝脏、胆囊、胃及十二指肠等关系密切，且缺乏特异性的检查方法，很容易导致误诊，因此，详细准确的病理诊断很重要，患者一旦出现不明原因的上腹疼痛，应及早进行检查，若怀疑为胰腺低分化腺癌，应去权威的大医院进一步确诊。早期胰腺低分化腺癌的治疗以手术切除为主，While手术是胰腺低分化腺癌的治疗主要的手术方式，但术后易发生胰瘘，这是While手术死亡的主要原因。可行胰空肠吻合来防止胰瘘的发生。另外，胰腺低分化腺癌的手术精细度要求较高，因此建议患者到正规的大医院接受手术。手术后的胰腺低分化腺癌患者可根据手术切除情况及病人身体状况进行中医治疗，以提高免疫功能，防止复发。中晚期胰腺低分化腺癌大多已发生转移扩散，且此时病人身体机能很弱，大多已无法进行手术切除，临床上，中晚期胰腺低分化腺癌的治疗主张多种方法综合进行。虽然胰腺低分化腺癌对化疗药物不敏感，但化疗应用在中晚期胰腺低分化腺癌治疗中，可一定程度上延长生存期，使部分病情得以缓解，常用化疗方案有FAM，FAP和MA等。放射治疗对癌细胞有较为直接的杀灭作用，与化疗联合应用于中晚期胰腺低分化腺癌的治疗中，可提高治疗效果，延长患者生存期。另外，要特别提出的是中医药在胰腺低分化腺癌的治疗中的应用。胰腺低分化腺癌的恶性程度较高，单纯西医治疗效果不尽如人意，且会对人体造成一定程度伤害，若结合中医疗法，则一方面能增强胰腺低分化腺癌的治疗效果，一方面能减轻毒副作用。胰腺低分化腺癌属于中医“伏梁”、“痞块”、“黄疸”、“积聚”等范畴。其病因、病机主要为七情内伤、饮食不节而致肝脾受损，脏腑失和，湿浊阻滞，气滞血瘀，中医在胰腺低分化腺癌的治疗上多采用疏肝利胆、活血化瘀、清热利湿，破积散结等方法加以治疗，疗效确切。临床资料显示胰腺低分化腺癌的预后不佳，复发转移的比例较高，这一方面与其恶性程度高有关，另一方面也一定程度上与患者治疗后的日常护理不当有关。在饮食上，胰腺低分化腺癌患者宜多吃具有抗癌止痛作用的食物，如核桃、苦瓜、麦芽等；宜多吃抗感染的食物，如橄榄、乌梅、绿豆、苦瓜等；忌油腻及高脂肪食物。此外，也可依靠服用有抗肿瘤及补益作用的中药，以提高免疫力，防止肿瘤复发。
胰腺低分化腺癌使用什么中药好？胰腺低分化癌患者可服用人参皂苷RH2，以提高患者免疫力，减轻治疗的副作用，提高预后，减少复发转移几率。
人参皂苷Rh2治疗癌症机理　　(一)抑制癌细胞增殖　　1.调节肿瘤细胞信号通路系统　　细胞信号通路系统是指细胞接受外界信号，通过一整套特定的机理，将细胞外的信号传导为细胞内信号，最终调节特定基因表达，并引起细胞的应答反应。　　2.影响细胞端粒酶的活性　　端粒酶是一种RNA反转录酶，它能以自身RNA为模版，反转录合成端粒的重要序列。端粒酶是肿瘤的特异标志物。端粒酶活性高，肿瘤细胞活跃。人参皂苷Rh2抑制端粒酶活性，使肿瘤细胞的端粒长度不能维持而进入衰老并最终死亡。　　(二) 诱导肿瘤细胞凋亡　　实验证实Rh2能够通过不同途径诱发脑胶质瘤，肝癌等多种癌细胞凋亡，恢复正常细胞增殖，有效的治疗癌症。　　(三)逆转肿瘤细胞的异常分化　　人参皂苷Rh2就是一种外源性分化诱导剂。它通过诱导分化凋亡，使癌细胞不仅在形态上出现分化改变，而且在功能上也出现了分化改变，最终使癌细胞重新向正常细胞演变，甚至完全转变成正常细胞.它作为肿瘤生物治疗学的一个新领域，已日益受到关注.实验证明，Rh2能够诱导肝癌细胞、黑色素瘤、畸胎瘤、白血病等癌细胞向正常细胞方向逆转。这种癌细胞的逆转不产生任何毒副作用。　　(四)通过提高免疫力达到抗肿瘤目的　　人参皂苷Rh2能够通过多种途径调节和增强机体免疫功能，对免疫系统具有保护作用。