工具类服务
编辑部专用服务
作者专用服务
活动性人巨细胞病毒感染的病毒基因表达特点
目的:探讨活动性人巨细胞病毒(HCMV)感染的病毒基因表达特点.方法:建立持续稳定感染(A组)及活动感染(B组)两种细胞感染状态,FQ-PCR和RT-PCR法监测HCMV DNA复制和MCP mRNA转录,免疫组化法联合计算机病理图文分析系统检测pUL44表达水平,光镜观察细胞病变、电镜检查细胞超微结构改变.结果:B组HCMV DNA负荷量(5.61～9.04 lgGE/106HEL)明显高于A组(4.32～5.91 lgGE/106HEL,P&0.05或P&0.01),pUL44也持续升高表达(area:339.6～1 431.9μm2,IA:56.4～319.8,P&0.01),MCP mRNA水平逐渐升高.A组pUL44少量、随机表达(area:219.2～296.7μm2,IA:31.0～58.3),未检到MCP mRNA,亦未发现细胞病变,B组出现进行性加重的细胞病变和细胞超微结构破坏.结论:HCMV DNA负荷量持续升高及MCP mRNA转录是活动性HCMV感染的重要标志.
作者单位：
广东省医学科学院,广东省人民医院妇产科,广州市,510080
年，卷(期)：
机标分类号：
在线出版日期：
本文读者也读过
相关检索词
万方数据知识服务平台--国家科技支撑计划资助项目（编号：2006BAH03B01）(C)北京万方数据股份有限公司
万方数据电子出版社您当前的位置：&&&&&正文
巨细胞病毒感染
　　【概述】　　CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。　　【诊断】　　单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于诊断。　　一、病毒分离　　最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种?人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应(CPE)在1天或数周后出现，经固定和HE染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象&猫头鹰眼&(owl&s eye)亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。　　二、血清抗体检测　　最常用的有补体结合试验(CF)、间接免疫荧光试验(IIF)、免疫酶试验(EIA)、间接血凝试验(IHA)和放射免疫试验(RIA)等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。　　三、DNA探针　　已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。　　四、聚合酶链式反应(PCR)　　(一)标本的采集及处理　　采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层(buffy coats)可保存于-80℃;尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。　　尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇(PEG6000)进行预处理：50&l尿上清与50&l 20%PEG6000和25&l 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h;15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增;扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。　　(二)模板DNA的制备　　1.由血液标本制备模板DNA　　方法A：向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L;取10&l 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。　　方法B：由血沉棕黄层(BCP)制备：①用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。② 加入500&l 6mol/L盐酸胍，匀浆。③ 加?30&l 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30&l20% Sarcosyl和5&l 蛋白酶K(10mg/ml)，混合均匀，60℃反应1h。④ 加入1130&l 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃备用。　　2.由冰冻组织标本制备模板DNA：① 用恒冷切片机切取一块5～10&m冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用缓冲液配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④ 于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400&g/ml蛋白酶K)，使刚好浸没沉淀物(约50～100&l );将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥ 37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧ 离心收集上清，取1～10&l 即可进行PCR扩增。　　3.由尿液标本制备模板DNA：①100&l 尿上清液与100&l 6mol/L异硫氰酸胍，7&l 2mol/L NaCl和20&l 玻璃粉悬液(DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo)混合。② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗?次，6400r/min离心1min。