乙醇降解菌的筛选及特性研究_甜梦文库
乙醇降解菌的筛选及特性研究
重庆大学 硕士学位论文 乙醇降解菌的筛选及特性研究 姓名：杨小柏 申请学位级别：硕士 专业：生物医学工程 指导教师：霍丹群;袁秀平
重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要过量饮酒的醉酒治疗和乙醇废液的高效处理已成为研究热点，但对其生物处 理，特别是对降解乙醇的微生物以及乙醇的降解机理的研究还不多。本文在对国 内外解酒剂和工业生产乙醇后的废液处理等了解基础上，对乙醇降解菌及其生化 特性进行了研究，为开发生物解酒剂和生物处理乙醇废液工艺提供了可靠的技术 参数，具有重要的现实意义。 本课题对乙醇降解菌主要进行了以下几个方面研究：1)乙醇降解菌的筛选研 究。通过从泸州老窖窖池的黄水和窖泥以及永川醋厂的醋醅中取样，用乙醇作唯 一碳源的基础培养基上，进行培养初筛；然后在培养基中添加乙醇并逐渐加大添 加量进行驯化；最后进行复筛。实验结果表明，从黄水和窖泥中得到了 1 株降解 乙醇能力较强的菌株，其降解乙醇速度达 1.45ml/天。2)最佳培养条件的确定。经 过实验设计，进行碳源、氮源以及 C/N 比三因素四水平的正交实验，分析确定其 最佳培养基为：可溶性淀粉 3g 、NH4Cl 0.15g、K2HPO4?3H2O 0.1g、NaCl 0.04g、 MgSO4?7H2O 0.05g、FeSO4?7H2O 0.001g、磷酸盐缓冲液 1ml、微量元素溶液 0.5 ml、蒸馏水 100ml。另外，还对其生长条件进行了单因素实验研究。最后确定其 最佳生长条件为：pH7.0、温度 37℃、接种量 107 个/ml、接种前溶氧一天、恒温摇 床 160rpm 振荡培养。同时，考察了该菌的乙醇脱氢酶在不同条件下的活性，乙醇 脱氢酶活性最高可达 145U/L。3)乙醇降解菌生长特性研究。通过测定该菌在一个 生长周期内的菌液浓度变化情况，绘制出该菌株在最佳培养条件下的生长曲线。 同时，考察了该菌的生化特性和乙醇脱氢酶活性。实验结果：生长曲线特征：延 滞期 14 小时，对数期 3 小时、稳定期 9 小时，26 小时后进入衰亡期。 通过研究发现，乙醇降解菌降解乙醇能力为 1.45ml/天，其培养条件和生化特 性适合构建新的工程菌株以及实现大规模生产。因此，可以将该菌株作进一步研 究应用于工业生产，为新型生物解酒药的研究和乙醇废液生物处理提供新的方向。 关键词：乙醇降解菌，酒精废液，乙醇脱氢酶，生长曲线I重庆大学硕士学位论文英文摘要ABSTRACTAt present the biotreatment of alcohol poison and waste ethanol polution has not obsorbed any researching interest. In this article ethanol-degradation bacteria is deeply studied based on the alcohol-poison-medicine and treatment of waste ethanol pollution at home and abroad. A strain of bacteria which can degradate ethanol well is selected from Jiaoni and Huangshui in the experiment and its biochemical characteristics are researched. The test has supplied reliable technic parameter for the exploitation of biotreatment technique of alcohol poison and waste ethanol pollution. The follow aspects are studied in the paper. 1) The selection of ethanol-degradation bacteria.The bacteria sample gotten from Jiaoni Huangshui and Cupei is cultured on the medium containing ethanol. The ethanol-degradation bacteria survived in the first selection is trained in a serious media with different ethanol consistence.A strain of ethanol-degradation bacteria which can degradate ethanol 1.45ml per day averagely is reselected. 2) The determination of the optimal cultureing conditions for the ethanol-degradation bacteria. An orthogonal test of three factors and four levers is designed to determine the optimal medium and a single factor test to determine the optimal culturing condition. As the result the optimal medium for the ethanol-degradation bacteria is composed of soluble march 3g, NH4Cl 0.15g, K2HPO4?3H2O 0.1g, NaCl 0.04g, MgSO4?7H2O 0.05g, FeSO4?7H2O 0.001g and phosphate buffer 1ml, microelement 0.5ml ， pure water 100ml. Then the optimal growing condition is to inoculate the ethanol-degradation bacteria 107/ml after solubilization oxgene for one day in the medium(pH 7.0) and culture them at 37℃ with 160rpm shaking. Additionally the activity of alcohol alcohol dehydrogenase(ADH) is studied in the experiment which can reach 145U. 3) Research on growth characteristic of the ethanol-degradation bacteria. Growth curve is described by observing the change of culture solution consistence of the ethanol-degradation bacteria in a cycle.It shows in the curve that the lag phase, exponential phase, stationary phase is 14h, 3h, 9h respectively and after culturing 26h the ethanol-degradation bacteria enter into death phase. It showed in the research that the ethanol-degradation bacteria selected can degradate ethanol 1.45ml per day averagely. Its biochemical characteristics are suitableII重庆大学硕士学位论文英文摘要for developing new engineering strain to realize mass production. So the selected ethanol-degradation bacteria can be studied farther to apply it into agriculture production and the application of it supplies a new direction in the biotreatment of alcohol poison and waste ethanol pollution. Keywords: Ethanol-degradation Bacteria, Waste Ethanol Pollution, Alcohol Dehydrogenase, Growth CurveIII重庆大学硕士学位论文1绪论1 绪 论1.1 引言乙醇又名酒精，它是一种非常奇特而有魅力的传统饮品。在我国有几千年的 悠久历史。随着人类文明不断发展的同时，酒文化也得到了不断的丰富和补充[1]。 在我们的生活和工作中，酒主要具有以下作用：1)富含营养物。酒中含有人体所必 须的氨基酸、蛋白质、碳水化合物、维生素、以及 Zn、Fe 等微量元素[2]。2)帮助 消化。适量饮酒能促进食欲，加速胰液的分泌，从而增强胃肠对食物的消化吸收。 3)减轻心脏负担，预防各种心、脑血管的疾病。饮酒后人的血压会发生变化，从而 调节和改善体内的生化代谢，可以将引起冠心病的胆固醇运送到肝脏，再转变为 对人体有用的激素。4)缓减疲劳、忧虑、紧张等，有益于身心健康。5)作为增香剂。 烹饪的时候加入少量白酒或啤酒，利用其易挥发、易燃烧的性质，去除食物的腥 味和改善菜肴的风味和口感。然而，酒在发挥其特有影响的同时，若长期过量摄 入亦有很大副作用，严重的会造成脑损伤和肝损伤，对人体健康构成威胁。 除构成酒的主要成分之外，乙醇还有其他许多用处。在医学上，75%的乙醇作 为一种最常用的消毒液，大量应用于手术器械消毒和清洗病人伤口。这是因为乙 醇能使一般的病原微生物细胞膜中蛋白质变性并失去正常的功能，从而杀死病原 微生物。另外，乙醇是脂溶性、非电解质的极性小分子。根据相似相溶原理，它 可以溶解是极性分子的其它有机溶剂。因此，在制药工业和化学工业中，乙醇被 作为一种很好的有机萃取溶剂大量应用于药物的提取、分离、纯化及其他化学提 取工艺中。随着科技的进步和社会的发展，乙醇也被不断的开发出新的用途。特 别是在工业应用中， 乙醇可以作为一种比较清洁的能源[3]。 利用其发热量高、 易燃， 且燃烧后的产物是 CO2 和 H2O，不会引起二次污染的特性，工厂将乙醇用作燃料 来提供动力。还有研究表明乙醇作燃料的功效并不比燃油差，相比之下更加经济， 废气可达到零排放，还能节约治理废气污染的费用[4]。因此，美国、日本以及欧洲 的一些国家开发出了以乙醇作为燃料的新型、环保汽车。 目前，乙醇的最大用途仍是作为饮用酒的主要原料，酿酒企业为了适应市场 的需求，以乙醇作为主要原料开发出了不同品种和不同系列饮用酒，比如：奶酒、 黄瓜酒、玉米酒、茶酒等。根据国家的地理位置和人们的习惯，世界各国形成了 各种特色的酒文化。德国人喜欢喝啤酒、法国人喜欢葡萄酒、俄罗斯人喜欢伏特 加、美国人喜欢威士忌、中国人偏爱白酒。在我国，酒文化也比较发达，尤其是 几千年“ 酒逢知己千杯少” 的待客之道源远流长。主要以白酒、红酒、啤酒盛行。夏 天，天气炎热，啤酒就成为很多人消暑的饮品。冬天，天气寒冷，白酒就成为人1重庆大学硕士学位论文1绪论们的最佳选择，可以卸寒保暖。而一般在喜庆的时候，很多人选择红酒来庆祝喜 事，烘托热闹的气氛。可是酒对人体有广泛的药理作用，急性大量饮酒可引起恶 心、呕吐、情绪不稳定，严重时甚至可因呼吸肌麻痹而导致死亡，影响身体健康。 有研究报道， 人体吸收的乙醇， 80%在肝脏中代谢， 长期过量饮酒， 会造成肝损伤， 比如：酒精性肝炎、酒精性脂肪肝、肝硬化等疾病。同时，也会刺激大脑释放一 种叫内啡肽的物质，该物质可以抑制脑神经，造成大脑反应迟钝，记忆力下降等 不同程度的脑损伤。另外，过量饮酒还会强烈刺激人体的消化系统，引发其它消 化器官的病变，以及食欲减退、营养不良等疾病。由此可见，饮酒过量不但浪费 资源，而且对身体健康构成严重威胁，影响人们正常的工作和生活。 正因为乙醇用途广泛，使用量也比较大，具有巨大的社会效益和经济效益。 很多企业生产各种酒类和食用乙醇及工业乙醇，但同时也会排放大量的乙醇生产 废液和废渣，污染环境。