SNP的检测方法(直接测序法与PCR-SSCP)_百度文库
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SNP的检测方法(直接测序法与PCR-SSCP)
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【所属期刊栏目】
摘要汇编_研究方法
（2012年S1期）
【分类号】S858.23
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下载历史：直接测序方法研究浙江汉族人群MICA基因遗传多态性--《浙江大学》2008年硕士论文
直接测序方法研究浙江汉族人群MICA基因遗传多态性
【摘要】：
MICA(主要组织相容性复合体I类链相关基因A)属于非经典的HLA I类分子，基因定位于人类第6号染色体。研究证实MICA与HLA I类分子高度相似，但MICA和经典HLA I类分子存在不同。MICA既不和β2微球蛋白结合，又不提呈抗原肽，但可与NKG2D受体结合调节NK细胞和T细胞功能。MICA和经典的HLA I类分子一样，具有高度的遗传多态性，目前已经报道有64个等位基因。MICA的多态性主要集中在它的2、3、4、5号外显子，部分在1和6号外显子。其中5号外显子比较特殊，它含有不同数目的GCT三联重复序列，目前已经发现至少有八种不同的三联体数目，A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10以及A5．1，A后面的数字代表GCT三联体的重复数目，A5．1代表在A5的第二个(GCT)后面多了一个G。研究报道MICA和一些自身免疫性疾病、肿瘤疾病的发生存在一定的关联，新近研究证明抗供体HLA和MICA抗体均为阴性的患者器官移植效果更佳，存活时间长，但是现在MICA的功能还有许多方面不明确。我们拟建立准确的MICA检测方法，并检测浙江汉族人群的遗传多态性分布，为进一步深入研究MICA功能作用提供基础。目前国内外检测MICA主要为对2、3、4号外显子进行直接测序并结合GeneScan技术检测5号外显子进行分型，或单独采用GeneScan方法对MICA五号外显子多态性分布进行研究，这类方法均存在不能有效区分部分MICA等位基因的问题。本研究我们设计方法对MICA 2-6号外显子进行直接测序，并采用GeneScan方法对5号外显子进行分型，建立了一种系统、全面、准确的MICA基因分型方法，并首次在人群中对5、6号外显子进行了序列分析。我们建立的MICA分型方法完善了以前的分型技术，获得了浙江汉族人群MICA的遗传多态性资料，为进一步研究MICA功能提供了科学基础。
1、标本来源：标本来自自愿无偿献血者，征集同意后采集血样进行研究。标本采集量为EDTA抗凝全血5ml，贮存在-20℃以下待实验。标本总数为100例。
2、标本DNA提取：采用Pel-Freeze DNA商用抽提试剂盒。
3、2-6外显子测序分析
3．1 PCR扩增：引物参照MICA基因序列，采用两对引物分别对2-6外显子进行扩增。其中第1对引物可扩增MICA 2-5号外显子，另1对引物扩增第5、6号外显子。PCR引物序列和扩增条件参照正文，扩增反应体系总体积为25μl。
3．2 PCR产物纯化：每孔中加入核酸外切酶Ⅰ1μl(5U)，虾碱性磷酸酶2μl(2U)，ABI公司的9700型PCR自动扩增仪进行酶切反应，37℃30min，80℃15min。
3．3测序反应：分别针对外显子2、3、4、5、6设计测序引物，进行双向测序。以纯化PCR产物为模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)试剂盒操作进行测序反应，ABI公司9700型PCR自动扩增仪扩增，扩增条件为95℃预变性5min，95℃30s，50℃10s，60℃4min，30个循环，冷却至4℃。
3．4测序反应纯化和电泳分析：采用乙醇／醋酸钠法纯化，然后在ABI 3730测序仪上进行测序电泳分析。
3．5测序结果分析和判断：采用Assign 3．5分析软件和MT Navigator软件进行数据分析，由Assign 3．5软件指定最终结果。
4、GeneScan检测5号外显子GCT重复数量
4．1 GeneSean扩增：引物参照有关文献，正向引物5’端标记有FAM荧光集团。引物序列和扩增条件参照正文，扩增反应体系为20μl。