④ 同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50&l 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥ 15000r/min离心2min，收集上清(含HCMV DNA)，进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。　　(三)引物及探针　　引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。　　(四)PCR扩增步骤　　1.10&反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。　　Taq DNA 聚合酶：5U/&l 。　　10&dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。　　引物：100pmol/L。　　2.常规PCR扩增　　10&反应混合物(50&l)反应缓冲液5&l　　10&dNTP 5&l　　模板DNA5&l　　Taq DNA聚合酶 0.2&l (IU)　　引物各0.5&l　　蒸馏水 3.8&l　　加1～2滴矿物油。　　将反应混合物于94℃加热5然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。　　表3 CMV PCR扩增所用的引物?探针　　3.套式(nested)PCR扩增：①反应混合物的组成同(2)，仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3，共721b)，各100pmol。于94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2&l 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后，于94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。　　(五)产物鉴定　　扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。　　1. 固相杂交：　　① 预杂交液为3&SSPE，5&Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。② 加入标记探针(10cpm/&g，2ng/ml)，杂交30～60min。③ 用0.2&SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④ 自显影。　　2. 液相杂交及电泳分析：　　① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20&l 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤ 电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。　　HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株;而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。　　在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：?先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA;然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。　　PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平;利用该系统，在4&104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出，较斑点印迹杂交提高2&103倍。　　PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。　　【治疗措施】　　巨细胞病毒感染的治疗，可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的免疫球蛋白制剂、干扰素及转移因子等。但这些药物并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一，各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近，美国学者研制出两种活疫苗，初试后颇见效。一种是由AD169菌株研制成的;另一种是从TOWn菌株制成的，经非肠道给药后，已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能，CMV抗体升高，导致免疫功能增强。　　【病原学】　　CMV属于疱疹病毒群，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，其形最大由162个壳粒(capsomer)，正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。CMV只能在人纤维母细胞培养中增殖，而不能在其他动物细胞中生长，增殖非常缓慢，初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞;细胞变园，膨胀，细胞及核巨大化，核周围出现一轮&晕&的大型嗜酸性包涵体。　　CMV在20%乙醚中最多存活2小时。--博才网
下页更精彩：
点击排行榜
微信查看最新信息微信扫一扫或用微信搜索微信号：hbrc-com
安卓手机客户端更省流量手机扫描下载或者直接
猜你还喜欢的文章
热点文章排行榜
• 版权所有 Copyright 2011 All rights reserved.荧光定量PCR
巨细胞病毒（HCMV-DNA)
单位 拷贝/毫升
参考值&1000
怎么看啊 ？
