影响DNA提取质量的因素 - 实验交流 - 生物秀
标题: 影响DNA提取质量的因素
摘要: 影响DNA提取质量的因素给大家贡献点资料！！！影响DNA提取质量的因素1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中 关键词:[降解 福尔马林 固定剂 分子量 核酸 乙醇 氢键]……
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影响DNA提取质量的因素
1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。Barmwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel"s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量得明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg，高于新鲜标本（19.4/mm3）。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特性卫星带，说明DNA被完全消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至－20℃过夜。然后再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2－3h，石蜡包埋。结果显示，每10mgAMex法处理的温重组织提得高分子量DNA71.4?4.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4?3.76μg）。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对开矿学、免疫表型和基因改变的相关分析。2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生的，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定时是一个重要的变异因素。然而，Goelz等，没有发现固定时间对DNA提取量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8％。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30％，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应模索选定。根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110h之内。3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接的互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时，产生两条单链分子。最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构改变。当pH达到2.5惟下时，几乎所有碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N－糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最多，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而，既使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量晨100bp－10000bp之间，主要分布于100－1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关以外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短下一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的地间长短不一。虽然本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA弯性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。回复:
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电话：021-PCR实验操作的影响因素 -
PCR实验操作的影响因素
点击标题下「蓝色微信名」可快速关注审核者：关宝生发布者：王健宇聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction-PCR)是美国PE-Cetus公司的科学家K.B.Mulis于1985年发明的一项可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的新技术[1]。它通过变性、退火和延伸三个步骤循环往复来实现DNA在体外大量、迅速的扩增。随着科学技术不断发展，PCR技术已经在多个学科和领域得到了广泛的应用，如在基础医学、预防医学和床医学等方面。PCR技术具有重复性好、产率高、快 速和简便等突出优点,是生物医学领域中的一项重要的实验技术。由于PCR实验技术的高敏感性，实验操作人员细微的错误操作便可导致实验结果失之千里。1DNA样本提取过程中的影响因素1.1 DNA样本提取操作区污染DNA样本的提取是PCR实验顺利进行的重要步骤一。