4．2 GeneScan上机检测：GeneScan扩增产物1：10稀释后，取5μl PCR产物+4．8μl甲酰胺+0．2μl内标充分混匀，95℃4min变性后，在ABI 3730测序仪上进行GeneScan模式分析。
4．3 GeneScan结果分析和判断：采用GengMapper v3．7自动判断结果，根据片段长度大小推测GCT重复次数，并与5号外显子测序结果进行验证。
5、MICA缺失型等位基因检测：采用PCR-SSP的方法，引物参照有关文献，一对引物扩增MICA*Del等位基因的保守序列，另外一对引物扩增人类生长激素的同源保守序列，引物序列和扩增条件见正文，扩增反应体系为10μl。
6、HLA-B位点参照本实验以前建立的检测方法，采用PCR-SBT方法。
7、统计学分析：人群基因频率(gene frequency，GF)采用直接计数法计算，即检测出的基因个数／2N(N=标本数)。单倍型频率(haplotype frequency，HF)和连锁不平衡(LD)计算采用Arlequin 3．01软件进行分析，Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验参照Guo和Thompson的文献，p0．05表示具有统计学意义。
1、测序方法情况：两对引物分别扩增MICA 2-6外显子，可得到很强的特异性条带。双向测序反应后可得到清晰的测序序列，软件可直接自动指定MICA等位基因，建立的测序方法具有可行性。
2、标准序列分析：验证了MICA*019序列，序列已递交GenBank，序列号为EU267602。纠正MICA命名数据库中MICA*019等位基因1个碱基错误(1073bp T→A)，并得到WHO命名委员会的认可。
3、浙江汉族人群中MICA等位基因分布情况：检测到MICA等位基因数目为14个，分布相对比较集中，最常见等位基因为MICA*00801／04。等位基因的频率分别为MICA*0．0％)、MICA*010(18．5％)、MICA*％)、MICA*019(9．5％)、MICA*％)、MICA*027(7．0％)、MICA*％)、MICA*049(3．5％)、MICA*045(1．5％)、MICA*％)、MICA*％)、MICA*Del(1．0％)、MICA*004(0．5％)、MICA*％)。MICA等位基因分布数据统计分析，观察杂合度为0．83，预期杂合度为0．84，p=0．75。
4、浙江汉族人群中MICA等位基因5号外显子STR分布情况：共发现五种重复数量：A4、A5、A5．1、A6、A9和缺失型。A5频率(35％)最高，其次是A5．1(28．5％)、A9(15．5％)、A6(12．5％)、A4(7．5％)、MICA*Del(1．0％)。STR分布数据统计分析，观察杂合度为0．74，预期杂合度为0．749，p=0．96。
5、HLA-B基因分布情况：检测到40种不同的等位基因，分别为B*％)、B*4601(9％)、B*％)、B*％)、B*1502(6％)、B*1501(5％)、B*％)、B*％)、B*0702(3％)、B*1511(3％)、B*4006(3％)、B*5401(3％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*3701(2％)、B*3901(2％)、B*4402(2％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*2705(1％)、B*4801(1％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)、B*％)。HLA等位基因分布数据经过统计分析，观察杂合度为0．97，预期杂合度为0．95，p=0．33。
6、MICA和HLA-B单倍型频率及其连锁情况分析：采用Arlequin软件分析后得到58种单倍型，单倍型频率分布比较离散(以MICA*00801表示MICA*00801／04)。分别为MICA*00801-B*％)、MICA*010-B*％)、MICA*00201-B*％)、MICA*019-B*％)、MICA*00801-B*％)、MICA*010-B*％)、MICA*049-B*％)、MICA*01201-B*％)、MICA*00901-B*％)、MICA*010-B*％)、MICA*027-B*％)。MICA*00201-B*3501、MICA*00201-B*3802、MICA*00801-B*0702、MICA*00901-B*％；MICA*01201-B*5502、MICA*00801-B*3701、MICA*00801-B*％。