我国每年的乙醇产量达 300-400 万吨，年排放含乙醇废液 45 万立方米[5]。然而，这些生产企业在酿酒和生产乙醇后的废液很难处理。如果 将这些废液直接排放入水体，会造成环境污染，堆放的酒精废渣经雨水冲刷后流 入江河也会对环境构成污染。因为其内有机物含量较多，BOD 值和 COD 值都高 达几万单位，这些营养物质进入水体后，会消耗掉水中的氧气，造成江河缺氧， 水体发黑、发臭，水质变坏，水中的生物也会因为缺氧窒息而死[6]。同时乙醇废液 中含有大量的 SO42-，它会沉积和酸化土壤，减少耕地面积，影响作物生长，使产 量下降。其次，乙醇废液直接排放还会造成巨大的资源浪费，乙醇废液中含有大 量的有机物质，特别是碳源、蛋白质、以及钙、镁、磷、钾、锰等微量元素，特 别是钾的含量最为丰富。因此，直接排放乙醇废液不但会造成严重的环境污染和 资源浪费，而且会造成生态平衡破坏[7]。随着科技和社会的发展进步，以及人们对环保意识的加强和身体健康与生活 质量的高要求。人们对过量饮酒和乙醇废水的处理越来越重视，因此，对乙醇降 解机理的探索成为当前研究热点。结合我国丰富的中药资源，科学研究人员对高 效解酒药的研究做了不少工作，开发出了一些具有一定疗效的中药解酒剂。同时， 在乙醇废液的处理方面也有研究报道，但主要是利用化学和物理的方法对乙醇废 液进行处理。虽然取得了一些成果和技术经验，但处理的效果不是很理想。现有 的关于对乙醇降解的探索和研究报道中，还没有取得突破性的进展和明显的效果。 尤其是市场上还没有一种真正高效、价格便宜的生物解酒药。与此同时，也还没 有一种有效、无污染的生物处理乙醇工艺的报道。在生物世纪来临之际，对乙醇 废水生物处理的新探索以及解酒生物制剂的开发也迫在眉睫[8] 。有些科研人员从 微生物的角度出发，试图找到一种真正能够快速、高效降解乙醇的微生物。本课 题就是以微生物学理论、生物化学理论以及生物技术为指导，拟从自然界中寻找2重庆大学硕士学位论文1绪论并筛选到能够稳定、高效降解乙醇的工程菌株[9]。然后，对该降解乙醇菌株进行实验研究，并对其生化特性和细胞生长动力学进行深入研究。为以后开发高效生 物解酒剂和实现乙醇废液高效生物处理提供一定的实验数据和理论基础。1.2 国内外现状我国酒文化延续了几千年，酒作为一种传统饮品与人们的生活息息相关，但饮 酒过量会给人们带来诸多不便，引发诸多问题：1)过量的饮酒，容易使人麻痹，失 去控制和理智。特别是会对具有想象力和创造力的右脑产生刺激以及麻痹产生记 忆力和自控力的左脑，造成严重的脑损伤。2)过量饮酒，获得酒后的快感，容易产 生心理依赖和耐受性，需要增加酒量以得到满足，这样会加大乙醇对机体的刺激 作用，造成严重的酒精后遗症。3)还会因为乙醇对胃的麻痹作用，造成食欲下降， 营养缺乏等病症，严重影响身体健康。4)由于乙醇进入血液后，很快转化为毒性乙 醛，产生强烈的药理刺激，会加重肝脏的负担和对肝的损伤，还会诱发高血压以 及其他消化道疾病。由于人们对生活质量的高要求，所以国内外对解酒药的研究 越来越重视。 与此同时，随着我国传统酒文化的不断丰富和发展以及酒类产品大量开发和 乙醇在工业应用中的新用途研究，使得酒精需求量俱增。因而，也给生产酒精的 企业带来比较棘手的问题，即大量乙醇废液的无害化、环保处理新工艺。因为企 业生产乙醇后，会产生大量的废液和废渣，仅我国每年就有近 7000 万吨乙醇废液 排放， 其 COD 值为 10-20 万 mg/l， BOD 含量高达 5-7 万 mg/l， 温度高达 95-100℃， 色度为 5000 左右，pH 值约为 3-4，对环境的影响极大。同时，乙醇废液中有机物 质含量很大，尤其是氨、氮、硫等的含量达 5000 mg/l 以上。所以，直接将其排放 不但会造成严重的环境污染， 而且会造成资源的巨大浪费[10]。 况且， 在 2000 年底， 国家环保政策已经作出规定，各种乙醇废液处理均要达标排放。否则，就得停止 乙醇生产[11]。1.2.1 解酒药研究现状目前，还没有一种真正能够快速降低患者血液中的乙醇含量且副作用小的解 酒药，以减轻乙醇对其他内脏器官损伤。随着社会的进步和人们生活水平的提高， 解酒药的市场需求量越来越大，对解酒药的要求也比较高，迫切需要一种快速、 简便、价格便宜又比较适口的药剂[12] 。 国内解酒药市场上竞争品牌空缺，生活中主要应用三大类解酒药。 1)具有一定 疗效的中药复方制剂。其实质是依据人体生化原理，以传统的解酒中药(例如：葛 根、黄连等中草药)和一些氨基酸、维生素为主研制的解酒药，这些药基本上只起 一定的缓解作用而没有实际解酒功效。现在国内市场上出现的解酒药以深圳海王3重庆大学硕士学位论文1绪论集团生产的“ 海王金樽” 最为出名，它是一种海洋生物(牡蛎)提取物，该物质对预防 醉酒有一定的效果。投放市场的解酒中药还包括：“ 醉仙乐” ，它有葛根、生姜两味 中药组成，研究表明，它能明显降低血清中乙醇含量，能显著抗肝损害等多方面 药理作用[13]。“ 醒酒灵” ，主要以黄连、维生素为主研制而成，其醒酒机理是激活 人体内的乙醇脱氢酶(ADH)并提高其活性，从而加速乙醇分解，缩短乙醇在体内停 留时间。实验结果表明，该解酒药可抑制胆碱脂酶活性，使乙酰胆碱分解，消化 作用增强，糖异生加速，防止因乙醇中毒而产生低血糖。其醒酒效果女性高于男 性，更适合年轻人[14]。“ 醉酒冲剂” ，它是由天然植物为原料，主要选用菊花、玫 瑰、槐花、葛花等清热晾肝为君药，以大枣、五味子为臣药和大青叶、陈皮为辅 药配制而成。研究结果说明，该药无任何毒副作用，可有效保护肝脏，可防止转 氨酶升高，具有一定的解酒功效[15]。另外，还有很多天然解酒药物，它们主要从 两方面发挥解酒作用：其一，抑制酒精的胃肠吸收，加强乙醇在胃肠的停留时间， 最终达到降低血中乙醇浓度。主要是五加科植物的水提物，比如人参、三七、绿 茶等，通过延迟胃排空和抑制乙醇吸收而达到解酒目的。其二，药物直接作用肝 代谢酶系，加速乙醇及其代谢产物的消除，从而减轻乙醇对组织和细胞的损害。 据报道，葛花、葛根、枳相子、芦荟素等，以及银杏、茯苓等 16 种中草药的水煎 液都能降低血中乙醇，提高 ADH 活性，具有一定解酒作用。2)化学药物应用于解 酒。生活中，应用氢氧化铝治疗轻度急性醉酒。利用该物质能够快速在胃里形成 一层致密的氧化膜，从而减小乙醇对胃的刺激，延长乙醇在胃里的滞留时间。因 而可以保护胃和避免醉酒，但由于氢氧化铝不能被人体消化吸收，患者食用后感 觉很难受。 在临床上， 应用比较多的解酒药是北京四环制药厂生产的盐酸钠络铜(简 称 NX)，它是一种能抑制中枢神经系统物质― 内源性阿片肽的特异性拮抗剂。由 于醉酒时，乙醇代谢产物毒性乙醛与体内多巴胺缩合成内源性阿片肽，此物质对 中枢神经系统的抑制作用，造成乙醇中毒症状。因此应用盐酸钠络铜的特性，阻 止人体脑内阿片肽受体的作用，从而防止和逆转乙醇中毒。目前，由于其较大的 副作用，仅作为抢救乙醇中毒用解酒药[16]。3)在生活中，人们根据实践也摸索出 一些解酒经验。营养食品中，有一种很受欢迎的解酒药---完美氨基酸片，它主要 含有 L-半胱氨酸和 L― 丙氨酸。通过这两种氨基酸参与体内生化代谢，改变乙醇 代谢途径，从而加速乙醇降解。另外，还有一些食物也具有一定解酒疗效。比如： 食醋、水果、咖啡、葡萄糖、绿豆汤、白萝卜汁、蜂蜜以及由砂仁、葛花、B 簇维 生素研制的解酒茶等都具有一定的解酒作用，但效果不是很明显。 国外解酒药市场中， 以日本的 SS 制药株式会社生产的安醉仙解酒丸最为畅销。 该产品在欧美的市场上很受青睐。研究表明，该药中的某些成分(泛酸钙等)改变了 乙醇正常代谢途径，而且缩短了乙醇代谢时间，所以，其解酒效果比较好。另外，4重庆大学硕士学位论文1绪论美国力克公司生产的力克口服液也具有显著的解酒疗效，销售得比较好。最近， 一种被称为 Down808 的解酒茶，获得国际认证并投放市场，它对饮酒者预防醉酒 具有一定的疗效[17]。如今，还有许多具有一定疗效的解酒药行销于国际市场，但 总的说来，解酒药价格昂贵，使用不方便，产生效果时间较长，还没有真正的解 酒特效药。 综上所述，国外解酒药市场有名的品牌也比较少，解酒疗效较明显的几种产 品比较行销，但价格比较高，市场发展潜力巨大。国内解酒药市场主要以天然药 用植物为原料，开发的解酒中草药居多。这种传统的解酒药具有市场狭小，原料 价格高、取材不方便、药品价格低、功能单一、疗效不明显等特点，影响我国解 酒药的开发和研究。因此，以生物理论为指导，开发疗效明显、价格便宜、取材 方便的微生物解酒制剂，对于提高人们生活质量，具有重要的现实意义。1.2.2 乙醇废水处理研究现状目前，尽管有不少企业建立了废水处理系统，有的企业还从国外引进先进的 处理设备，但是关键的设备和核心的技术还存在问题，所以真正成功运行的不多。 据环保部门统计表明，我国现有乙醇生产企业一千多家，每年排放含乙醇废液 45 万立方米，更让人担心的是每年大约 7000 万吨乙醇废液排入人们赖以生存的江河 湖泊[18]，同时，还有数量巨大的含乙醇废渣难以处理，对生态环境构成了严重的 威胁。简单的乙醇废水生物处理已经应用于工程。据报道，有以下方法：SBR 工 艺、三沟式氧化沟工艺，UNITANK 工艺等。也有一些对乙醇废液进行深度处理工 艺的新研究，比如：活性炭吸附、光催化氧化等工艺。当前，考虑到环境的保护 和综合高效利用资源，国内大多企业采用的是厌氧消化处理、氧化塘法、浓缩制 肥以及沤肥法等传统工艺[19]。总之，还没有真正成功的微生物处理乙醇废液工艺 报道。 由于国家对乙醇废液制定了具体的排放标准和严格的执行规定，并以法规的 形式对其进行监督。考虑到国家政策和环保法规，很多乙醇生产企业根据自己的 实际情况，采用不同的乙醇废液综合处理工艺：有的企业采用浓缩提纯乙醇废液 的工艺，再将回收的酒精作为再利用的燃料能源供给动力车间[20]。也有企业采用 SCP 法，即利用酒精废液中富含有机营养：蛋白质、有机酸、维生素、糖类等， 接种单细胞微生物后进行培养，生产出单细胞蛋白并将其作为饲料蛋白添加入复 合饲料。还有企业对乙醇废液进行浓缩，然后再进行深加工，生产大量的副产品， 比如：香水、酒精块、清洁剂、鞋油等生活用品，以及乙酸、杂醇油、柠檬酸等 工业产品。当前，考虑到节约资源和环境保护，乙醇生产企业主要采用以下三种 工艺实现了乙醇废液的综合治理和资源利用。 1)乙醇废液三段式处理工艺。 前处理， 即对废液含固量、温度、pH 值进行调整，以满足厌氧消化的要求。处理后产生大5重庆大学硕士学位论文1绪论量废渣，然后将其回收并按比例加入添加剂，制备成新鲜的蛋白饲料；厌氧消化 处理， 此工序主要去除全系统有机物， 担负着进水可溶物质 95%、 悬浮物质中 50% 以上的降解作用。首先，水解发酵细菌将复杂的有机分解物分解成简单有机酸， 再经产氢产乙酸细菌分解成甲烷，因而可以大量回收沼气能源；多级好氧处理， 主要去除残留的有机物质，使水质能达标排放。过程是将厌氧消化后的废水，采 用预处理-曝气氧化-气浮-氧化沟处理工艺，最终获得含量丰富的有机肥料[21]。这 种三段式处理工艺应用较多，处理效果比较好。其工艺流程如下： 种三段式处理工艺应用较多，处理效果比较好。其工艺流程如下：厌氧微生物好氧微生物乙 醇 废 液前处理厌氧处理好氧处理排滤 饲渣 沼 料 气 混 凝2)生物处理工艺。此工艺主要包括厌氧微生物处理和好氧微生物处理。厌氧 2)生物处理工艺。 此工艺主要包括厌氧微生物处理和好氧微生物处理。厌氧微生物 处理即在乙醇废液中加入少量葡萄糖、维生素及微量元素，同时加入 15%的厌氧 微生物菌剂，然后在 35℃厌氧培养，使得有机物分解为甲烷等可利用的气体。好 氧微生物处理就是在厌氧微生物处理后，加入少许营养物质和生物活性液，同时 加入一定比例的好氧微生物菌剂，进行活性污泥法处理，较彻底除去有机物质[22]。 该工艺为绿色工艺，完全符合新世纪绿色科技对环保产业的要求，是一种很有效 的减少污染和保护环境的处理工艺。 3)燃烧处理工艺。 该工艺主要包括浓缩、 燃烧、 除尘三个阶段。浓缩，即将乙醇废液先经过中和、沉淀后输入浓缩设备，浓缩成 60° BX-70° BX 的乙醇浓缩液。燃烧，即将浓缩液加压后泵入特制的锅炉内进行高 温完全燃烧。除尘，因为乙醇废液燃烧时产生的高温烟气被锅炉受热面吸收热量， 冷却成低温烟气，形成大量的烟灰。同时废液完全燃烧后也产生很多灰烬。可以 将烟灰和灰烬收集作为制作复合肥的原材料。乙醇废液焚烧处理工艺，燃烧产生放6重庆大学硕士学位论文1绪论的热量由锅炉吸收后产生的蒸汽可以供酒精生产工艺和乙醇浓缩工艺用气，整个 过程实现变废为宝、无二次污染，对乙醇废液处理真正的零排放[23]。 在国外，乙醇废液的处理和研究较早，而且积累了丰富经验和技术。日本早 在 1965 年就开始利用乙醇废液生产有机复合肥料。