人参皂苷Rh2可显著提高IL-2活性，提高巨噬细胞的吞噬功能和NK细胞的杀伤活性，从而发挥抗肿瘤作用。对免疫系统具有保护作用是Rh2优于其他抗肿瘤药物的一大特点。人参皂苷Rh2作为免疫调节因子，还可促进白蛋白、γ球蛋白的合成，提高T细胞和巨噬细胞的功能，因而能抑制肿瘤细胞的增殖，同时还能抑制正常淋巴细胞染色体突变，稳定免疫系统，达到抗肿瘤效果。　　(五)抗肿瘤转移　　恶性肿瘤都具有高增殖性的特点，且容易通过淋巴、血液途径发生转移。主要的转移方式有淋巴转移、血液转移、种植转移。肿瘤转移主要是有新生血管和淋巴管的生成，人参皂苷Rh2能抑制肿瘤新生血管和淋巴管的生成，减少肿瘤转移的可能性。
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发布者：xiaobai
　　现在很多人因为吃的好，所以经常忽略了好的饮食习惯。坏的饮食习惯会给人们带来什么呢？下面请听小编对于胰腺印戒细胞部瘤解析。病例一：病情描述 :　　早期胃体印戒细胞癌，需要几次化疗患者性别:一次）,还需要几次化疗问题回答 :　　您好,手术只能切掉表面肿瘤,而切不掉肿瘤下面的千万条的毛细血管（肿瘤的根基）.所以手术及化疗都只能消除表面肿瘤,不能根治肿瘤,建议患者通过纯天然的中草药巩固治疗效果比较好,对身体不会产生任何的伤害及毒副作用,但治愈的希望也是比较大.祝早日康复! 　　你好,化疗一般是四到六次,因具体病情而定.如果病人身体好的情况下,可以考虑化疗,不过单纯化疗有很大的副作用,常会引起呕吐,脱发,厌食,白细胞降低,免疫力下降等症状,在杀死癌细胞的同时,也杀死了大量的正常细胞,从某种程度上讲,反而促进了癌细胞的生长.建议同时配合服用抗肿瘤的中成药口服液,服用方便,减轻放化疗的副作用,提高免疫力.增强体质,预防复发转移. 病例二：病情描述 :　　低分化腺癌,主要为印戒细胞癌手术化疗后,手,脚发麻.精神状态不好.预后效果怎样问题回答 :　　你好,低分化腺癌恶性程度较高,建议放疗配合中医动态服用中草药综合治疗全面调养,减轻放化疗的毒副作用,增加白细胞,提高免疫力,进行综合治疗,全面调养,有效地杀死癌细胞,并使其排出体外,防止复发和转移扩散等,有效的控制病情,使患者在最短时间内病情得到好转,达到最理想的效果 　　您好：低分化是高度恶性,手术和化疗都不能彻底的根治,患者可以采用纯天然中草药治疗效果比较好,对晚期恶性肿瘤及腺癌都有独特的疗效,而且安全,不会对身体产生任何的伤害及毒副作用,能使患者在短时间内就能看到治疗的效果,治愈的希望也是比较大的. 病例三：病情描述 :　　胃印戒细胞癌晚期且有转移迹象怎么治疗有两年的时间,现在才发现一直以为是胆囊炎所以耽误了能否手术,术后怎么治疗问题回答 :　　你好,癌症晚期应该服用中药全面调理,活血化瘀,清热解毒,软坚散结,中药抗癌效力很强,对于西医没有好办法的晚期癌症中药往往会带来意想不到的效果,改善机体内环境,提高免疫力,有效抑制癌细胞继续生长扩散.,减轻症状和痛苦,延长生命等 　　您好,病人年龄大,而且又是晚期,手术已经失去机会,胃印戒细胞癌对化疗敏感度不高,所以可以采取中西医结合综合治疗,以化疗为基础,配合内生场热疗增强敏感度,提高疗效,再应用中医中药保护病人体质,减轻化疗副作用,这样综合治疗效果好,副作用小,病人可以很好的耐受治疗,从而获得带瘤长期生存的希望.您可以作为参考. 病例四：病情描述 :　　什么是印戒性细胞癌上腹痛，大便成黑色。恶心，呕吐。15天左右，上腹痛。问题回答 :　　你好，不知道具体检查情况如何，肿瘤多大，转移的什么部位了？