MICA*00201-B*3503、MICA*00801-B*0801、MICA*00801-B*3901、MICA*00802-B*0705、MICA*010-B*1527、MICA*019-B*2704、MICA*027-B*％；MICA*Del-B*4801、MICA*019-B*1501、MICA*00901-B*4403、MICA*00901-B*5102、MICA*045-B*％；MICA*00201-B*3505、MICA*00201-B*3801、MICA*00201-B*3901、MICA*00201-B*5201、MICA*00201-B*6701、MICA*004-B*4403、MICA*00701-B*1301、MICA*00701-B*2705、MICA*00801-B*2706、MICA*00801-B*5502、MICA*00801-B*3905、MICA*00801-B*4002、MICA*00901-B*4001、MICA*00902-B*5001、MICA*010-B*1505、MICA*010-B*2705、MICA*010-B*2707、MICA*010-B*8101、MICA*019-B*4001、MICA*019-B*4002、MICA*019-B*4601、MICA*019-B*5102、MICA*027-B*1502、MICA*027-B*1513、MICA*027-B*1527、MICA*027-B*4601、MICA*027-B*5101、MICA*045-B*1302分别为0．5％。连锁不平衡分析显示：MICA*00801-B*4001(D=0．081，D’=0．890，r~2=0．31，X~2=61．24，p0．001)、MICA*010-B*4601(D=0．063，D’=0．863，r~2=0．32，X~2=65．00．p0．001)、MICA*00201-B*5801(D=0．055，D’=1．000，r~2=0．38，X~2=75．80，p0．001)、MICA*019-B*1502(D=0．045，D’=0．899，r~2=0．45，X~2=89．73，p0．001)、MICA*00801-B*1302(D=0．028，D’=0．848，r~2=0．092，X~2=18．31，p0．001)、MICA*010-B*1501(D=0．031，D’=0．755，r~2=0．13，X~2=26．41，p0．001)，呈现高度连锁。频率小于4．0％的单倍型连锁分析数据见正文。
7、MICA5号外显子GCT重复数量与HLA-B基因关联性分析：采用Arlequin软件分析后得到48种单倍型，单倍型频率分布比较离散，分别为A5．1-B*％)、A5-B*4601(9％)、A9-B*％)、A5-B*％)、A6-B*％)、A5-B*％)、A5.1-B*1302(4％)、A4-B*5401(3％)、A5-B*1511(3％)、A5-B*4006(3％)、A6-B*5201(3％)、A5．1-B*％)、A9-B*％)、A9-B*％)、A4-B*5502(2％)、A5-B*1527(2％)、A5-B*％)、A5．1-B*3701(2％)、A5．1-B*％)、A4-B*％)、A5-B*％)、A5．1-B*％)、A5．1-B*％)、A5．1-B*％)、A6-B*％)、A6-B*％)、A9-B*％)、A5-B*5101(1％)、Del-B*4801(1％)、A4-B*％)、A4-B*％)、A5-B*％)、A5-B*％)、A5-B*％)、A5-B*％)、A5-B*％)、A5-B*％)、A5．1-B*％)、A5．1-B*％)、A5．1-B*％)、A5．1-B*％)、A6-B*％)、A6-B*％)、A9-B*％)、A9-B*％)、A9-B*％)、A9-B*％)、A9-B*％)。连锁不平衡分析显示：A5．1-B*4001(D=0．079，D’=0．888，r~2=0．28，X~2=56．54，p0．001)、A5-B*4601(D=0．059，D’=1．000，r~2=0．18，X~2=36．73，p0．001)、A9-B*5801(D=0．055，D’=1．000，r~2=0．38，X~2=75．80，p0．001)、A5-B*1502(D=0．036，D’=1．000，r~2=0．11，X~2=21．62，p0．001)、A6-B*5101(D=0．047，D’=0．824，r~2=0．33，X~2=66．11，p0．001)、A5-B*1501(D=0．033，D’=1．000，r~2=0．098，X~2=19．55，p0．001)，呈现高度连锁。频率小于5．0％的单倍型连锁分析数据见正文。