荷兰、法国等利用乙醇废液浓 缩物，加入米糠、甜菜渣等干燥制成配合饲料的基料。美国则利用和生物降解相 结合的方法，生产动物饲料和有机肥料[24]。比较而言，国外对乙醇废液的处理， 采用生物处理工艺的较多。实现了维持生态平衡的同时走可持续发展的道路，即 综合利用现有资源，对乙醇废液进行清洁化、高效化处理。 综上所述，国外对乙醇废液的处理研究较多，理论和技术都比较先进。国内 目前还没有较为成功运用微生物处理乙醇废水的报道。大多采用厌氧处理工艺和 其它简单生物处理，但存在很多不足之处：耗能低、处理负荷大、资源和能源浪 费大、环境要求条件高、厌氧菌生长慢、启动时间长而且很困难、运行成本高、 经济效益低[25]。总之，大量、精确化达标处理乙醇废液还有一定的距离。随着生 物世纪的到来和兴起，科研人员利用微生物学理论和生物化学的理论，不断探索 和研究新型、环保的生物处理乙醇废液工艺。从理论上，我们认为采用厌氧-好氧 处理相结合，利用好氧微生物的生长特性降解乙醇，才能真正实现乙醇废液的无 害化、节约化、环保化处理，真正保护我们的生态环境和身体健康。7重庆大学硕士学位论文2理论基础2 理论基础2.1 乙醇代谢机理开发降解乙醇的生物解酒剂和研究乙醇废掖的生物处理工艺，首先必须了解 和掌握乙醇的代谢途径及其生化代谢过程中各种酶及其特性。2.1.1 乙醇在机体中代谢开发能降解乙醇的生物解酒剂和研究乙醇废液的生物处理工艺。主要是根据 微生物直接利用酒精作为碳源，进行生长繁殖，将乙醇分解代谢为 CO2 和 H2O 这 一代谢过程，利用乙醇降解菌快速大量分解乙醇的特性，满足我们工业生产和应 用目的。这就有必要了解和掌握乙醇的代谢途径及其生化代谢过程中各种酶及其 特性[26]。 饮入的乙醇 80%由小肠上段吸收，胃内有食物存在可延缓乙醇的吸收。乙醇 被吸收后，先进入门静脉，通过毛细血管迅速弥散到全身细胞内、外液，极少量 (2-10%) 从肾和肺排泄外， 90% 以上的乙醇在体内分解代谢。进入体内的乙醇 90%-95%在肝脏代谢。2.1.2 乙醇在肝脏中代谢乙醇在肝内通过三种途径氧化代谢成乙醛。饮酒之后，首先启动 0 级经典途 径，即通过胞质内的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)和过氧化小体内的 分解酶进行代谢；当血乙醇浓度过高时，也启动一级代谢途径，通过内质网中的 微 粒 体 乙 醇 氧 化 酶 系 统 (MEOS) 进 行 代 谢 ， 这 是 因 为 MEOS 的 米 氏 常 数 (Km=8.6mmol/l)比 ADH(2mmol/l)大数倍。另外还有 NADPH 氧化酶-过氧化氢酶体 系以及黄嘌呤氧化酶-过氧化氢酶体系,这些体系中以 ADH 乙醇氧化体系与微粒体 乙醇氧化体系最为重要[28]。如下表所示：8重庆大学硕士学位论文2理论基础由上图可知：ADH 乙醇氧化体系中，被摄取至肝内的乙醇大部分被肝细胞液 中的乙醇脱氢酶催化脱氢而生成乙醛，乙醛进一步在乙醛脱氢酶(ALDH)催化下脱 氢而生成乙酸，后者又形成乙酰辅酶 A 而进入三羧酶循环，最后生成二氧化碳和 水，并释放能量生成 ATP。有研究报道，乙醛脱氢酶可分为两型，Ⅰ型为低 Km 的 NAD 依赖性酶和高 Km 酶的Ⅱ型，全分布在线粒体内及微粒体中。乙醇氧化产 生的乙醛大部分在线粒体内被 NAD 依赖性的低 Km 酶的代谢系统所氧化。 该体系 在乙醇代谢中所占的比例为 75%-80%。研究表明，ADH 乙醇氧化体系与微粒体乙 醇氧化体系的组成和性质不同，乙醇的代谢与肝细胞微粒体的功能有很大关系， 微粒体乙醇氧化体系(MEOS)在乙醇代谢中所占的比例为 20%-25%。 肝脏的平均代谢乙醇能力是 2mmol/min。在人类除肝脏外，肾脏、胃、肠道、 肺、心脏、大脑、血细胞和骨骼肌同样具有低活性的乙醇氧化能力。有研究报道 表明，乙醇分解主要在肝脏中进行，所以饮酒与肝病之间有密切的关系，饮酒量 越高的国家，肝病死亡的人数越多。这主要是因为肝内乙醇代谢产生了乙醛，该 物质化学性质活泼，具有强烈的药理刺激作用，对脑内胺代谢、线粒体呼吸功能、 心肌蛋白合成能力等有抑制和毒性作用。所以，了解乙醇在肝脏内的代谢具有重 要的生理意义和社会意义。2.2 乙醇降解酶乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)构成了哺乳动物体内乙醇代谢的主要 氧化通路，是体内乙醇代谢的主要限速因素[30]。这两种酶在 37℃，具有很高的催 化乙醇效能，而且它们能以乙醇为底物进行专一的结合，并催化底物发生反应。 实验研究报道，它们反应动力学也合乎米氏方程：u=(v[S])/(Km+[S]) 。乙醇在体内 主要由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和 CYP2E1 水解成乙醛和甲酮，乙 醛继而由乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)水解成乙酸。 乙酸再变为乙酰 辅酶 A，进入三羧酸循环，最终代谢为 CO2 和 H2O[31-34]，从而解除乙醛对机体某 些器官和组织的毒性作用。因为乙醛、乙醇氧化的活性产物在肝内代谢产生具有 毒性作用的自由基，过量的自由基可以与细胞膜脂质、脂蛋白共价结合，生成过 氧化脂质等毒性物质，最终导致细胞被破坏[35]。所以，过量饮酒是造成肝毒性和 肝损害的主要原因。2.2.1 乙醇脱氢酶(ADH)特征ADH 是一种广泛专一性的含锌金属酶，以 NAD 为辅酶，除了能催化乙醇和 乙醛之间的可逆反应外，还能氧化脂肪簇乙醇，特别是高分子乙醇，如：t-丁醇， 丙烷,异丙基乙醇等.它被广泛应用与医学分析、工业生产和科学研究等方面。目前 ADH 主要从动物肝脏中提取，因而资源有限、价格昂贵难以实现工业化生产，国9重庆大学硕士学位论文2理论基础内外科学工作者正探索从微生物中提取 ADH，以拓展 ADH 的来源。 根据蛋白质结构、 亲电子性、 酶促动力学特征， 将 ADH 分为三类。 Ⅰ类 ADHs 同工酶由基因 ADH1、ADH2、ADH3 分别编码产生，各种 ADH 酶均由 α 、β 、γ亚 单位中的任何 2 个随机组合而成。对乙醇氧化具有很高的亲和力，它较Ⅱ类和Ⅲ 类 ADHs 对乙醇代谢有更大的作用。 Ⅱ 类 ADHs 同工酶是一种新的分子形式 π -ADH，已经在人体肝脏中分离，这种同工酶对吡唑的抑制作用不敏感，π -ADH 由 ADH2 编码， 它能特异地氧化脂肪族和芳香族长链乙醇， 它不能氧化甲醇。 π -ADH 也是一种二聚体，它的同源二聚体形式(π π )也存在于人体肝脏。Ⅲ类 ADHs 同工酶 在淀粉凝胶电脉 ADH 活性带只朝正极移动，这些酶被命名为 χ -ADH(chi-ADH)。 χ -ADH 是由 ADH5 产生，它和Ⅰ类和Ⅱ类 ADHs 分子式相比，目前已经肯定在生 理状态下这些Ⅲ类 ADHs 同工酶对肝脏乙醇氧化代谢的作用不大，只是某些长链 乙醇如芳香族乙醇是通过 χ -ADH 来氧化[36]。最近发现，乙醛脱氢酶和哺乳动物Ⅲ 类 ADHs 是同一种酶。 ADH 酶位于细胞的胞浆内。在肝脏，ADH 主要分布于中枢周围的肝细胞；在 肾脏，ADH 主要分布在小肾上皮；胃肠道中 ADH 主要分布在粘膜内。ADH 也分 布在大脑组织和小脑的浦肯野细胞内，还具有很高活性。 人体内 ADH 在各种器官和组织内乙醇的氧化过程中发挥重要的作用。 其主要 生理作用在于大量乙醇和植物、动物和微生物中的非乙醇化合物的代谢转换或解 毒[37-38]。2.2.2 乙醛脱氢酶(AＬDH)特征乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)是一种以 NAD 为辅酶，专一催化 乙醛和乙酸之间的可逆反应。调节乙醛在体内的代谢。其基本结构包括酶的活性 部位和辅酶结合部位。ALDH 是一种独特的多肽四聚体，它的结构与其它脱氢酶 完全不同[39]。它的生理意义在于它对乙醛的解毒作用。乙醛主要在线粒中进行氧 化代谢，通过某些非特异性酶如乙醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶和乙醛脱氢酶来调节。 它可与体内一些蛋白质、磷脂、核酸等呈共价键结合形成稳定的加合物。 各种 ALDH 同工酶主要分布在胞液和线粒体内，不同的 ALDH 同工酶具有不 同的分子大小，亚单位结构、等电点、以及染色体定位[39]。根据电泳迁移率、酶促 动力学特征、细胞和组织内的分布的不同，至少有 7 种不同基因编码的 ALDH(ALDH1、ALDH2… ALDH7)。最近又根据 ALDHs 的分子结构和其它生化特 征， 将 ALDHs 分为三类。 一类 ALDH 的同工酶是胞浆 ALDHs(ALDH1)， 二类 ALDH 的成员是线粒体 ALDHs(ALDH2)，三类是大鼠和小鼠组织中胃、肺、肝、角膜和 人体胃、肝癌组织中合成型和诱导型高 Km ALDH(ALDH3)。 人体器官和组织中 ALDHs 的分布是不均匀的。肝脏中至少包括 4 种不同的10重庆大学硕士学位论文2理论基础ALDH 同功酶。胃组织中也含有丰富 ALDH。胎盘中也含有很多种 ALDH，但活 性比较低。 另外， 在红细胞、 皮肤， 肺和眼组织中都含有很多能氧化乙醛的 ALDH。2.3 微生物特性2.3.1 生长特性目前所报道的能够降解乙醇的微生物主要有酸化水解菌群、产氢产乙酸菌群、 同型产乙酸菌群和产甲烷菌群。乙醇降解菌作为一种微生物，它在合适的培养基 上生长，就应该具有自己独特的生长特性，主要包括：单个细菌的形态结构、分 裂繁殖方式和革兰氏染色显阳性还是阴性；以及菌落颜色是否透明、菌落形状、 质地是否紧密、边缘是否齐整、中间有无隆起、有无孢子和鞭毛。乙醇降解菌的 生长受很多外界因素的影响，除了受营养条件的影响，还受其它物理因素的影响， 特别是生长条件(温度、pH、氧气)的影响最大[40]。1)温度。影响微生物生长的主要 因素之一，任何微生物都具有自己的最低生长温度、最适生长温度、最高生长温 度。对微生物不同生理代谢过程各有其最适温度的研究，不同微生物对同一过程 也有不同的最适温度， 所以， 研究微生物的最适温度有着很重要的实践意义。 2)pH 值。不同的微生物生长也存在最适、最低、最高三种温度，不同种类的微生物具 有不同的最适 pH,同一微生物在不同的生长阶段也有不同的最适 pH 要求，因此， 在微生物生长的过程中，应该及时调节最适 pH，具有很重要的生产意义。3)氧气。 氧对微生物的生命活动有重要影响，可根据微生物与氧的关系，将微生物分为好 氧菌、厌氧菌和兼氧菌三大类。大多数微生物属于好氧菌和兼氧菌，厌氧菌种类 较少。在微生物培养时应该根据其特征确定氧的供给，以保证微生物正常生长。 乙醇降解菌能以乙醇为唯一的碳源，进行自身的代谢和生长繁殖。而且在其 培养基中加入适量的乙醇,仍然能很好的生长，并和其他微生物一样，也具有自己 的生长周期，包括四个主要过程：延滞期、指数期、稳定期和衰亡期。1)延滞期， 培养基接种后，细胞浓度在这段时间内没有明显增加，是细胞在环境改变后表现 的一个适应阶段。这是因为该微生物在新的环境下，需要合成新的酶才能利用新 的营养物质，所以表现出延滞期。此外，细胞内的辅酶和活化剂，是一些小分子 和离子，具有很高的透过细胞膜的能力，在细胞转移的过程中很容易丢失，也表 现为延滞期。2)对数期，此阶段中，微生物已经适应了新的环境，细胞浓度随时间 呈指数增长。这是因为这时营养物质较充分，生长不受限制，细胞繁殖旺盛，生 理活性高。细胞的繁殖速率远远大于死亡速率，因而，细胞出现数量级的增长。 工业生产中，常在这个时期转接细胞，以保证细胞能迅速增长，反应很快进行。 3)稳定期，细胞浓度不变，活细胞增长速率大致与细胞死亡速率相等。代谢产物大 量产生。这是由于营养物质已经耗尽，大量有害物质积累。细胞的净生长速率为11重庆大学硕士学位论文2理论基础零。 活细胞数逐渐减少。 4)衰亡期， 细胞大量死亡， 其死亡速率大于细胞生长速率。 由于细胞生长环境恶化，没有营养供给，细胞内的分解代谢大于合成代谢。活细 胞数不断减少，特别是某些微生物会自溶，继而导致菌体死亡。了解乙醇降解菌 的生长特性，对工程上应用该微生物进行生产具有重要的实践意义和指导意义。2.3.2 反应特性微生物的反应动力学包括细胞生长动力学、反应基质消耗动力学和代谢产物 生成动力学，但细胞生长动力学是其核心[41]。因此，工业应用中，它也是最主要、 复杂的、细胞生长和繁殖过程，包括细胞内的生化反应和细胞外的生化反应，也 包括胞内和胞外的物质交换以及胞外的物质传递反应。具有多相、多组分、非线 性等特点。