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广州地区育龄期女性阴道菌群多样性分析
研究目的:　　1、阐述中国广州地区育龄期一般女性人群的阴道菌群特征及阴道pH≤4.5和pH＞4.5中微生物群落的多样性，通过分析pH≤4.5组和pH＞4.5组的α、β多样性以及菌群构成，用LEfSe在线工具寻找两组中有统计学差异的taxa，进一步展示一般女性阴道菌群多样性。　　2、揭示特殊女性群体性工作者阴道菌群菌群特征，通过分析女性性工作者与一般女性人群阴道菌群的α、β多样性以及菌群构成，并用LEfSe寻找两组中有统计学差异的taxa，比较女性性工作者与一般女性人群阴道菌群的差异。　　3、探究阴道菌群随着月经周期的改变是否相对稳定。通过对月经周期阴道菌群的α、β多样性及和阴道菌群的稳定性和弹性分析，探讨随着月经周期改变阴道菌群的变化。　　研究方法:　　第一章　　2014年07月～2014年08月，招募在南方医科大学南方医院健康体检中心进行常规体检的女性志愿者，在常规妇科体检前，告知其研究方案及意义，得到其同意并配合进行采样及相关信息问卷。由经验丰富的妇产科医生，使用窥阴器撑开阴道，在肉眼直视下，使用一次性棉签拭子，采集后穹窿部位阴道分泌物，同时采集三个平行样品。按照入组标准和排除标准，共纳入志愿者99人，年龄19-52岁。采集的样品暂时存放于带有冰盒生物样品运输箱，在4小时内转移至-80℃低温冰箱保存，直到提取样品中细菌的总DNA。使用细菌16S通用引物，PCR扩增阴道拭子样品的16S rRNA V46保守区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq2000平台进行PE100-bp测序后，得到高通量下机原始数据序列，采用QIIME流程分析一般女性阴道菌群特征和pH≤4.5组和pH＞4.5组不同pH的α、β多样性和使用在线统计分析工具LEfSe寻找两组中有统计学差异的taxa。生物信息学分析主要包括操作分类单元（Operational Taxonomy Units，OTU）的生成及主成分分析(Principal Coordinate Analysis，PCoA)、假设验证分析、进化树分析及菌群特征性分析、菌属丰富度分析、群落结构多样性分析等。具体流程为使用BIPES进行序列预处理，UEARCH去嵌合体，然后Uclust(USEARCH)做聚类，我们将UCLUST算法相似度参数设定为0.97，表示序列相似度达到97％即可将其归属为同一个OTU。再挑选代表序列，与数据库比对后，用RDP分类器将相似度为97％的序列归到同一种属。通过对代表序列做比对，建系统发育树，综合信息生成BIOM格式的最后进行alpha，beta等一系列后期的分析。Chao1、PD_Whole tree、Shannon、Observed_speices等指数用来评估样品的α-多样性。基于PCoA，分析β-多样性，即不同个体之间的生态距离。应用SPSS20.0统计软件进行统计分析，两组间的比较符合正态分布的采用两独立样品的t检验，不符合正态分布的采取非参数检验K组比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　第二章　　2013年05月，在广州市某区卫生部门及当地疾病预防控制中心(Center forDisease Control and Prevention，CDC)性病艾滋病防治科的协调和配合下，招募了提供商业性服务女性性工作者进入队列。邀请了性病艾滋病防治科的部分工作人员参加了现场调查取样工作，他们主要负责前期宣传和研究对象招募等工作;本实验室部分人员主要负责进行问卷访谈、标本采集和运输以及数据录入等工作。在研究开始之前对所有的现场工作人员都进行了保密原则、项目特定实施程序以及接受关于人类研究对象保护知情同意过程的培训。　　样品采集、DNA提取、PCR扩增、PCR产物质控测序、PCR产物测序和数据处理与“第一章”相同。我们采用BIPES分析流程分析女性性工作者阴道菌群特征，比较健康体检中心进行体检的一般女性(Physical Examination Women，PEW)和提供商业性性服务的女性性工作者(Commercial Sex Worker，CSW)两组人群阴道菌群的α、β多样性和使用LEfSe寻找两组中有统计学差异的taxa。　　第三章　　招募了14位未婚、自述健康的育龄期广州某高校女大学生加入月经周期阴道菌群变化的纵向研究。研究对象在至期间个人进行样品收集。研究对象每隔两天使用一次性棉签拭子在阴道下1/3处轻轻旋转至少十次，然后转移至-80℃低温冰箱保存，在所有样品收集完成后转移至南方医科大学公共卫生与热带医学学院环境卫生系实验室进行细菌总DNA提取。使用细菌16S通用引物，PCR扩增阴道拭子样品的16S rRNA V4保守区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq2000平台进行PE100-bp测序后，得到高通量下机原始碱基序列，采用QIIME分析流程分析随着月经周期阴道菌群是否保持稳定。应用SPSS20.0统计软件进行统计分析，多组计量资料的比较应用One-WayANOVA，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　研究结论:　　一、广州地区女性阴道菌群主要分为五类，其分别以1.L.iners为主要优势菌;2.L.crispatus为主要优势菌;3.L.gasseri为主要优势菌;4.L.crispatus与L.iners同为优势菌;5.Atopobium，Sneathia，Prevotella和Gardnerella等厌氧菌的一种或两种为主要优势菌。　　二、pH≤4.5的阴道菌群中多以Lactobacillus为优势菌，阴道pH＞4.5时则严格厌氧性细菌比例较高。　　三、阴道菌群受行为习惯和生活方式影响较大，一般人群和性工作者、不同服务场所性工作者的阴道菌群结构存在差异。　　四、阴道菌群随月经周期的变化出现波动，波动的大小因人而异，在月经期阴道菌群波动最为明显，优势菌群在月经周期中呈现相互交替或保持绝对优势的变化模式。
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Illumina高通量测序分析人结肠恶变组织黏膜菌群变化
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