8、MICA缺失型等位基因检测：在浙江汉族100例标本中，2例携带HLA-B*4801的标本MICA缺失型等位基因阳性(阳性率为1％)，其它98例标本均未检测出MICA*Del。在另外有选择性的8例HLA-B*4801标本中，有6个标本含有MICA*Del。结果证实在浙江汉族人群中存在MICA等位基因缺失型，并且缺失型与HLA-B*4801高度关联。
1、本研究建立的MICA2-6外显子测序方法和GeneScan技术检测5外显子是可行的。
2、验证了MICA*019等位基因，得到WHO命名委员会的认可。
3、获得了浙江汉族人群MICA基因遗传多态性数据。
4、在等位基因水平获取了MICA-HLA-B连锁遗传数据。
5、在等位基因水平获取了MICA STR-HLA-B连锁遗传数据。
6、证实中国人群中存在MICA等位基因缺失，并与HLA-B*4801关联。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：R450【目录】：
中文摘要4-9
英文摘要9-17
实验材料19-23
技术路线23-25
实验方法25-36
参考文献58-61
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京公网安备75号基因型用什么方法可以测定?(基因型,基因,直接测序,重复序列) - PCR实验 - 生物秀
标题: 基因型用什么方法可以测定?(基因型,基因,直接测序,重复序列)
摘要: [基因型用什么方法可以测定?(基因型,基因,直接测序,重复序列)] 我目前做有关基因多态CA重复序列的课题?在测CA重复长度时可以用直接测序的方法,但分析基因型时用什么方法呢?谢谢各位了! 关键词:[基因型 基因 重复序列 直接测序]……
我目前做有关基因多态CA重复序列的课题?在测CA重复长度时可以用直接测序的方法,但分析基因型时用什么方法呢?谢谢各位了!
参考一篇关于肝炎病毒基因分型的方法：3.1.1 限制性片段长度多态性RFLP［16］ 先以PCR扩增HBV“S”基因的Pre-S区，再以一组能区分HBV基因型的限制性内切酶消化扩增产物，电泳后，根据酶切图谱进行分型［17］。与其他分型方法相比，RFLP是目前临床最常用的HBV分型方法，其方法简单且易于操作，但HBV分子进化(Molecular Evolution)速率很快，其基因组的变异常导致分型错误甚至无法确定型别。 3.1.2 型特异性引物PCR　如简单化的PCR（Simplified Polymerase chain reaction）［18］。Naito等［19］用型特异性引物多重PCR分型方法是针对各基因型的保守区设计特异性引物进行两次或一次PCR扩增HBV S1-S基因。第一轮PCR反应把HBV的所有型别扩增出来。第二轮PCR反应是在一个反应体系中将区分各型的引物混合进行扩增，得到不同长度的相应基因型产物，经电泳分析确定，从而达到分型的目的。该方法特异性较高，结果可靠，不足之处是容易出现非特异性扩增，不利于结果的判断；Kirschberg等［20］直接采用多重PCR，用不同基因区设计的6对特异引物，经一次扩增，即能检测A-F各基因型，灵敏度达到104拷贝数/ml。 3.1.3 型特异性探针核酸杂交分析　如差异杂交（Differential Hybridization）［21］；Kato等［22］用了GSPA（genotype-specific probes assay），即型特异性探针分析技术对HBV进行分型，在Pre-S1区设计引物、分型探针和对照探针，随后进行核酸杂交，最后对S区进行测序以便进一步确认；LiPA（INNO-LiPA HBV genotyping assay）盒是比利时innogenetic公司生产的商品化的HBV基因分型盒，其原理是用型特异探针区别不同基因型的HBV，它是一种基于核酸杂交技术的HBV基因分型方法，该试剂盒具有简单、方便、直观、好用的特点，能快速检出病人所感染的HBV基因型别，适合临床推广应用。其原理是先PCR扩增HBV前S1基因，再将产物与固定在膜条上的各基因型特异探针杂交，根据杂交带谱的位置，判读结果。该法可检测A-H各型，对混合型的检出，比测序更优越［23］。 3.1.4 直接序列分析　如基于序列的系统发生分析（Sequence-based phylogenetic analysis）［15］；全基因组序列分析是PCR扩增HBV全基因DNA，测序和种系进化统计，分析不同病毒株之间的亲缘关系，得出各病毒株的型别。