微生物细胞反应过程本质是复杂的酶催化反应体系，一方面，微生物 从外界摄取营养物质，在细胞内经过各种变化，将这些物质转化为自身的组成物 质，即同化过程；另一方面，细胞内的组成物质又不断的分解成代谢产物而排出， 这叫异化过程。大分子物质被分解为小分子物质，同时，小分子物质又合成为大 分子物质，并伴随能量的变化，使细胞内的物质和能量维持自身平衡。微生物生 长过程就是同化和异化过程交替作用的复杂过程。所以，在研究微生物生长过程 时，工程上，首先，进行合理简化过程，再建立物理模型，最后推出数学模型。 但需要做以下简化：微生物反应动力学是以细胞的群体动力学为研究对象。其次， 取细胞性质上的平均值，不考虑相互间的差别。再次，将菌体视为单组分环境的 变化对菌体组成的影响忽略，建立非结构模型，细胞内的各种成分增加比例不同， 菌体非均衡生长。根据上述假设的细胞生长动力学模型，可以把细胞的生长过程， 用细胞浓度(可由测定的 OD 值换算)的对数值与细胞的生长时间作图，即就是该乙 醇降解菌的生长曲线。该模型可用于微生物反应过程的分析和过程控制，并指导 我们生产和应用。12重庆大学硕士学位论文3 实验材料/仪器3 实验材料、仪器3.1 实验材料3.1.1 菌样① 泸州老窖公司生产车间窖池的黄水 ② 泸州老窖公司生产车间窖池的窖泥 ③ 永川酿造厂的醋醅3.1.2 实验药品表 3.1 实验药品一览表 Table3.1 The table of test trgents 药品名称 盐酸 无水乙醇 浓硫酸 NaCl (NH4)2SO4 K2HPO4 ?3H2O KNO3 CaCO3 MgSO7?7H2O K2Cr2O7 KCl NaOH FeSO4?7H2O NH4Cl KH2PO4?3H2O 无水葡萄糖 纯度及规格 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生产单位 重庆无机化学试剂厂 重庆川东化工有限公司 重庆无机化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 重庆化学试剂厂 重庆化学试剂厂 重庆化学试剂厂 重庆化学试剂厂 成都化学试剂厂 成都化学试剂厂13重庆大学硕士学位论文3 实验材料/仪器续上表： 可溶性淀粉 蔗糖 结晶紫 碳酸复红 孔雀石绿 藏红 T B.S 辅酶 I 蛋白胨 甘氨酸厂 琼脂 营养琼脂 牛肉膏 酵母膏 分析纯 分析纯 分析纯 生物染料 生物染料 生物染料 90% 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 四川省彭乐市军乐化工厂 中国医药(集团)上海化学试剂公司 温州市乐升化工试剂厂 温州市乐升化工试剂 上海标平模具厂 上海试剂三厂 上海生化试剂厂 上海东海制药厂 上海康达氨基酸厂 青岛水产品加工厂 天津市东方卫生材料厂 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司3.1.3 主要培养基及组成① 初筛培养基 1) 细菌培养基： KNO3、 K2HPO4? 3H2O、 NaCl、 MgSO4? 7H2O、 FeSO4? 7H2O、 无水乙醇、琼脂 2) 放线菌培养基： KNO3、 K2HPO4? 3H2O、 NaCl、 MgSO4? 7H2O、 FeSO4? 7H2O、 无水乙醇、琼脂 3) 霉菌培养基:：葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4?3H2O、MgSO4?7H2O、孟加拉 红、琼脂、去氧胆酸钠、链霉素、无水乙醇 4) 酵母培养基：豆芽、葡萄糖、无水乙醇、琼脂 5) 醋酸菌培养基：酵母膏、葡萄糖、碳酸钙、无水乙醇、琼脂 ② 驯化培养基： 培养基 A ：KNO3、K2HPO4?3H2O、NaCl、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、 无水乙醇(驯化细菌、放线菌、霉菌) 培养基 B： 豆芽、葡萄糖、无水乙醇(驯化酵母菌) 培养基 C： 酵母膏、葡萄糖、碳酸钙、无水乙醇 (驯化醋酸菌) ③ 保存培养基：营养琼脂14重庆大学硕士学位论文3 实验材料/仪器3.2 实验仪器及设备表 3.2 实验所用仪器一览表 Table 3.2 The table of test equipments 仪器名称 电热鼓风干燥箱 电热恒温水浴锅 752 紫外光栅分光 光度计 恒温磁力搅拌器 生物显微镜 PH 计 台式离心机 霉菌培养箱 生化培养箱 无菌工作台 气浴恒温震荡器 回旋式震荡器 不锈钢双层立式电 热蒸汽压力消毒柜 震荡培养箱 超声波细胞粉粹机 手提式高压灭菌锅 电子天平 精密电子天平 显微摄影仪 数量 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 2台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 1台 型号及规格 CS101－2AB H.S.G－Ⅱ－C－6 16C14 型 85-1 XSZ-G PHS-25 JGL-16G XMT-152C LRH-250-A SW-CJ-IFD Z0-85 HY-5 YX.400A HZQ-X100 JY92-Ⅱ YX280B 0.01g 0.0001g XSZ―G 生产单位 重庆银河实验仪器有限公司 上海仪表(集团)供销公司 上海精密科学仪器有限公司 江苏中大仪器厂 重庆光电仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 雷磁仪器厂 上海安亭科学仪器厂 重庆永生实验仪器厂 广东省医疗器械厂 苏州安泰空气技术有限公司 苏州金坑中大仪器厂 苏州金坑中大仪器厂 上海三申医疗器械有限公司 哈尔滨东联电子技术开发有 限公司 宁波新亚科器研究所 上海三申医疗器械有限公司 上海精科天平有限公司 上海精科天平有限公司 重庆化学玻璃公司15重庆大学硕士学位论文3 实验材料/仪器另外，实验中还用到蒸馏器、不同型号的试管、移液管、烧杯、量筒、圆口 锥形瓶、培养皿等玻璃仪器以及接种针、接种环。16重庆大学硕士学位论文4实验设计及分析方法4 实验设计及分析方法4.1 实验设计路线取 样 乙醇降解 菌的初筛 乙醇降解 菌的驯化 乙醇降解 菌的复筛乙醇降解菌的 生长特性研究乙醇脱氢酶 活性研究乙醇降解菌最佳 培养条件研究4.2 实验分析方法4.2.1 乙醇浓度的测定方法① 样品的制备 精取含乙醇的培养液 2ml 于蒸馏烧瓶，并加入 40ml 的蒸馏水混匀，装好蒸馏 装置，先用小火蒸(馏出乙醇)，再加大火力，直至烧瓶里的液体全部蒸干，冷却取 下装置备用。 ② 制定标准曲线 1) 精取无水乙醇 1ml 加入 100ml 的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度线制成标准 乙醇液备用。 2) 取 25ml 的容量瓶 6 个， 每瓶均加入 4%的 K2Cr2O7 2ml， 98%的浓硫酸 1ml 混匀冷却，每瓶分别加入 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.00ml 乙醇标准液，反应 10 分钟，加水定容至 25ml，混匀，以不加乙醇的反应液为参照，于 610nm 波长测光 密度。 3) 乙醇浓度― 光密度测定结果及其标准曲线如下：表 4.1 Tab4.1 乙醇浓(ml/100ml) 光密度(610nm) 1%乙醇浓度(V/V)与光密度之间的对应关系 0 0 0.2 0.03 0.4 0.057 0.6 0.088 0.8 0.11 1.0 0.133Relation of the ethanol consistence(V/V) and OD value17重庆大学硕士学位论文4实验设计及分析方法图 4.1 Fig4.1乙醇浓度―光密度标准曲线Standard curve of ethanol consistence―OD value根据表 4.1 与图 4.1，可知乙醇浓度与光密度的线性关系为： y=0.7( x-乙醇体积浓度，y-光密度) ③ 样品的测定 参照②，在 25ml 容量瓶中加 4%的 K2Cr2O7 2ml，98%的浓硫酸 1ml，摇匀冷 却后加入样品 1ml，反应 10 分钟后定容，测光密度，据标准曲线方程计算乙醇含 量。4.2.2 乙醇脱氢酶活性测定方法① 酶液的制备 取 5ml 培养液，以 10000rpm 的速度冷冻离心 5 分钟，弃上清液，往剩余沉淀 中加入 1.15%的 KCl 溶液 3ml 匀浆，静置 5 分钟后用超声波粉碎细胞，超声参数 为：工作时间 2 秒、间隙时间 5 秒、工作次数 80 次。细胞粉碎后，以 10000rpm 的转速冷冻离心 20 分钟，取上清液即为酶液。 ② 基质液的配制 用蒸馏水配 77mmol/L 的 NAD+液，再配 pH 值 9.0 的 0.1mol/L 的 Gly―NaOH 缓冲液， 按体积比将 1 份 NAD+液与 5 份 Gly―NaOH 缓冲液混合配成基质液备用。 ③ ADH 活性测定 1) 测定管与对照管分别加入 0.25ml 酶液，NAD＋基质液 2.1ml(PH9.0)，测定 管中加入 800mmol/l 的乙醇液 0.07ml，再分别用蒸馏水补充至最后反应总量为 2.8ml(NAD＋初浓度为 10mmol/l，乙醇 20mmol/l)，然后 37℃水浴加热 30min。 2) 将上述预热后的两管，在 340nm 波长下测定光密度，要求在 5min 内，每 隔 1min 读数一次，读取光密度值。18重庆大学硕士学位论文4实验设计及分析方法3) ADH 活性计算 ADH 活性(U/L)=△A/min×1 1.07 ? ? 10 6 =△A/min×.05 6.3 ? 10规定以每分钟 ADH 催化产生的 NADH 微克分子的量为一个 ADH 活力单位。4.2.3 菌液浓度测定方法取样品 5ml，以蒸馏水作为参照，用 752 分光光度计，选定波长 600nm，测 定样品光密度，分光光度计读数即为菌液相对浓度。4.2.4 酸度测定方法① 将酸度计的电极调至 pH 档，并矫正酸度计至标准状态。 ② 用温度计测定待测样品的温度，并调节酸度计的温度旋钮至相应温度。 ③ 用酸度计的电极缓慢伸入样品瓶中，等读数稳定后，记录下来即为所测样 品的酸度。4.2.5 菌样中各类菌数量计算方法S= ? ai ? bi ?i ?1 41 ， cS 为单位数量菌样中各类菌的总和 ai 为不同种类菌的平板菌落数 bi 为各种类菌的不同稀释倍数 c 为样品数量(窖泥、醋醅菌样为质量，黄水菌样为体积)19重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果5 实验步骤及结果5.1 乙醇降解菌的初筛5.1.1 初筛步骤① 菌悬液的配制 取一定量的原材料，加入蒸馏水中，按 10 倍系列稀释法配成菌悬液。 ② 接种 分别取稀释后各浓度的菌悬液 0.2ml 接种于细菌培养基、酵母菌培养基、霉菌 培养基、放线菌培养基，不同浓度的醋醅菌悬液只接种于醋酸菌的初筛培养基。 ③ 培养初筛 接种好的平板放入生化培养箱中，于 30℃条件下培养 3-4 天。霉菌培养基平 放入霉菌培养箱 34℃培养 4-5 天，记录各平板上长出的菌落数及种类。 各菌样接种 5 天后，各种培养基平板上菌落分布情况如表 5.1，表 5.2，表 5.3 所示：表 5.1 接种黄水菌样 5 天后的各平板上菌落分布Tab5.1 The distribution of colonies on different agar plates of Huangshui sample after inoculating 5 days 稀 释 程 度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 数 一片 158 15 1 0 0 0 细菌 菌落 菌落 种类 6 4 4 1 0 0 0 放线菌 菌落 数 0 0 0 0 0 0 0 菌落 种类 0 0 0 0 0 0 0 酵母菌 菌落 数 12 1 0 0 0 0 0 菌落 种类 2 1 0 0 0 0 0 霉菌 菌落 数 26 21 8 1 0 0 0 菌落 种类 5 5 4 1 0 0 0从表 5.1 可以看出：黄水菌样中细菌和霉菌较多，10－3 平板上共有 4 种、 15 个细菌菌落， 4 种、 8 个霉菌菌落； 10－4 平板上细菌和霉菌各一个菌落分布； 酵母菌较少，只有 10－1 和 10－2 稀释度的平板上有少数菌落，没有放线菌。