2微克RNA反转录后的cDNA浓度大约为多少
可以大概估算.考虑一下几个因素：1.大多数RNA是28s,16s ,5s等rRNA,mRNA其实占少数.他们都会反转录为cDNA..你若估计mRNA反转为cDNA的量较难.2、反转录和你添加的引物量有关.假设你加了1份引物,那就只能转录1分cDNA,按100%的反转效率计算,你能合成大概2ug cDNA.若你添加了2份引物,那就只能转录2份cDNA,按100%的反转效率计算,你能合成大概4ug cDNA.这些都是估算.3.你问的是浓度,我上面大概估算了下量.折算为浓度时,须看你做上述反应,用的反应体系是多大?50ul?100ul?有估算量和反应体系,你大概就能算出cDNA的浓度啦.4.尽管能基本估算出浓度,但是这样做,意义不大.
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扫描下载二维码　　尽管新一代测序的费用在不断下降，但仍然不是小case。我们还需要最大限度地利用一次测序反应来获得最多的有用数据。在RNA中，核糖体RNA（rRNA）的丰度最高，占到总RNA的80%以上。这些rRNA所含的转录组信息很少，浪费了宝贵的测序资源，也让特定类型RNA的检测变得困难。
为此，QIAGEN推出了GeneRead rRNA Depletion Kit，能高效去除总RNA中的rRNA，同时确保mRNA和非编码RNA的完全回收。这个试剂盒能够提高有用数据的比例，保留非编码RNA，因此能够从复杂样品中获得清晰的NGS结果。
GeneRead rRNA Depletion Kit采用一种高效且特异的杂交方法来选择性去除rRNA。这种方法是基于特异寡核苷酸探针的杂交，这些探针可与大的（18s、28s）、小的（5s、5.8s）及线粒体（12s、16s）rRNA杂交。RNA:DNA杂合体被抗体识别，而产生的抗体-杂合体复合物被蛋白G磁珠高效捕获。随后将磁珠从样品中分离，从而去除rRNA。rRNA去除后的样品保留了RNA种类的多样性，包含poly A mRNA、非腺苷化mRNA、非编码RNA以及调控RNA。
与亲和标记法不同，只有杂交后的探针才能被抗体和磁珠捕获系统所识别。因此反应十分高效、快速。残留探针可通过RNeasy& MinElute& Cleanup Kit的RNA纯化来去除。从杂交、捕获到RNA纯化，大部分步骤都可在QIAcube&全自动核酸纯化仪上自动完成。
据介绍，GeneRead rRNA Depletion Kit可高效去除所有种类的rRNA，包括4种主要的核糖体RNA及线粒体rRNA。QIAxcel数据显示，大鼠脾脏总RNA中的18S和28S核糖体RNA已被完全去除。通过qRT-PCR分析去除后的样品，结果显示超过99.9%的核糖体RNA被此试剂盒去除。
在高效去除rRNA的同时，它也保留了其他类型的RNA，而不用担心引入偏向。与传统的poly A纯化相比，这种方法能够保留非腺苷化mRNA和非编码RNA，从而实现对RNA调控和编辑的研究，增进我们对转录组的了解。
GeneRead rRNA Depletion Kit的特点：
•&高效去除超过99.9%的核糖体RNA•&保留其他类型RNA•&从人、小鼠和大鼠等多个物种中高效去除rRNA•&提高信噪比，带来低丰度RNA的灵敏检测•&充分利用昂贵的测序技术
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【求助】做反转录时用多少体积的总RNA
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这个帖子发布于10年零248天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠：最近在作RT-PCR。由于没有条件，所以不能测定总RNA的OD260/OD280,也无法知道RNA的浓度。我在提RNA时用的是动物组织，100mg，加了1ml生工的TRIzol。RNA沉淀用了30ulDEPC水溶解。请问作RT时一般取几微升总RNA？我的RT体系是20ul，反转录酶20U，Oligo （dT）18为引物。谢谢了。
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还是得测OD值，不同组织部位的RNA含量不同，100mg组织可以提的RNA量大约在10ug到100ug之间，因为范围还是比较大，你加30ul水溶解不能确定是浓还是稀，我用宝生物的RT－PCR试剂盒，它是10ul逆转录体系中含1ul模板RNA（含量小于500ng），最后的PCR体系是总体积50uL（含10ul的逆转录体系）。逆转录时样品RNA的浓度应该在500－1000ng/ul。
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其实做RT对于RNA的量要求不是特别严格,由于你所给的信息实在很少,我只能根据我的经验给你答案,希望对你有帮助.看的出你是按组织提RNA的标准流程做的,如果你确保你的操作没有问题的话,你加30μlDEPC水溶解的话,你的总RNA浓度大约应该在600μg/ml,260/280大约在1.8~2.1之间.这样你的20μl体系需要多少就可以很容易的算出来了.祝实验顺利!
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1.其实还有一个更加简单得方法,我们实验室得紫外老是出毛病,我们一般就根据MAKER得亮度来估计浓度,大约是多少心中有数,RT不需要太复杂得程序.2.点上4ul得DL2000(天为时代),然后取2ulRNA来跑电泳,然后比较两者得亮度,一般说来,RNA比DL2000亮个2倍左右,就挫挫有余了,不过这样估算,多余得RNA可能会浪费,但是在没有仪器得情况下,这个方法比较好.祝你好运!
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非常感谢各位热心人的帮助，我心中有数了。祝大家工作顺利！
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关于丁香园RNA是如何反转录成cDNA的?过程和原理怎样?我做反转录的操作步骤是先加RNA、OligodT、随即引物、水,65C反应10min,冰上放置5min后,再加dNTP,RNaseA,BUFFER,MTV逆转录酶,反应25℃10min,37℃60min,70℃10min.我想请教每一步的原理,为什么这么做?
操作步骤是先加RNA、OligodT、随即引物、水65C反应10min,冰上放置5min后：这一步是让RNA变性,把RNA的二级结构打开；再加dNTP,RNaseA,BUFFER,MTV逆转录酶,反应25℃10min：这一步是让反转录引物（oligodT,随机引物）和模板RNA退火结合37℃60min：这一步是反转录酶的工作温度70℃10min：这一步是变性,把合成的cDNA和RNA变性开,就拿到单链的cDNA
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