该方法目前获取信息最多，最为可靠，是分析和确定新基因型或不同基因型重组的唯一的、最准确的方法，也是考核其他分型方法的金标准。但费时、费事、成本较高不能大量检测和临床应用、敏感性有限且成本较高，不利于临床推广应用。对一些混合基因型的感染无法正确分型或检测［10］。 3.1.5 血清学方法　Usuda等［24］研制了一组HBV前S2和S区表位的单克隆抗体，能区分A-F 6种基因型，能用ELISA方法检测相应的HBV基因型。临床实践中选择一个合适的基因分型检测方法进行流行病学调查或检测也必须考虑方法的可靠性。这些方法除直接序列分析外，被检部位（如酶切位点，与抗体结合的或与引物3′端或与探针结合的部位）若出现新的点突变，结果有可能出现分型错误或失败。其他方法只能检出已知的基因型，不能发现新的基因型，对新近确定的基因型，如G和H型，大多不能检出，需要重新设计建立新方法。如RFLP和差异杂交的分析方法是、最常见且操作简单的检测方法，但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现RFLP酶切位点的变化——出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失，导致分型失败或错误。分析病毒的最准确的方法仍是快速积聚有关基因组全序列的信息。随着测序技术的不断进步，成本降低，今后的自动测序技术能进行重复、敏感和廉价的测序分析，有望成为临床实验室的常规手段。补充：snp技术，用于基因分型研究较多。回复你做的是CA重复序列的课题，我觉得你得用微卫星的方法。微卫星DNA的定义核心序列为1-9（通常认为2-6）个核苷酸，连续重复5次以上，但重复序列总长度一般在500bp之内的DNA序列。SSR的分类根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：完全型(perfect)。指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的ＤＮＡ。如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT不完全型(imperfect)。指在ＳＳＲ的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT复合型(compound) 。指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA3种类型中完全型是ＳＳＲ标记中应用较多的一种类型。SSR在植物基因组中的分布
SSR广泛分布于各种真核的基因组中，大约每隔10～50ｋｂ就存在一个SSR。哺乳动物(mammalian)中的SSR的数量大约为植物中的5～6倍。在植物中，平均23.3ｋｂ就有一个SSR；双子叶植物中的SSR数量大于单子叶植物，前者两个SSR之间的平均间距为21.2ｋｂ，后者为64.6ｋｂ；核ＤＮＡ中的SSR数量多于细胞质ＤＮＡ中的SSR，绝大多数单碱基重复型及2碱基重复型SSR存在于非编码区，3碱基重复型多位于编码区。微卫星的利用价值由于核心序列重复数的不同，等位的SSR位点可呈现出多态性（SSLP，simple sequence length polymorphism）。大多表现为共显性遗传，有的表现为显性遗传。由于SSR DNA两侧序列（离开20bp以上）表现出保守特征，所以可设计出上下游PCR引物，扩增出包含SSR的DNA序列。微卫星分析常用于：遗传图谱构建；种质鉴定；遗传多样性分析；标记辅助选择（MAS，marker- assistant seletion，marker- aided seletion）；基因定位；数量性状基因座（QTL）分析；系谱分析；亲源关系鉴定等。SSR引物的来源借鉴其他近缘种序列。通过筛选文库、测序开发自己的SSR引物。通过核酸数据库查询，从已有序列中搜寻包括SSR的序列并设计引物。SSR分析实验的主要技术环节提取DNA；PCR扩增；电泳及显色；电泳胶板带型的照相、记录；数据分析处理。其中，PCR产物分离的电泳方法主要有：高浓度琼脂糖电泳（4%胶只能分辨4-6bp差异）；变性聚丙烯酰胺序列胶电泳；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 由于扩增的片段短(一般小于300ｂｐ)，基因间的差异小(一般为几个ｂｐ)，故通常使用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳。在程序上，变性胶虽然比非变性胶麻烦些，但考虑到在非变性胶上会出现人为假象—异源双链分子，比如导致SSR杂合子中出现3-4条带，而不是正常的2条带，从而干扰等位位点统计，因此我们建议在SSR分析中均采用变性胶电泳。PCR扩增产物显色方法有：同位素放射性自显影法；荧光染料标记法；溴化乙锭（ＥＢ)显色法；银染法（目前多用此法）。回复还有一些相应的原理：微卫星DNA标记(microsatellite DNA)是近十多年发展起来的一种新型的分子遗传标记。它具有数量大、分布广且均匀、多态信息含量高、检测快速方便等特点，目前被广泛应用于动、植物基因定位、连锁分析、血缘关系鉴定、遗传多样性评估、系统发生树构建、标记辅助选择等方面。微卫星，又称短串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)，广泛随机地分布于真核基因组中，在DNA序列中平均每6kb就可能出现一个，约占人基因组的10%，其基本构成单位(核心序列)为1-6bp，呈串联重复排列而成。按核心序列碱基数不同可分别称为单二、三、四、五或六核苷酸，碱基组成分别有2(A/T,C/G)，4(AC/TG, AG/TC, AT/TA, CG/GC)10，102和350种。人类基因组中以(CA/GT)n，简称(CA)n重复序列最多，总共约有5×104-105个，即平均每6-60kbDNA就存在一个(CA)n，重复次数约15~16次；相应地，大鼠平均为18kb，小鼠平均为16kb，绵羊平均65kb(Crawford等，1995)。与其它DNA多态标记一样，微卫星DNA呈孟德尔共显性方式遗传(Winter, 1992)。Weber(1990)按照重复结构的不同，把微卫星标记分为完全重复型(perfect)、不完全重复型(imperfect)和复合型(compound)三种。完全重复型指由不中断的重复单位构成的微卫星；不完全重复型指重复单位中间有3个以下的非重复碱基，且其两端不中断的部分重复数大于3; 复合型指微卫星两端或两类以上的串联重复单位由不多于3个连续的非重复碱基分隔开，但各不中断的重复单位的重复数大于或等于5。关于微卫星的产生机理，多数学者认为是DNA复制和修复过程中的滑动错配或染色体减数分裂时姊妹染色单体不均等交换的结果(Tachida等，1992; Tautz等，1984)，微卫星在基因组中的功能尚不清楚，已发现微卫星能参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程，有自身特异结合蛋白，尚能直接编码蛋白质，是一种非常活跃的碱基序列，微卫星核心序列是高度保守的，它与希氏大肠杆菌(Escherichia coli)的Chi序列相似，揭示微卫星核心序列可能是与重组有关的蛋白质连接位点。微卫星可直接编码蛋白质，如脆性X综合症基因内(CGG)n串联重复，编码30个精氨酸；(CAG)n是人类基因库DNA序列外显子中发现最多的一种。另外，微卫星在促进染色体凝集，维持染色体结构等方面也有作用，可参与染色体折叠、染色体端粒形成等。(CA/GT)n、(GATA)n可能与致育性、性别分化、X染色体失活有关。微卫星DNA PCR扩增的高度灵敏性、高度特异性使得微卫星的检测十分方便而且准确。传统的方法是将PCR产物在非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行基因分型。对于荧光素、或生物标记的引物，可以采用其相应的显示方法，而对不带标记的引物可以银染后观察结果。荧光标记自动测序技术的发展使得微卫星的基因分型变得快速、准确，从而大大地提高了微卫星标记分型效率和准确率，同时节约了实验成本和时间，使得应用微卫星进行了大规模基因组扫描成为可能。微卫星具有很多优点，然而如何获得所需要的微卫星位点，一般有以下两种方法：一种是利用微卫星位点的保守性，从微卫星数据库中搜索出某物种已知微卫星引物，然后以相近物种的基因组总为模板，用已知引物进行扩增并进行多态性分析，再对特异扩增产物进行测序，从而获得适合另一物种的高度多态的微卫星位点。另一种方法则是直接从基因组文库中筛选微卫星位点。近年来，“随机扩增微卫星DNA多态性”法和借助染色体显微切割等手段使得新微卫星位点的发现效率更高，更为简单。回复非常感谢liuqianghare 与hwclove的帮助!回复不知道楼上的楼上有没有做过相关的实验
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