20重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果表 5.2接种窖泥菌样 5 天后的各平板上菌落分布 Jiaoni sample after inoculating 5 daysTab5.2 The distribution of colonies on different agar plates of 细菌 菌落 数 一片 68 19 1 0 0 0 菌落 种类 6 6 3 1 0 0 0 放线菌 菌落 数 52 11 1 0 0 0 0 菌落 种类 6 6 1 0 0 0 0 酵母菌 菌落数 7 2 0 0 0 0 0 菌落 种类 1 1 0 0 0 0 0 霉菌 菌落 数 23 6 3 0 0 0 0 菌落 种类 1 1 1 0 0 0 0稀释 程度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7从表 5.2 可以看出：窖泥中细菌、放线菌和霉菌较多，10－3 平板上共有 3 种、 19 个细菌菌落，1 种 1 个放线菌菌落，1 种、3 个霉菌菌落；10－4 平板上只有一个 细菌菌落，酵母菌较少。跟黄水比较，窖泥中有了放线菌，这是因为窖泥的天然 环境没有黄水酸度大，有少数放线菌可以生存。表 5.3 接种醋醅菌样 5 天后的各平板上菌落分布 Cupei sample after inoculating 5 days 稀 释 程 度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 菌落 数 一片 62 9 0 0 0 0 细菌 菌落 种类 4 4 3 0 0 0 0 菌落数 24 13 2 0 0 0 0 醋酸菌 菌落种类 2 2 2 0 0 0 0Tab5.3 The distribution of colonies on different agar plates of21重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果由表 5.3 可知：醋醅中，有醋酸菌分离出来，还有其它的细菌。由于醋酸菌可 以利用乙醇产生乙酸，在下面的实验中，可以比较醋酸菌和窖泥黄水中各种菌利 用乙醇的情况。5.1.2 三种菌样中含可耐乙醇菌的数量根据以上三表可以计算得出黄水、窖泥、醋醅 3 种菌样中含可耐乙醇菌的数 量分别为：窖泥中 3× 106 个/g，黄水中 1.686× 105/ml，醋醅中 2.805× 106 个/g。所以 黄水、窖泥、醋醅都是丰富的微生物来源，人们可以根据条件从中分离出来对人 类有益的微生物。5.1.3 三种菌样中含可耐乙醇菌的种类从表中可以看出， 3 种菌样中能在含有乙醇的培养基上生长的以细菌的种类和 数量最多，其次是霉菌。酵母菌和放线菌较少。镜检中还发现窖泥和黄水中长出 的细菌种类相似，这是由于他们的生存环境相似。5.1.4 稀释度的确定从表 5.1、 表 5.2 和表 5.3 中可以看出 10-2、 10-3 两个稀释度较好三个菌样中 10-2 的平板上菌落数在 50 到 160 之间，10-3 的平板上菌落数在 5 到 20 之间,这些菌落 分布均匀，可分离出单菌落，也便于记数。而稀释 10-1 的平板上长出来的菌落连 成一片，无法计数，分离也比较麻烦，其它几个稀释度几乎没有长出菌落。所以 对实验所用三种菌样而言，10－2 和 10－3 两个稀释度较好。5.2 乙醇降解菌的驯化5.2.1 驯化步骤① 驯化培养基的配制 配驯化培养基 A200ml 分装 4 个 100ml 的锥形瓶，每瓶 50ml，分别贴标签细 菌 A、放线菌 A、霉菌 A，一瓶作为空白对照，培养基 B50ml，标为酵母菌 B，培 养基 C50ml，标为醋酸菌 C(以上培养基灭菌后各加无水乙醇 1ml)。 ② 接种驯化 将初筛中长出的菌每一种各挑一环接种到相应的驯化培养基。驯化条件为： 恒温摇床 160r/min 振荡、 温度 30℃、 培养 12 小时后取样测定菌液浓度、 乙醇浓度、 调 pH 至初值，每瓶各加无水乙醇 1ml，同样条件下培养。每隔 12 小时取样一次 添加乙醇一次，每次每瓶加 1ml 乙醇，3 天为一轮。共驯化 5 轮。第一轮驯化结束 后的培养液每瓶取 10ml,1000r/min 离心,除去一半上清液，留下部分接种相应培养 基进行第二轮驯化。第二轮驯化后的培养液分别接种于相应固体培养基平板上， 待菌落长出后接种，继续第三轮驯化。第三轮驯化后同上离心取下一半菌体接种， 开始第四轮驯化，驯化过程中观察菌液浓度及乙醇浓度的变化，至细菌生长渐慢22重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果时，驯化结束。 ③ 富集保存 驯化后的乙醇降解菌在固体培养基平板上富集，划斜面分离纯化、保存，镜 检，拍照，描述每种菌的菌落及单体形态特征。5.2.2 驯化结果初筛菌经驯化后共选出 5 株能在高浓度的乙醇(14ml/100ml)培养基中生长的菌 株。它们的菌落形态特征和单体特征如表 5.4 和 5.5 所示，分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、 Ⅳ、Ⅴ号菌。它们的特征及照片如下：表 5.4 Tabl5.4 菌落特征 菌种来源 形状 直径(mm) 颜色表面 正反面 颜色差别五株菌的菌落特征Colony characteristics of five strains Ⅱ号菌 窖泥黄水 圆形 3～ 8 乳黄 光滑 无 整齐规则 较厚 Ⅲ号菌 醋醅 放射梅花形 3～ 6 乳白 光滑 无 不整齐 薄 Ⅳ号菌 窖泥 圆形 2～ 3 白 有褶皱 无 整齐规则 较厚 Ⅴ号菌 醋醅 放射梅花形 3～ 7 乳黄 光滑 无 不整齐 薄Ⅰ号菌 窖泥 圆形 2～ 5 淡黄 光滑 无 整齐规则 厚边缘 中央图 5.1 至图 5.5 为五株菌的菌落照片：图 5.1Ⅰ号菌Fig5.1Strain No.123重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果图 5.2 Fig5.1Ⅱ号菌 Strain No.2图 5.3 Fig5.1Ⅲ号菌 Strain No.3图 5.4 Fig5.1Ⅳ号菌 Strain No.4 表 5.5图 5.5 Fig5.1 五株菌的单菌特征Ⅴ号菌 Strain No.5Tab5.5 The feature of 5 single strains 特征 分类 形状 大小(um) 排列 革兰氏特性 有无芽孢 Ⅰ号菌 细菌 长杆 0.8～1×3～7 单个 阳性 无 Ⅱ号菌 细菌 椭球 0.5～0.6× 0.8～1 二链 阳性 无 Ⅲ号菌 细菌 短杆 0.8～1×2 单个 阴性 有 Ⅳ号菌 酵母菌 椭球 2～ 3× 4～ 7 单个 无 无 Ⅴ号菌 细菌 短杆 1× 2 单个 阴性 有24重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果图 5.6 至 5.10 为五株菌的单菌照片：图 5.6 Ⅰ号菌(10×100)Fig5.6Strain No.1(10×100)图 5.7Ⅱ号菌(10×100)图 5.8Ⅲ号菌(10×100)Fig5.7Strain No.2(10×100)Fig5.8Strain No.3(10×100)图 5.9 Ⅳ号菌(10×100)图 5.10 Ⅴ号菌(10×100)Fig5.9Strain No.4(10×100)Fig5.10Strain No.5(10×100)根据表 5.4 和表 5.5 结合表 5.1 至表 5.3 可以得知： ① 驯化选出的 5 株菌中，由 2 株来自醋醅，2 株来自窖泥，1 株在窖泥和黄25重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果水中都有。4 株为细菌，1 株酵母菌。霉菌和放线菌没有。 ② 在驯化过程中，随着培养基中乙醇浓度的增加，细菌、酵母菌的浓度逐渐 减少。 由开始驯化时 6 种细菌(表 5.1)最后只有 4 种， 酵母菌由 2 种(表 5.1 和表 5.2) 减少到 1 种，其它的都因为不耐高浓度乙醇的细菌因为条件苛刻逐渐死去。 ③ 从驯化过程来看，随着培养基中乙醇浓度的增加，葡萄糖浓度的减少，醋 酸菌的生长逐渐减慢，驯化到最后，培养基中只剩下 2 株醋酸菌(表 5.4)。这是因 为醋酸菌本来是利用乙醇生产醋酸，但乙醇在培养基中的浓度有一个合适的量， 过多的乙醇对醋酸菌的生长不一定有利。 ④ 霉菌和放线菌在初筛中长得比较好，种类也较多。但在驯化培养基中，一 直不见有两种菌的菌丝和菌落长出。可能是由于接种龄不是指数期，也可能是驯 化培养基条件太苛刻。在第二轮驯化后，固体平板富集培养基中也没菌落长出， 所以在第三轮驯化后将霉菌和放线菌淘汰。5.3 乙醇降解菌的复筛5.3.1 复筛步骤① 菌悬液的配制 将驯化选出的 5 种菌用血球平板记数法边稀释边记数，各配成 108 个/ml 的菌 悬液。 ② 复筛培养基的配制 按驯化培养基的成分分别配 5 种菌的复筛培养基(乙醇含量为 12ml/100ml 培养 基)，培养基 A 配 400ml 分装 4 个 100ml 的锥形瓶编号为 1、2、3、6,培养基 B、C 各配 100ml 编号 4、5，其中Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号用菌用相应标号的培养基 A 培养， Ⅳ号菌用培养基 B 培养，Ⅴ号菌用培养基 C 培养，编号 6 的培养基 A 用来培养 5 种菌的混合菌。 ③ 接种培养复筛 配好的菌悬液接种 2ml 于相应的复筛培养基中。复筛培养条件为：恒温摇床 160r/min 振荡，温度 30℃。每 24 小时取样一次测菌液浓度、乙醇浓度、pH 变化， 最后比较 5 种菌利用乙醇的情况，选出利用乙醇速度最快、生长最快的菌株做为 复筛结果。5.3.2 复筛结果将初筛菌驯化五轮后，培养液中乙醇浓度已加至 14ml/100ml。根据菌落形态 特征，筛选出 5 株能在高浓度的乙醇培养基中生长的菌株。它们降解乙醇的速度 以及在乙醇培养基中的生长情况各有不同，测得 5 株菌以及它们的混合菌培养液 中总乙醇含量、菌液浓度(OD600nm)和酸度随时间的变化。实验结果如下：26重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果表 5.65 株菌培养液不同时间的乙醇浓度Tab5.6 Ethanol consistence of culture solution in different time 时间 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 降解乙醇数 量(ml/天) 混合菌 10.62 9.07 8.44 7.98 8.29 7.67 0.48 Ⅰ号菌 10.62 9.22 8.29 7.67 6.73 4.25 1.17 Ⅱ号菌 10.62 8.29 8.13 6.42 4.87 2.85 1.45 Ⅲ号菌 10.62 9.22 7.98 6.73 6.11 5.80 0.86 Ⅳ号 10.62 8.44 8.13 6.73 6.42 5.49 0.92 Ⅴ号菌 10.62 8.91 8.29 7.20 6.73 7.05 0.61ethanol consistence（ml/100ml)10 7 4 1 0 2 4 Time（day ） 6混合菌 Ⅰ号菌 Ⅱ号菌 Ⅲ号菌 Ⅳ号菌 Ⅴ号菌图 5.11 Fig5.11培养液不同时间的乙醇浓度Ethanol consistence of culture solution in different time从表 5.6 和图 5.11 可以看出： 1) 随着时间的变化，培养基中的乙醇浓度逐渐减小。Ⅰ号菌和Ⅱ号菌分解乙 醇的能力比其它三种菌要强，平均每天降解乙醇的量分别为 1.17ml/100ml 、 1.45ml/100ml。 2) Ⅰ号菌和Ⅱ号菌比较，Ⅰ号菌在第 3 天和第 4 天的降解速度较慢。Ⅱ号菌 降解乙醇的速度一直很快，降解乙醇的总量也较Ⅰ号菌大，所以Ⅱ号菌降解乙醇 情况更好。 3) 而其它三株菌降解乙醇的能力相对较差。 Ⅳ号酵母菌分解乙醇可达 0.86ml/ 天。混合菌分解乙醇的效果不如单菌，可能是因为某两种菌之间有抑制作用。醋27重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果醅中选的Ⅴ号菌，只能利用低浓度的乙醇，高浓度乙醇对它来说已经饱和，所以 降解乙醇最慢。表 5.7 5 株菌培养液不同时间菌液浓度的变化Tab5.7 Consistence of culture solution in different time 时间 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 混合菌 0.003 0.005 0.008 0.017 0.015 0.014 Ⅰ号菌 0.006 0.010 0.009 0.014 0.013 0.012 Ⅱ号菌 0.004 0.016 0.005 0.011 0.012 0.017 Ⅲ号菌 0.003 0.011 0.007 0.007 0.008 0.008 Ⅳ号 0.020 0.022 0.022 0.019 0.018 0.023 Ⅴ号菌 0.008 0.010