印戒细胞癌化疗不敏感，治疗方面建议根据病人的具体检查情况,结合患者的身体状况及主要症状,中西医结合综合保守治疗,通过中成药物内服外用及静脉用药配合抗癌中草药方剂等综合治疗,攻调补相结合,在提高免疫力的基础上抑制和杀灭肿瘤细胞,控制病情发展,改善症状,提高生活质量,效果好的话可以使肿瘤逐渐缩小,长期带瘤生存.可以和我们医院联系,提供检查资料,根据检查结果,再给你制定具体的用药治疗方案. 　　你好：就你上面的提问来看不建议西医破坏性大的治疗，建议在此阶段应采用瑶药治疗，可改善症状，增强机体的抗病能力，减少放疗、化疗的副作用，因为瑶药有直接的抗癌作用，用药时可辨证、辨病兼顾，加入清热解毒、活血攻坚、滋阴养血、除痰散结、调补脾胃等方面的药物。希望我的回答给你帮助！ 病例五：病情描述 :　　胃角印戒细胞癌晚期治疗方案患者男 年龄55岁 现在症状 腹胀疼痛没胃口并有腹水问题回答 :　　癌症晚期中医效果较好,因为晚期癌症患者因为癌细胞消耗性大体质虚弱,癌细胞大多已经多处转移,西医局部治疗效果不佳,而且患者也不能耐受手术与放化疗,服用中药可以全面调理机体内环境,补气养血,扶正祛邪,有效控制病情,缓解痛苦,延长生命..建议采用中医动态的疗法治疗。 　　您好,腹水是小便过少引起的,只有肿瘤得到了控制,腹水就会减少及消失,建议患者通过纯天然的中草药治疗,对胃角印戒细胞癌晚期也有特殊的疗效,而且安全,对身体不会产生任何的伤害及毒副作用,能使患者在短的时间内就能看到治疗效果.减轻痛苦,延长生命,提高生活质量.病例六：病情描述 :　　十二指肠降部低分化腺癌，部分呈印戒细胞癌十二指肠降部低分化腺癌，部分呈印戒细胞癌，肿瘤大小2x1.5x1cm,癌组织累及神经，侵及肠壁全层及胰腺组织，未累及胆总管及十二指肠乳头，胃切缘.十二指肠切缘，胆管切缘及胰腺断端均未见癌，十二指肠周淋巴结及胃大弯旁淋巴结均可见转移癌，分别3/3,3/6。免疫组化染色显示;her-1(2请问下一步该怎样治疗？问题回答 :　　病情分析：根据你的描述，一般肠道恶性肿瘤术后只要身体允许，就要尽快安排化疗，可以杀灭远处转移或血管内的癌细胞。指导意见：我认为：只要身体允许，就要尽快安排化疗，可以杀灭远处转移或血管内的癌细胞。　　病情分析：患者诊断十二指肠癌明确，病理为低分化腺癌，部分呈印戒细胞癌，恶性程度高，而且周围组织有侵犯、淋巴结有转移，因此虽然已行手术治疗，但是术后分期较晚，如不行术后辅助化疗，预后较差，很可能出现复发或转移的情况。指导意见：结合患者目前这种，建议行术后辅助化疗，可采用以氟尿嘧啶类药物联合铂类药物的化疗方案。病例七：病情描述 :　　胃窦小弯印戒细胞癌属于恶性肿瘤吗问题回答 :　　建议保守中医治疗。从中医角度讲，中医认为癌是正气不足、气滞、痰凝、血瘀日久而引起的，中医认为治疗癌症要以“软坚散结”为原则，通过祁澳牌红豆杉中药材将硬结打散，可延长生命、减轻痛苦、防止复发转移，最终实现“长期带瘤生存”。现代中药大辞典、东北药用植物志、抗癌中草药等权威药典则明确了它对中晚期癌症的独特功效 　　建议采用中医动态的疗法服中药治疗，通过中药杀死癌细胞，消除肿瘤，调整阴阳平衡，扶正祛邪，标本兼治，消除癌细胞赖以生存的环境，从根本上使人体不再产生癌细胞，达到完全治愈的目的，中国教育电视台和央视网对此法进行了专题报道。 病例八：病情描述 :　　胰腺癌有哪些种类啊？胰腺癌有哪些种类啊？问题回答 :　　（1）胰头癌：胰腺的头部包括乳头和胆管下端，所以有胰头癌、乳头癌和胆管下端癌等名称的区别。（2）胰体癌、胰尾癌：胰体部、尾部之间的界线不可能清楚地划分，故统称为胰体尾癌（3）全胰腺癌：又称胰广泛癌，可由胰头、胰体、胰尾癌进一步发展，也可发病初期即为弥漫性。