DNA提取液的配制 - DNA技术 - 生物秀
标题: DNA提取液的配制
摘要: DNA 是遗传物质, 植物DNA 的提取是植物基因工程的基础。通常要求所提取的DNA 要有理想的纯度,足够完整,无断裂降解,提取过程尽量少使用有毒化学品等。为了达到上述要求,已报道了不少提取植物DNA 的方法,归纳起来,主要有CTAB 法、SDS法和碱提取法。DNA分子是分子生物学研究的基本材料, 依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。……
1 明确提取液的配制原理
2 通过对提取液的配制，掌握提取液中各试剂在提取中的作用。
&DNA 是遗传物质, 植物DNA 的提取是植物基因工程的基础。通常要求所提取的DNA 要有理想的纯度,足够完整,无断裂降解,提取过程尽量少使用有毒化学品等。为了达到上述要求,已报道了不少提取植物DNA 的方法,归纳起来,主要有CTAB 法、SDS法和碱提取法。DNA分子是分子学研究的基本材料, 依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。因此提取液里试剂的配比也有所不同：植物DNA的抽提常采用CTAB方法：
配方如下：
1 配制提取液之前，先配制母液。
&母液（灭菌）：5M NaCl ( 58.4g加ddH2O制成200ml溶液)
0.5M Na2-EDTA(37.22g+ddH2O至200ml,用NaOH调pH值为8.0)
1M Tris-HCl(12.11gTris-HCl+ ddH2O至100ml,用浓盐酸调pH值至8.0)
2 提取液配方
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 100ml
&加入：CTAB粉剂&&&&&&&&&&&&&&&&& 2g&&&&&&&&
&&&&&& 1M Tris(pH8.0)&&&&&&&&&&& 10ml
&&&&&& 0.5M EDTA(pH8.0)&&&&&&&&& 4ml
&&&&&& 5M NaCl&&&&&&&&&&&&&&&& &&28ml
&&&&& &PVP&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 1g&&
&&&-巯基乙醇&&&&&&&&&&&&&&& 1ml
& 加双蒸水定容至100ml
分别量取苯酚、氯仿、异戊醇按25：24：1的体积比混合，再分别量取氯仿、异戊醇按24：1的体积比混合，配制成两种抽提液，各配制100ml
4&& 0.1xTE
1mlTris，20&l EDTA中加H2O, 用HCl调pH至8.0, 定溶，灭菌
三、实验器材
&烧杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、吸管、移液枪、离心管、冰箱、高压灭菌锅、电子天平、洗瓶
四、实验试剂
蒸馏水、CTAB、NaCl、EDTA、Tris-HCl、&-巯基乙醇、0.1xTE、RNase酶、苯酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇
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DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
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碱裂解法原理
在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型
DNA提取过程中各种
的作用及原理
溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的&-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解
而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖
的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
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