0.009 0.013从表 5.7 可知： 1) Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号菌在培养的第一天和第二天，降解乙醇的量很大，生长速度 较快，菌液浓度大幅度增加，Ⅱ号菌增加的最快。第二天到第三天，部分菌的菌 液 OD 值下降，这可能是它们适应乙醇环境的一个过程 。但从第三天到第六天， 只有Ⅱ号菌的菌液浓度逐渐增加，而且增加的比较快。其它的菌的菌液浓度变化 没有规律，增长比较缓慢，这和它们降解乙醇的能力有关。 2) 微生物降解乙醇的过程包括：一部分乙醇被分解代谢后排出体外，另外一 部分乙醇需要较长时间转化为构建新生个体的生物量。所以，从菌液浓度的变化 来看，Ⅱ号菌能较快的降解乙醇，因而其生物量转化相对多，菌液浓度大幅度增 加。 3) Ⅳ号菌虽然降解乙醇速率也较快，但从表中可知其生长速度并不快，这可 能是因为酵母菌个体较大，细胞壁的成分不同于细菌，蓄积其结构物质需要其它 的小分子碳源，而乙醇不是它的最佳碳源。Ⅴ号菌自始至终菌液浓度变化不大， 只在最后一天，生长速度稍微快点，这说明它只能利用低浓度的乙醇，高浓度的 乙醇对它的生长有抑制作用。 总之，复筛过程中，Ⅱ号菌降解乙醇速度最快，生长速度最快。28重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果表 5.8Tab5.85 株菌培养液不同时间酸度的变化pH value of culture solution in different time时间 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天混合菌 7.41 7.40 6.82 6.64 6.88 7.27Ⅰ号菌 7.45 7.53 7.47 7.46 7.37 7.34Ⅱ号菌 7.38 7.32 7.21 7.15 7.02 6.88Ⅲ号菌 7.49 7.57 7.52 7.51 6.73 6.60Ⅳ号 7.05 6.67 6.33 4.96 5.87 5.6Ⅴ号菌 5.85 5.90 5.85 5.88 5.78 5.75从表 5.8 可以看出：Ⅱ号菌降解乙醇的同时，培养基的 pH 随着时间的变化逐 渐下降而且变化比较明显，所以它降解乙醇速度最快。它能利用乙醇在体内酶的 作用下代谢产酸，代谢途径可能是在 ADH 和 ALDH 催化下乙醇变为乙醛在变为 乙酸。而其它几株菌在乙醇降解的同时，酸度变化没有规律，可能它们体内还存 在着其它的代谢途径。 综上所述，在乙醇培养基中，这五株菌生长状况并不是很好，表明乙醇代谢 也并非是它们的主要代谢途径，乙醇不能作为他们的最佳碳源。但Ⅱ号菌降解乙 醇速度相对最快，而且菌液浓度增加最明显，酸度的变化也较大，所以，Ⅱ号菌 降解乙醇的效果最好，可以选定它作为乙醇降解菌进行深入研究。为了使Ⅱ号菌 长得更快，能够达到大规模的生产水平，必须寻找更好的碳源。5.4 最佳培养条件的研究5.4.1 乙醇降解菌最佳培养基的确定微生物生长过程中，培养基配制是否得当，对微生物的生长影响很大，尤其 是碳源、氮源及碳氮比的合理配制，因为它们三者之间关系比较密切，互相影响。 为此，对适合Ⅱ号菌生长的培养基最适碳源、氮源及碳氮比进行了研究。以碳源、 氮源、C/N 为因素，每个因素中又分四个水平设计正交表如表 5.9 示：29重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果表 5.9 因 1 2 3 4正交实验因素水平水平素Tab5.9 The factors and levels of the orthogonal 碳源 氮源 碳氮比(C/N) 葡萄糖 蔗糖 淀粉 无水乙醇 蛋白胨 KNO3 NH4Cl (NH4)2SO4 20 40 60 80按正交实验表的设计，配制液体培养基，包括碳源、氮源、无机盐、蒸馏水， 微量元素溶液 1%和磷酸盐缓冲液 2%，每种配 100ml，接种 2ml 浓度为 108 个/ml 的Ⅱ号菌菌悬液，于恒温摇床中 30℃，160r/min 振荡培养。每天取样一次测菌液 浓度、pH 变化，最后以菌液浓度为指标，以酸度变化为参考，选出最佳的碳源、 氮源、C/N 组合。正交实验结果如下：表 5.10 Tab5.10 实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 碳源 g 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 正交实验方差分析表(L16 43) 氮源 g 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3Scedasticity analyse of orthogonal test C/N 1 2 3 4 3 4 1 2 4 3 2 1 2 1 4 OD 值 0.809 0.955 0.780 0.454 0.464 0.229 0.540 0.641 1.222 0.821 1.466 1.638 0.908 0.980 0.82730重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果续上表： 16 K1j K2j K3j K4j 4 2.998 1.874 5.147 3.418 0.5 1.5 0. 3.403 2.985 3.613 3.436 0.2 0.0 0. 3.967 3.970 2.768 2.732 0.5 0.0 0..703?yi ?116i=13.44k1 j k2 j k3 j k4 jRj opt?yi ?1162 i=13.32表 5.11 方差来源 碳源 氮源 C/N 误差 总和 平方和 1.38 0.052 0.511 0.174 2.121最佳培养基正交实验结果及计算 自由度 3 3 3 3 12 F值 7.98 0.300 2.95 F0.90(3,3)=5.39 显著性 *Tab5.11 The result and calculation of orthogonal test on the best medium表 5.10 和 5.11 的方差分析及显著性检验表明： ① 对Ⅱ号菌的生长影响最大的为碳源，最小的为氮源，C/N 居中。碳源的四 个水平 OD 值和平均 OD 值中以第三个水平的值最大，可知：碳源第三水平(淀粉) 最好。氮源的四个水平 OD 值和平均 OD 值中还是以第三个水平的值最大，可知： 氮源第三水平(氯化铵)最佳。C/N 比的四个水平 OD 值和平均 OD 值中以第二个水 平的值最大，可知：C/N 第二水平(C/N=40)较合适。 ② 碳源即为微生物提供生长繁殖所需的营养，又为其提供自身各种生理活动 所需的能源，因此碳源对Ⅱ号菌生长的影响极为显著。对同一种微生物而言，它 利用的碳源谱有一定的范围，这个范围的大小取决于微生物自身的主要代谢酶体 系。实验中，Ⅱ号菌可以分别利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、乙醇作唯一的碳源，而 且它对淀粉的利用程度最高，其次为乙醇，表明它体内有淀粉水解成葡萄糖以及 葡萄糖酵解的一系列酶，另外还有乙醇代谢酶体系，但乙醇代谢并不是Ⅱ号菌的 主要代谢途径。31重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果③ C/N 对微生物生长的影响也不能忽视，培养基的 C/N 一般在 10 到 200 之 间变动，根据不同微生物的需要以及所达到的目的而定，低的 C/N 有利于微生物 体内代谢酶的产生，从而满足微生物个体生长所需的正常代谢，高的 C/N 有利于 微生物的生物量的累计从而满足微生物的群体生长即繁殖后代。实验中选出的最 佳 C/N 为 40,即不太低又不太高，可以同时满足Ⅱ号菌群体生长和个体生长。 本实验在不同培养基正交实验的过程中，测定了各种培养基酸度随时间的变 化情况，结果如下：表 5.12 Tab5.12 酸度 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 第1天 6.01 6.32 6.58 6.61 7.01 7.17 6.86 7.16 7.08 7.34 7.16 7.13 6.68 7.32 7.15 7.23 第2天 4.84 6.09 5.69 5.54 4.33 7.01 6.2 6.07 7.12 7.2 6.97 6.79 6.96 7.28 7.13 7.12 最佳培养基实验酸度表pH value in the selection of the best medium 第3天 4.59 3.06 4.49 4.47 4.44 5.12 4.53 4.68 7.13 7.46 6.3 6.49 6.78 7.2 6.91 7.11 第4天 4.56 2.83 4.47 4.42 4.41 4.81 4.52 4.71 6.43 7.5 4.96 4.35 6.89 6.99 6.72 6.68 第5天 4.5 2.86 4.52 4.54 4.42 4.88 4.51 4.86 5.69 7.75 3.63 3.83 6.98 6.38 6.68 6.42 第6天 4.35 2.92 4.56 4.56 4.47 4.88 4.53 5.31 6.77 6.88 3.29 3.66 6.96 5.3 6.56 6.36 第7天 3.26 2.97 3.4 3.76 4.5 4.94 4.61 6.13 6.6 6.53 3.23 3.26 6.63 4.6 6.07 6.14 方差 9.4 15.4 14.4 14.0 4.4 45.4 0.2 2.4注：方差是对第 1 天到第 7 天的酸度求的，反映了这七天中酸度的变化32重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果根据表 5.12 中数据可知： ① 16 组实验中酸度都有所下降，有的从第 1 天到第 7 天一直在下降，有的在 中间有所回升，但总的趋势是下降。在乙醇为碳源的几组实验中，酸度虽然有所 下降，但其变化并不明显，在前面正交实验分析中其 OD 值的变化并不是最大的， 因此Ⅱ号菌虽然可在乙醇培养基中生长，但乙醇并非它的最佳碳源。11 组和 12 组 的酸度变化较明显，方差值分别为 45.3259 和 41.3464，说明Ⅱ号菌在这两种培养 基中代谢产酸较多，生长速度较快，所以 11 组和 12 组培养基的配比相对较合理。 但 11 组和 12 组比较，11 组酸度变化较 12 组大，而且一直成下降趋势。11 组培养 基的配方更适合Ⅱ号菌的生长。 ② 由 OD 值变化和酸度变化可知：11 组培养基配方为最优水平组合，即淀粉 作碳源、氯化铵作氮源、C/N 为 40 配制的培养基为Ⅱ号菌的最佳培养基。其具体 配方为：淀粉 3g，NH4Cl 0.15g, K2HPO4?.3H2O 0.1g， NaCl 0.04g, MgSO4.?7H2O 0.05g，FeSO4?7 H2O 0.001g，磷酸盐缓冲液 1ml，微量元素溶液 0.5ml，蒸馏水 100ml，pH 自然。5.4.2 最适宜生长条件的确定根据正交实验数据分析，选出的最佳培养基的配方作为Ⅱ号菌的培养基，做 单因素对菌体生长及乙醇脱氢酶活性的影响研究，以温度、pH 值、溶氧、接种量 四个因素开展实验研究。 1) 培养基的配制 配 2000ml 最佳培养基，分装 18 个 100ml 的三角瓶，100ml/瓶，灭菌后分别 标号 1 至 18 备用。 2) 菌悬液的配制 将复筛出的分解乙醇效果最好的菌配成 108 个/ml 的菌悬液 30ml， 再分别配 107 个/ml、5× 107 个/ml、5× 108 个/ml、109 个/ml 该菌的菌悬液 10ml，用磁力搅拌器搅 拌均匀备用。 3) 接种培养 4) 单因子实验 a．温度的影响 取 1 至 5 号瓶，分别接种 108 个/ml 的菌悬液 2ml，pH 值自然，分别于 30℃、 35℃、37℃、40℃、45℃下，160r/min 振荡培养。每天取样测菌液浓度、酸度变化。 