根据胰腺癌病理类型分类（1）导管腺癌，导管腺癌占胰腺癌的80％～90％，主要由分化不同程度的导管样结构的腺体构成。（2）特殊类型的导管起源的癌，有以下几种。①多形性癌：亦称巨细胞癌，可能为导管癌的一种亚型。②腺鳞癌：偶见于胰腺，可能为胰管上皮鳞化恶变的结果。③粘液癌：切面可呈胶冻状，极相似于结肠的胶样癌。④粘液表皮样癌和印戒细胞癌：在胰腺中偶可见到。⑤纤毛细胞癌：形态与一般导管癌相同，其特点是有些细胞有纤毛。（3）腺泡细胞癌，仅占1％，肿瘤细胞呈多角形、圆形或矮柱形。（4）小腺体癌，为少见类型的胰腺癌。（5）小细胞癌，胰腺的小细胞癌形态上与肺小细胞癌相似，约占胰腺癌的1％～3％。胰腺癌预后极差，越早发现手术成功率越高，但术后也容易恶化，最新的药物比如说人参皂苷Rh2（护命素）适合手术前后及化疗同时服用，能在一定程度上延长患者的生命周期，但胰腺癌总的来说生存期还是很短，作为辅助治疗，效果最好的就是服用人参皂苷Rh2（护命素），能在一定程度上延长患者的生命周期。　　（1）胰头癌：胰腺的头部包括乳头和胆管下端，所以有胰头癌、乳头癌和胆管下端癌等名称的区别。（2）胰体癌、胰尾癌：胰体部、尾部之间的界线不可能清楚地划分，故统称为胰体尾癌（3）全胰腺癌：又称胰广泛癌，可由胰头、胰体、胰尾癌进一步发展，也可发病初期即为弥漫性。根据胰腺癌病理类型分类（1）导管腺癌，导管腺癌占胰腺癌的80％～90％，主要由分化不同程度的导管样结构的腺体构成。（2）特殊类型的导管起源的癌，有以下几种。①多形性癌：亦称巨细胞癌，可能为导管癌的一种亚型。②腺鳞癌：偶见于胰腺，可能为胰管上皮鳞化恶变的结果。③粘液癌：切面可呈胶冻状，极相似于结肠的胶样癌。④粘液表皮样癌和印戒细胞癌：在胰腺中偶可见到。⑤纤毛细胞癌：形态与一般导管癌相同，其特点是有些细胞有纤毛。（3）腺泡细胞癌，仅占1％，肿瘤细胞呈多角形、圆形或矮柱形。（4）小腺体癌，为少见类型的胰腺癌。（5）小细胞癌，胰腺的小细胞癌形态上与肺小细胞癌相似，约占胰腺癌的1％～3％。胰腺癌预后极差，越早发现手术成功率越高，但术后也容易恶化，最新的药物比如说人参皂苷Rh2适合手术前后及化疗同时服用，能在一定程度上延长患者的生命周期，但胰腺癌总的来说生存期还是很短，作为辅助治疗，效果最好的就是服用人参皂苷Rh2，能在一定程度上延长患者的生命周期。病例九：病情描述 :　　什么是印戒性细胞癌上腹痛，大便成黑色。恶心，呕吐。15天左右，上腹痛。问题回答 :　　你好，不知道具体检查情况如何，肿瘤多大，转移的什么部位了？印戒细胞癌化疗不敏感，治疗方面建议根据病人的具体检查情况,结合患者的身体状况及主要症状,中西医结合综合保守治疗,通过中成药物内服外用及静脉用药配合抗癌中草药方剂等综合治疗,攻调补相结合,在提高免疫力的基础上抑制和杀灭肿瘤细胞,控制病情发展,改善症状,提高生活质量,效果好的话可以使肿瘤逐渐缩小,长期带瘤生存.可以和我们医院联系,提供检查资料,根据检查结果,再给你制定具体的用药治疗方案. 　　你好：就你上面的提问来看不建议西医破坏性大的治疗，建议在此阶段应采用瑶药治疗，可改善症状，增强机体的抗病能力，减少放疗、化疗的副作用，因为瑶药有直接的抗癌作用，用药时可辨证、辨病兼顾，加入清热解毒、活血攻坚、滋阴养血、除痰散结、调补脾胃等方面的药物。希望我的回答给你帮助！ 　　对于饮食习惯很多人都不会引起重视，这样就深深的伤害了自己的，相信胰腺印戒细胞部瘤对给大家带来一些帮助。
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