由于PCR实验灵敏度极高，在实验过程中样本微量的变化便可导致整个实验的失败。样本DNA的提取过程中几种常见错误：①在DNA样本提取过程中混入了其他样本DNA，会导致电泳时假阳性或假阴性结果的出现；②若在DNA样本提取过程中混入了RNA，则会导致电泳时产生涂抹条带（见图1）；所以，在DNA样本的提取过程中，避免实验操作过程中的污染是必要的，应做到DNA样本提取区、PCR反应液配置区、PCR扩增区以及电泳区严格分开，确保PCR实验准备过程与PCR扩增产物有关的一切操作完全分开，从而避免扩增产物与其他实验试剂相接触造成交叉污染。图1 DNA样本提取过程中混入了RNA和二次洗脱产物电泳对比图注：A和C为同一样本，A为初次洗脱的DNA样本，C为二次洗脱的DNA样本。B在提取过程中受到同实验室RNA提取物的污染。1.2 DNA样本的质量我们所使用的DNA提取试剂盒是由碧云天公司生产的基因组DNA小量抽提试剂盒（纯化柱式），因二次洗脱可以获得第一次洗脱时50%-80%的DNA量，同时获得较多量的DNA对于PCR实验比较重要，我们采用二次洗脱以增加DNA产量。DNA样本的纯度和含量将影响电泳后条带的明亮程度（见图1），经二次洗脱得到的DNA样本，电泳后条带亮度略微发淡，与首次洗脱得到的DNA样本比较，条带亮度有明显的差别。所以DNA浓度越高，扩增产物量越大，电泳后条带越亮。在我们的研究中，二次洗脱DNA样本主要用于验证DNA提取质量以及实验初期条件的摸索。1.3 DNA样本的存储根据实验需要提取的DNA样本应作分装处理，近期实验用少量DNA样本冻存于-20℃冰箱中，其余样本放入-80℃低温冰箱留存待用；DNA样本切忌反复冻融，若DNA样本长期存放于-20℃环境或实验过程中反复多次冻溶，则易发生降解，从而造成PCR扩增后产物在电泳时产生涂抹条带或者没有条带，导致阳性检出率降低等结果。2PCR扩增过程中的影响因素2.1 PCR引物设计PCR引物是一段寡核苷酸片段，它能与待扩增的目标DNA互补，引物的设计是PCR操作过程成功与否的先决条件。进行引物设计时模板选择有两种情况：一种是扩增已知基因，这时需要在Gene Bank数据库中搜索相同物种该基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物；另一种是扩增未知基因，需根据比较基因组定位的原理，选择研究深入的高等动植物保守的功能基因的DNA或者mRNA序列为模板来设计引物[2]。引物长度一般在15-30个碱基之间，常用的是18-27 bp；有研究显示，长度为17个碱基的寡核苷酸序列在人类基因组中可能出现的概率为一次，所以，只要引物不少于16个碱基，就能保证PCR扩增序列的特异性[3]；但长度不宜大于38个碱基，因为序列过长会导致其延伸温度大于74℃，不利于Taq DNA聚合酶反应的进行；引物GC含量应该在40%-60%之间，过高或者过低都不利于反应的进行。PCR引物设计通常借助软件进行，其功能主要体现在两个方面：①对引物分析及评价功能，但该功能只有少数商业版软件能够做到，以“Oligo6”软件功能最优秀；②引物的自动搜索功能，根据笔者使用体验，自动搜索功能以“PremierPrimer”软件为最好，且更方便；“Oligo6”软件功能次之；还有很多软件拥有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到好的DNA引物，笔者建议在自动搜索的基础上辅以人工分析，选择最佳设计方案，然后再送交生物技术公司进行合成。在PCR反应配液过程中，引物最适浓度一般为0.1-1umol/L。引物浓度过低会导致PCR过程无法完成三十个循环，使PCR产量降低。过高则会引起非特异性扩增从而在电泳结果中呈现出杂带。2.2 Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是1988年Saiki等从美国黄石国家公园的温泉中分离的一种水生栖热菌株（Thermus aquaticus, Taq）中提取得到一种耐热DNA聚合酶[4]，与之前的大肠杆菌DNA聚合酶相比较，具有耐高温、不容易被钝化和扩增特异性较高等特点，且不需要在反应过程中不断添加聚合酶以满足每次扩增的需要。水生栖热菌的最适生长温度为70℃-75℃，因此Taq DNA聚合酶合成DNA常用温度为72℃。与此同时Taq酶是Mg2 依赖性酶，所以PCR反应中还要单独补Mg2 。DNA聚合酶对PCR反应影响较大，酶的活性或酶的浓度等变化都会对PCR反应结果造成影响。如果酶失活，将会导致在电泳后假阴性结果的出现，所以在实验过程中笔者建议新酶和旧酶一起使用，便于检查酶的活性。酶的最适浓度为总反应体系1%-2.5%，在此范围内，酶量越多扩增产物越多，但是超过此范围，若酶量过多则会导致非特异性扩增，过少则产物量不足。2.3镁离子（Mg2 ）Mg2 是Taq酶的必需激活剂，聚合酶的活性对Mg2 浓度异常敏感，浓度越高、酶的活性越高，PCR扩增产物浓度就越高；反之，Mg2 浓度越低PCR产物浓度也就越低；但是Mg2 浓度应维持在一定范围内（一般Mg2 浓度以高于dNTP总浓度0.5-2.5mmol/L为适宜），若过高会造成非特异性扩增产物，或者电泳结果产生片状带或涂抹带，同时还有可能造成电泳条带亮度减弱，原因可能是MgCl2是盐，浓度过大会减弱扩增条带亮度[5]。2.4 d NTPsdNTPs包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP，是PCR扩增的原料，随着PCR反应的进行，dNTP各组份的含量会不断减少。四种dNTP在反应液中要保持浓度相等，以免造成错配。dNTP浓度应为50-200umol/L，当dNTP浓度过高时，会导致Taq酶失活，从而导致假阴性结果，还会造成片状带或者涂抹带；但是浓度过低又会影响PCR扩增产物的产量。