考察不同温度对Ⅱ号菌生长的影响。33重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果表 5.13 Tab 5.13 温度 30℃ 35℃ 37℃ 40℃ 45℃ 第1天 0.041 0.041 0.041 0.041 0.041 第2天 0.069 0.061 0.11 0.06 0.061温度对菌液浓度的影响 第3天 0.177 0.478 0.801 0.071 0.053 第4天 0.56 0.58 1.095 0.124 0.072 第5天 0.51 0.519 1.198 0.115 0.062 第6天 0.662 0.61 1.306 0.115 0.073Effection of temperature on consistence of culture solution2Value of OD1.6 1.2 0.8 0.4 0 1 2 3 4 5 Time(day) 6 730℃ 35℃ 37℃ 40℃ 45℃图 5.12不同温度下菌液浓度变化曲线 at different temperatureFig5.12 The changing curve of culture solution consistence表 5.14 Tab 5.14 培养 温度 30℃ 35℃ 37℃ 40℃ 45℃温度对菌液酸度的影响Effection of temperature on pH value of culture solution 第2天 6.73 6.74 6.63 6.75 6.74 第3天 5.68 5.62 4.02 6.46 6.73 第4天 5.55 5.41 4.01 6 6.69 第5天 5.74 5.19 3.49 5.53 6.65 第6天 4.67 4.82 3.4 5.49 6.62第1天 7.07 7.07 7.07 7.07 7.0734重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果8Value of pH6 4 2 0 1 2 3 4 Time(day)图 5.13 不同温度下菌液酸度变化曲线30℃ 35℃ 37℃ 40℃ 45℃ 5 6 7Fig5.13 The changing curve of culture solution pH value从表 5.13、表 5.14 和图 5.12 和图 5.13 得到以下结论： 1) Ⅱ号菌在 37℃下振荡培养时，菌液的 OD 值和酸度变化最大，菌体生长最 快。可见，37℃是Ⅱ号菌的最适生长温度。 2) 从图可知：其它几个温度下，菌液浓度也随时间逐渐增大，但 OD 值变化 相对要差些。酸度变化也不明显。在 37℃下，Ⅱ号菌从第 2 天到第 3 天，它的 OD 值上升最快，说明这是它的对数生长期。在以后几天，可能是淀粉液化造成的 OD 值减小对其总的 OD 值影响不大，所以 OD 值一直在上升，但上升的幅度较小。在 30℃-35℃时，由于主要代谢酶的活性降低，所以 30℃时，菌在第 3 天才进入对数 期，菌体浓度增加缓慢。35℃时，菌在第 2 天进入对数生长期，菌液 OD 值变化 较大，pH 值变化也较大。第 4 天后 OD 值先有所下降，然后又上升。可能是由于 Ⅱ号菌利用培养基中淀粉使菌体大量生长，菌液的 OD 值增加，同时，淀粉被分 解成葡萄糖使菌液的 OD 值大大减小，OD 值减少更多，表现为总的菌液 OD 值降 低。 3) 在 40℃和 45℃时，菌体生长缓慢，OD 值没有太明显的变化，也没有对数 期出现。可能是因为温度太高，菌体内主要代谢酶的结构发生改变，酶性降低， 营养物到体内后不能被催化分解，只能维持最基本的个体生长，而且生长缓慢。 综上所述，每一种微生物都有一个最适的生长温度，高于和低于此温度，它 的生长都要受到影响。在微生物合适的温度下，菌液浓度随时间逐渐增加，酸度 的变化刚好相反。上面的图表表明菌液浓度变化和酸度变化的趋势，即 37℃是Ⅱ 号菌的最适温度。 b．pH 值的影响 取 6 至 10 号瓶，分别用 1mol/L 的 NaOH 和 HCl1mol/L 调节五个不同的初始 pH 值，分别为 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5，然后接种 108 个/ml 的Ⅱ号菌菌悬液 2ml，35重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果放恒温摇床 30℃，160r/min 振荡培养。测定六天内菌液 OD 值以及培养基的酸度 变化。结果如下：表 5.15 Tab 5.15 培养基 初 pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 pH 对菌液浓度的影响Effection of pH value on consistence of culture solution 第2天 0.139 0.103 0.077 0.074 0.066 第3天 0.154 0.181 0.368 0.451 0.294 第4天 0.154 0.227 0.357 0.636 0.537 第5天 0.15 0.203 0.358 0.826 0.635 第6天 0.166 0.268 0.39 1.193 0.741第1天 0.041 0.041 0.041 0.041 0.0411.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 Time(day)图 5.14 不同 pH 下菌液酸度变化曲线pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0 pH7.5 5 6 7Valu of ODFig5.14 The changing curve of culture solution pH value 表 5.16 培养基 初 pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 不同初 pH 时酸度随时间变化Tab5.16 The changing of pH value in different initiation pH 第1天 5.5 6 6.5 7 7.5 第2天 5.55 5.96 6.32 6.7 7.03 第3天 4.34 4.32 4.34 5.61 6.45 第4天 4.2 4.26 4.16 4.34 6.14 第5天 4.31 4.35 4.35 3.19 6.18 第6天 4.28 4.31 4.35 2.76 6.0136重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果8Value of pH6 4 2 0 1 2 3 4 Time(day)图 5.15 培养液不同初 pH 时酸度随时间变化pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0 pH7.5 5 6 7Fig5.15 The changing curve of pH value in different initiation pH根据上面的表 5.15、表 5.16 和图 5.14 和 5.15 可以看出： 1) 培养基初始 pH 为 7.0 时，菌的生长速度最快。此时培养液中酸度下降也最 快，菌体产酸时间最长，所以初始 pH 为 7.0，对菌体的生长最为有利。 2) Ⅱ号菌在初 pH7.0 时，从接种的第 2 天到第 6 天，菌液浓度都一直在快速 的增高，酸度一直在下降，生长速度和产酸速度才谐调。而其它几个不同初始 pH 的培养液(pH5.5、6.0、6.5)在接种后第 2 天和第 3 天产酸较快，对菌体的生长产生 了抑制作用，菌液浓度增长非常缓慢。第 3 天后产酸与。证明这种菌在代谢生长 中，产酸的这一步存在着反馈抑制。初始 pH 为 7.5 的培养基中，Ⅱ号菌生长速度 快，但产酸的速度太慢。 3) 微生物都有自己的最适 pH，Ⅱ号菌的最适 pH 为 7.0，因为Ⅱ号菌胞内酶 的最适 pH 接近中性，中性 pH 保护了 DNA、ATP 或 RNA、磷脂类免被碱破坏， 而周质空间中的酶和胞外酶的最适 pH 则较接近环境的 pH，该菌的细胞内含酶较 多，需中性的环境维持其活性。 总之，对不同微生物的生长 pH 来说，存在最高、最适、最低三个数值。Ⅱ号 菌在 pH 值为 5.5― 7.5 的范围内都可以生长， 但在初始 pH 为 7.0 时生长速度最快， 说明这是它的最适 PH。 c．接种量的影响 取 11 至 15 号瓶分别接种 107 个/ml、5× 107 个/ml、108 个/ml、5× 108 个/ml、109 个/ml 该菌的菌悬液 2ml，自然 pH 值，放恒温摇床 30℃，160r/min 振荡培养。实 验结果如下：37重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果表 5.17接种量对菌液浓度变化的影响Tab5.17 The effection of inoculation quantity on culture solution consistence 接种量 (个/ml) 107 5×107 108 5×108 109 第1天 0.039 0.041 0.042 0.043 0.046 第2天 0.071 0.076 0.067 0.1 0.109 第3天 0.606 0.484 0.424 0.893 0.797 第4天 0.694 0.577 0.502 1.318 1.11 第5天 0.708 0.493 0.52 1.32 1.126 第6天 0.768 0.512 0.526 1.328 1.2361.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 Time(day)图 5.16 不同接种量时菌液浓度变化曲线107 系列2 系列3 系列4 系列5 5 6 7Value of ODFig5.16 The changing curve of culture solution consistence in different inoculation quantity 表 5.18 不同接种量对培养液酸度的影响 on culture solution pH value 接种量 (个/ml) 107 5×107 108 5×108 109 第1天 7.07 7.07 7.07 7.07 7.07 第2天 6.63 6.56 6.6 6.61 6.58 第3天 4.09 4.36 4.32 5 6.03 第4天 4.39 4.45 4.27 4.17 3.97 第5天 4.37 4.52 4.23 4.11 3.78 第6天 4.31 4.54 4.39 3.99 3.55Tab5.18 The effection of inoculation quantity38重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果8 6 4 2 1 2 3 4 5 Time(day) 6 7 10 系列2 系列3 系列4 系列5Value of pH图 5.17不同接种量时菌液酸度变化曲线 different inoculation quantityFig5.17 The changing curve of culture solution pH value in从表 5.17、表 5.18 和图 5.16、图 5.17 可知： 1) 当接种量为 5× 108 个/ml 时，菌液 OD 值最大，菌体生长最快，产酸速度也 较快，所以这个接种量对该菌来说最合适。而其它几个接种量对菌的影响不很明 显。 2) 接种量影响微生物生长周期。接种量太大，延滞期短。接种量太小，延滞 期长。另外，几个不同的接种量的Ⅱ号菌在第 1 天就进入延滞期。第 2 天后，都 进入对数期，只是对数期的时间长短不同，生长繁殖速度不一样。 3) 接种量相对大的两个样品，Ⅱ号菌繁殖要快些。但由于接种量大，对数期 过量繁殖，新的个体会争夺营养和环境中的 O2 等，总体上表现为生长速率降低。 4) 接种量最大的培养基中，Ⅱ号菌产酸速度较慢，直到第 3 天酸度明显下降。 到第 4 天，此时，营养物已经耗尽，所以菌液浓度增加缓慢。而其它三个接种量 的培养液在培养第 2 天后(即进入对数期)，酸度急剧下降，菌体明显增加，第 3 天 不见明显生长，菌液浓度下降。这可能是产物的反馈抑制造成的。 综上所述，接种量的大小对微生物的生长影响很大。接种量太大，微生物之 间会相互竞争营养，造成营养供给不上，影响微生物的正常生长。接种量太小， 营养过剩，造成不必要的浪费，短时间内不能大量繁殖，影响生物量的积累。对 Ⅱ号菌而言，它的最适接种量为 5× 108 个/ml。5.4.3 乙醇脱氢酶活性测定乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)构成了哺乳动物和微生物体内乙醇代 谢的主要氧化通路，是体内乙醇代谢的主要限速因素。它们具有很高的催化乙醇39重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果效能，而且能以乙醇为底物进行专一的 结合，并催化底物发生反应。为了对Ⅱ号 菌代谢乙醇进行深入的探讨，测定了乙醇脱氢酶的活性，以验证温度、接种量、 及 pH 值和氧气 4 个因子对酶活的影响以及培养基中不同碳源对酶活的影响。 实验 结果如下： ① 不同温度对Ⅱ号菌的乙醇脱氢酶活性的影响 接种Ⅱ号菌 108 个/ml 的菌悬液 2ml，培养液 pH 值自然，分别于 30℃、35℃、 37℃、40℃、45℃下，恒温摇床中 160r/min 振荡培养。测得 ADH 活性如下：表 5.19 Tab5.19 培养 温度 30℃ 35℃ 37℃ 40℃ 45℃ 1min 0.05 0.043 0.035 0.033 0.038 不同温度下乙醇降解菌的 ADH 活性 酶活力 (U) 8.5 25.5 17 76.5 68ADH activity ethanol-degradation bacteria at different temperature 2min 0.050 0.044 0.036 0.037 0.040 3min 0.050 0.045 0.036 0.040 0.041 4min 0.051 0.046 0.036 0.040 0.043 5min 0.051 0.046 0.037 0.042 0.046 △A/4 0.75 0.25 0.00200100activity of ADH80 60 40 20 0 30 35 40 T(℃) 45 50图 5.18 不同温度下 ADH 的活性 Fig5.18 ADH activity ethanol-degradation bacteria at different temperature根据上面表 5.19 和图 5.18 可以看出： 1) Ⅱ号菌菌株在 40℃培养时 ADH 活力最大。由于每种酶都有一个最适反应 温度，在最适温度的两侧，反应速度即酶的活性都比较低。因此，ADH 的最适温 度为 40℃。 2) 温度对酶的活性影响较大，温度太高和太低会引起酶的结构改变，其催化40重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果活性就会降低，催化反应的速度也会减慢，表现为菌体生长缓慢，代谢速率降低。 ② 不同接种量对 ADH 活性的影响 分别配Ⅱ号菌的菌悬液 107 个/ml、5× 107 个/ml、108 个/ml、5× 108 个/ml、109 个/ml，各接种 2ml，自然 pH 值，放恒温摇床 30℃，160r/min 振荡培养，最后测 定 ADH 的活性。实验结果如表 5.22 和图 5.21 所示：表 5.20 Tab5.20接种量不同接种量乙醇降解菌的 ADH 活性(个/ml) 107 5×107 108 5×108 109ADH activity ethanol-degradation bacteria at different inoculation quantity 酶活力 1min 2min 3min 4min 5min △A/4 (U) 0.017 0.009 0.011 0.015 0.021 0.022 0.013 0.013 0.019 0.025 0.024 0.016 0.015 0.022 0.028 0.026 0.018 0.019 0.024 0.030 0.25 0.00 0. 110.5 85 102 1020.015 0.005 0.009 0.012 0.018140 120Activity of ADH100 80 60 40 20 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Value of OD图 5.19 不同菌液浓度下 ADH 的活性Fig5.19ADH activity ethanol-degradation bacteria at different inoculation quantity从表 5.20 和图 5.191 可得到以下结论： 1) 接种量对 ADH 的活性没有很明显的影响，间接可知，接种量越大，说明酶 浓度越高，反之亦然。 2) 酶活与酶浓度没有直接的关系。底物浓度一定，如果酶浓度超过使底物饱和41重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果的特定值，在其它条件相同的情况下，酶的反应活性不会有很大的变化。本组实验 数据中， 菌液浓度在 0.39 与 0.512 之间时， 酶使底物饱和的浓度已超过这一特定值， 所以酶活性相差不大。 ③ pH 对 ADH 活性的影响： 用 1mol/L 的 NaOH 和 HCl 调节培养液初始 pH 值分别为 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5，接种 108 个/ml 的Ⅱ号菌菌悬液 2ml，放恒温摇床 30℃，160r/min 振荡培养， 测定 ADH 的活性。实验结果如表 5.23 和图 5.22 所示：表 5.21 不同 pH 下乙醇降解菌的 ADH 活性 Tab5.21 培养基 初 pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 1min 0.017 0.040 0.028 0.020 0.001 ADH activity ethanol-degradation bacteria at different pH value 2min 0.018 0.041 0.029 0.029 0.007 3min 0.018 0.042 0.030 0.030 0.011 4min 0.018 0.044 0.031 0.030 0.014 5min 0.019 0.045 0.035 0.031 0.016 △A/4 0.75 0.75 0.00375 酶活力 (U) 17 59.5 68 93.5 127.5140 120 100 80 60 40 20 0 5 5.5 6 6.5 pH 7 7.5 8Activity of ADH图 5.20 Fig5.20不同 pH 下乙醇降解菌的 ADH 活性ADH activity ethanol-degradation bacteria at different pH value从表 5.21 和图 5.20 可得到如下结论： 1) pH 为 7.5(终 pH 为 6.01)的培养液中 ADH 活性最高，其次是 7.0 的。 大部分酶的活力受其环境 pH 值的影响，该 pH 值就是酶反应的最适 pH 值，在高于 或者低于最适 pH 值下，酶反应最大速度都会下降的。42重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果2) 测酶活时， 培养液的 pH 值即环境 pH 值已不是最初的 pH 值， 而分别为 4.28、 4.31、4.35、2.76、6.01。从图可知，酶活― pH 的变化图呈倒钟型环境 pH 值为 6.01 时酶活性最高，其次为 2.76。 3) 酶活最大的环境 pH 值为 6.01， 其对应的菌液浓度为 0.741， 这是因为该菌的 酶浓度足够反应所需的最低酶浓度。而其它三个酶的浓度不够反应所需的最低酶浓 度，所以酶活较小。 4) 据报道， 人体及酵母菌体内的 ADH 反应的最适 pH 为 8.6― 9.0。本组实验没 有得出 ADH 的最适 pH， 但可推测 ADH 的最适 pH 偏碱。 同时间接反应了酶浓度对 其酶活性的影响，即底物(乙醇)浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度跟酶浓度 成正相关。 ④ 培养基溶氧对 ADH 活性的影响 配 3 瓶培养基，一瓶放恒温摇床 30℃，160r/min 振荡溶氧一天，然后接种 108 个/ml 的菌悬液 2ml 同条件培养；一瓶不溶氧直接接种同条件培养；另一瓶 30℃静 止培养。接种好的三角瓶按上面要求培养，测定 ADH 的活性，结果如下：表 5.22 Tab5.22 溶氧 溶氧一天 不溶氧 静止 乙醇培养基 不同溶氧下乙醇降解菌的 ADH 活性ADH activity ethanol-degradation bacteria at different quantity of oxegen 1min 0.011 0.040 0.001 0.004 2min 0.017 0.043 0.003 0.011 3min 0.023 0.046 0.004 0.017 4min 0.026 0.049 0.007 0.020 5min 0.028 0.054 0.010 0.021 △A/4 0.50 0.25 酶活力(U) 144.5 119 85 144.5从表 5.22 的数据分析可知： 1) 接种前溶氧一天的培养基中得到的 ADH 活性最大， 静止培养的 ADH 活性 最小。 2) 氧气对 ADH 活性是一个重要因子。也进一步说明了乙醇在该菌株体内的 代谢途径：乙醇氧化成乙醛，再被氧化成乙酸，ADH 和 ALDH 的辅酶均为 NAD+。 而 NAD+受氢后变为还原型的 NADH，然后 NADH 经呼吸链将氢递给氧气，最后 氧受氢生成水，其中还伴随着能量的储存。 3) 乙醇脱氢酶(ADH)在氧气越充足时，酶活性越高，越促使酶反应平衡向正 方向移动，代谢速率加快。 4) 最后一组是乙醇为碳源的培养基，测定结果表明其 ADH 活性大于淀粉为43重庆大学硕士学位论文5实验步骤及结果碳源的培养基中 ADH 的活性。乙醇的存在不会使 ADH 的活性提高。可能是该菌 在高浓度乙醇培养基中长期驯化，强化了乙醇代谢，提高了 ADH 的活性所致。 综述上面四个因素对 ADH 的活性的影响， ADH 的最适温度和最 pH 并不是该 菌株生长的的最适温度和 pH，这说明 ADH 并不是该菌株的的主要代谢酶，乙醇 代谢也并非它的主要代谢途径。同时，大多数好氧微生物的主要代谢酶为蛋白酶 及其相应的氨基酸转换酶系、多糖酶及相应糖酵解酶系、脂肪酶及相应的氧化酶 系还有三羧酸循环酶系等，只有一些特殊的微生物有其特定的代谢酶系。所以， 乙醇降解菌可能还存在其它降解乙醇的酶。5.5 乙醇降解菌的生长曲线Ⅱ号菌能在乙醇的含量达 14ml/100ml 的培养基中还能很好的生长繁殖。具有 自身的分解代谢和合成代谢，也具有自己的生长周期。即四个主要过程：延滞期、 对数期、稳定期和衰亡期。为了对Ⅱ号菌进行全面的了解，在最佳培养基和最适 培养条件下，用比浊法和活菌记数相结合的方法绘制了它的生长曲线。5.5.1 比浊法测定生长曲线① 菌种活化 配 5× 108 个/mlⅡ号菌的菌悬液 20ml，在恒温摇床中 30℃，160r/min 振荡培养 18― 20 小时备用。 ② 接种培养 配制最佳培养基，接种后分装 40 个小试管(5ml/个)，分别标号 2、4、6、8、 10、… … 40h，共 20 组，每组 2 个平行实验。在最佳条件下培养，每 2 个小时按 标号取 2 个试管出来测菌液浓度，以时间为横坐标，菌液 OD 值为纵坐标绘制乙 醇降解菌的生长曲线。5.5.2 平板菌落活菌计数法测定生长曲线配固体培养基倒 60 个平板备用，每 2 小时取样，将菌液按系列稀释法稀释至 10 ， 12 小时及其以前的样品取 10-7、 10-8、 10-9 三个稀释度， 12 小时以后的取 10-9、 10-10、10-11 三个稀释度。用微量加样枪各取 50ul 稀释好的样品涂布接种于相应的 固体平版上，放 37℃生化培养箱培养 3― 4 天直至长出菌落然后计数，以时间为横 坐标，各培养期的细菌数对数为纵坐标，作图绘制生长曲线。实验结果如下：表 5.23 时间 (h) 2 乙醇降解菌不同时间的生长情况 Lg 细胞 数 10.093-11Tab5.23 The growth circumstence of ethanol degradation at different time 平板菌落数 Lg 细胞 平板菌落数 时间 OD600nm OD600nm (h) (×108) 数 (}