实验室常用的dNTP一般从生物技术公司购买，dNTP对反复冻融比较敏感，所以笔者建议对该试剂进行分装，后冻存于-20℃冰箱中，以保证其活性。2.5退火温度退火阶段是DNA单链与引物相结合的过程，退火温度则是该阶段的最佳温度。退火温度和时间的确定基于引物的长度、浓度和碱基的组成。一般来说，退火温度需要比引物解链温度低5℃；退火温度越低，PCR扩增产物浓度越高，但是引物与模板错配也会增多，会出现非特异性扩增，还会造成片状带或涂抹带；若退火温度过高，会导致PCR扩增产物浓度降低，甚至导致假阴性结果的出现。3琼脂糖凝胶电泳的影响因素琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物检测常用的方法，电泳的各个要素对结果也有很大的影响。琼脂糖凝胶的质量和浓度对电泳结果有一定的影响，不同的琼脂糖浓度有不同的分辨范围。笔者实验室常用的为1%的琼脂糖，制备方法为取1g琼脂糖溶于100mL电泳液中，使用微波炉加热至琼脂糖完全溶解、溶液呈透明，然后冷却至70-80℃左右，再进行倒胶，此时应注意尽量轻柔；动作幅度过大会导致气泡的产生，进而影响电泳结果；若琼脂糖凝胶冷却后分布不均匀，则有可能造成条带的扭曲；若琼脂糖质量不好也有可能造成条带扭曲。如笔者实验过程中使用过两种琼脂糖，一种是碧云天生物技术研究所的进口分装琼脂糖，另一种是西班牙进口分装的琼脂糖，前者在电泳中便会导致条带不清晰，条带扭曲等现象。3.1电泳缓冲液电泳缓冲液常用的有TAE、TPE和TBE，以上三种缓冲液的分辨率大致相同。电泳缓冲液一般情况下是可以重复使用的，但电泳液如果出现沉淀或产生泡沫时应及时更换。我们实验室常用的为TBE，相对于TAE和TPE具有缓冲能力强、可长时间使用的特点，并且对于小于1000bp的片段分离效果较好。电泳液每次用完都需要摇匀，使电泳槽内正极和负极的酸碱度保持一致；如果不摇匀，由于正负极酸碱度差值较大，会导致核酸泳动消失，从而造成电泳结果失败。3.2电压电泳过程中的电压也会影响条带，若电压过高会导致条带弯曲，电压过低则核酸开始时候难以进入胶中，从而影响电泳结果。在电泳过程中不可以更改电压，否则会导致波浪状条带的出现。本实验采用120V恒定电压，电泳条带整齐不弯曲。（见图2）图2在120V恒定电压时的电泳条带图3.3 PCR扩增产物的染色剂和染色方式PCR扩增产物的染色剂和染色方式不同也会影响实验结果；笔者实验室采用的染色剂为GelRed[6]，是一种无毒的EB替代物，使用方法和EB完全一样；实验室常用的染色方式有两种，一种是将染色剂直接添加在加热后的琼脂糖凝胶中；另一种是待电泳结束之后，再用染色剂泡胶染色；笔者在实验中发现，在使用电泳后泡胶方法时，GelRed稀释液不够稳定，只能使用三天左右，三天后条带亮度不明显，而EB较稳定，长期使用仍然可以使核酸染色条带亮度清晰。4结语PCR技术是生命科学研究中不可或缺的一种实验技术。因此，熟练掌握PCR实验的基本原理、实验方法、影响因素和注意事项等对顺利完成实验和取得完美的实验结果至关重要。以上是笔者总结自己实验操作中的些许经验，对PCR实验过程中几个方面的影响因素做了简单的论述，以期为遇到类似问题或即将开展PCR实验的教师和学生提供参考，在实验过程中遇到的具体问题，还应根据实际情况对PCR实验步骤或基本要素进行适当的调整，不断完善实验操作方法、实验的影响因素等，以保证PCR实验的顺利进行。参考文献[1]金宇良. PCR技术研究进展. 现代农业科学, 2012, NO.10, 47.[2]任亮,朱宝芹,张轶博等. 利用软件Primer Premier5.0进行PCR引物设计的研究. 锦州医学院学报, 2004 Dec,25( 6).[3]郑景生. PCR技术及实用方法. 分子植物育种, 2003, Vol.11, No.13,381-394.[4]德伟,李艳利. 生物化学与分子生物学[M]. 北京: 科学出版社, 2001.[5]吴爱军等. 在多基因PCR中对dNTP与Mg2 的浓度关系的研究. 中国公共卫生, Vol.17 No.2 Feb 2001.[6] Huang Q, Baum L, Fu W L. Simple and practical staining of DNA with GelRed in agarose gel electrophoresis[J]. Clinical laboratory, -4): 149.*通讯作者：关宝生，E-mail:jms_基金资助情况：国家级大学生创新创业训练计划项目（）；黑龙江省自然基金项目(D200964)；佳木斯大学青年基金项目（Sq2012-37）。森元生物科技长按指纹 > 识别图中二维码 > 添加关注A．侵染大肠杆菌后会裂解宿主细胞B．蛋白质可用32P放射性同位素标记C．DNA可用15N放射性同位素标记D．只将其DNA注入大肠杆菌细胞中【考点】．【专题】教材经典实验；遗传物质的探索．【分析】噬菌体侵染细过：吸附→注入（注入噬菌体的DNA）→合（控者噬菌体的DN；原料：细菌化学成）→组装→释放．T2噬菌体侵细菌的实骤：别用3S或2P记菌体噬菌体与大肠菌混合养→噬侵染记的细菌→在搅拌器中拌然后离，检测上液和沉淀物的放射性物质．【解答】解：赫尔希斯在做实时要求在大肠杆菌裂解行离，A错误；蛋白质外不P素不能用32P标记质壳，该用35S元素标记，B错误；DNA和蛋白含N元素不能用15N元标记NA，应该用2P元素标记DN，错误；故选：【点评】本题考查噬菌体侵细菌实验，要求考生识记噬菌体染细菌繁后代的过，明确该验成功原因是实现了DNA和蛋白质的完全分离，再结合所知对选项出准的断考识记和理层次查．声明：本试题解析著作权属菁优网所有，未经书面同意，不得复制发布。答题：sw0001老师　难度：0.60真题：1组卷：0
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