你做的是什么检查啊，我之前也有检查巨细胞，有个英文名字叫igm，我检查的时候结果有三种，一种是阳性，一种是阴性，另外一种是弱阳性，我就是弱阳性，后来又查就是阴性正常了。宝妈是什么情况啊，可以说的详细一点吗？
宝妈这个时定量，结果是没有病毒复制的意思。不知道你的IGM和IGG水平是阴性，阳性还是弱阳性？
你做的是什么检查啊，我之前也有检查巨细胞，有个英文名字叫igm，我检查的时候结果有三种，一种是阳性，一种是阴性，另外一种是弱阳性，我就是弱阳性，后来又查就是阴性正常了。宝妈是什么情况啊，可以说的详细一点吗？
我的是阳性（+） 复查也是
#2 名字好难想
宝妈这个时定量，结果是没有病毒复制的意思。不知道你的IGM和IGG水平是阴性，阳性还是弱阳性？
我的LGM是阳性一个+
#3 凌静妈妈
我的是阳性（+） 复查也是
你把它看的重要了，它就很重要，心态要好，我觉得没事的，也许之前就有过感染，目前有抗体了呢，实在不放心就在找专家看看。我觉得没什么，之前在网上查了，人家国外都不看这东西，再说了，过去父母怀我们的时候那条件多差啊，咱也挺健康的。
你把它看的重要了，它就很重要，心态要好，我觉得没事的，也许之前就有过感染，目前有抗体了呢，实在不放心就在找专家看看。我觉得没什么，之前在网上查了，人家国外都不看这东西，再说了，过去父母怀我们的时候那条件多差啊，咱也挺健康的。
也许是我太看重勒吧，还是医生说的太夸张了吧，那你去做羊刺了吗？？
#6 凌静妈妈
也许是我太看重勒吧，还是医生说的太夸张了吧，那你去做羊刺了吗？？
我两个多月的时候也是IGM阳性，后来复查，igM阴性，igG阴性，（HCMV-DNA) 结果&1000 单位。于是我就放心了。干医疗相关行业的，咨询了很多人，好多人告诉我这个东西国内很多专家都不建议做了，没有可参考性，只有5%的几率，还是放松心情吧。而且是怀孕头三个月第一次感染才有可能。你只做了IgM没做IGG？我觉得IGM和igg一起才有可比性。你的结果&1000，应该是表示近期不活跃，病毒没有复制，应该不用担心。前段时间也饱受困扰，做了一些功课，个人观点。
#6 凌静妈妈
也许是我太看重勒吧，还是医生说的太夸张了吧，那你去做羊刺了吗？？
狗屁我都没做，我妈妈那时候生我什么都不查，我照样健康的不得了，而且我舅家妹妹现在怀孕5个月了你问她孕酮检查了吗她都不知道是什么，她家老大还是很健康的，能怎么样啊，真是的。
我也不打算做羊水穿刺了，后期检查好好做，好好做做排畸，这页到我那就掀过去了
#2 名字好难想
宝妈这个时定量，结果是没有病毒复制的意思。不知道你的IGM和IGG水平是阴性，阳性还是弱阳性？
医生没让我检查LGG这东西，只是复查勒LMG
还有之前发的就没有了 只后医生便叫18周后羊刺
狗屁我都没做，我妈妈那时候生我什么都不查，我照样健康的不得了，而且我舅家妹妹现在怀孕5个月了你问她孕酮检查了吗她都不知道是什么，她家老大还是很健康的，能怎么样啊，真是的。
也许是我看重了，
不过真的没问题么？医生也给不做？
看不懂。。。
只有注册用户才能发表回复。请
成员:348041 ,
话题:226841
免费领取礼包
“扫一扫”
免费领取妈妈礼包
&&手机客户端&&备孕&&相同预产期&&同龄宝宝2016年2015年2014年2013年2012年2011年&&同城(21个)(11个)(13个)&&妈妈兴趣&&宝宝兴趣&&特别关注&&非常有用
上海丫丫信息科技有限公司版权所有
沪B2- 沪ICP备号人巨细胞病毒HCMV　　当HIV、AIDS、H7N9等英文缩写单词越来越被人们熟知的时候，又有多少人了解或熟知CMV这个单词呢？　　中国科学院武汉病毒所 “百人计划”研究员罗敏华此时正努力呼唤国人对潜伏的CMV的重视。CMV是巨细胞病毒（Cytomegalovirus）的英文缩写。能感染人并致病的巨细胞病毒称为人巨细胞病毒HCMV（Human Cytomegalovirus）。它是一种在人群中广泛存在的病毒，任何年龄段的人都不可避免被HCMV侵袭。狡猾的HCMV潜伏在人体，人体的免疫系统有时也不能将之杀灭或清除。于是，HCMV病毒悄无声息地潜伏在人体内，一旦机体免疫系统下降，它们便开始激活，大肆复制并侵略我们的身体。　　“由于社会重视程度不够，宣传力度不强，大多数人群对HCMV感染认知不深，认为这种病不是重大传染病，关注程度明显不足。”罗敏华告诉《中国科学报》记者。　　缺失的常识　　罗敏华自1998年便开始和HCMV打交道，一直致力于HCMV感染致胎儿神经发育畸形的研究。她带领课题组首次建立了HCMV容许性感染的神经干细胞模型，发现HCMV感染直接导致神经细胞损伤，并诱导神经干细胞异常分化，部分解析了HCMV感染致脑损伤机制。　　“先天性HCMV感染是导致出生缺陷的最常见病因，主要引起大脑等发育紊乱。先天性HCMV发生在早孕期，其后果常常比感染发生于孕晚期更严重，表现为严重脑损伤，包括小脑畸形等。”严重的临床后果及其给家庭和社会带来的深远影响震撼着罗敏华的心。　　罗敏华说，鲜少有人知道HCMV是宫内感染最常见的病毒之一。孕妇感染HCMV后，可造成流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓、新生儿肝炎、肺炎、婴儿先天畸形等。发达国家新生儿HCMV感染的发生率约为1.2%，发展中国家约为2%。被感染的新生儿中，约10%在出生时表现出明显的出生缺陷、听力损伤症状。另外，大部分新生儿无明显症状，但有10%随后逐渐出现听力损伤、智力低下等病症。　　最新研究数据表明，美国HCMV先天性感染率为1%，每年先天性HCMV感染的新生儿有40000名，其中8000名终生残疾及400人死于先天性HCMV感染。中国新生儿感染率约2%，每年有40万新生儿感染（新生儿总数为2000万），其中约4万感染者有不同程度的残障。　　“甚至有些临床医生也不了解，对这种病毒的认识不够，检测结果往往和临床判读不能很好地结合。”罗敏华透露说，“实际上现在大多数关于HCMV的感染率是根据部分省市结果推算出来的。至今还没有人知道全国的数据，没有全面的流行病学调查，我们难以掌握全局。”　　目前，国际上尚无针对该病毒的疫苗，最基本的宣传教育也处于缺失状态。　　“现在临床上出现两类分化，一类是未筛查出造成全家的悲剧；另一类是检查到阳性，未进行进一步监测和确诊，便终止妊娠的过度诊断与治疗。”罗敏华说。　　避免更多悲剧　　罗敏华给记者展示了一幅幅被新生儿先天感染患者的图片，这些骇人的场景背后是全家人的痛苦和悲剧。　　“他们巨大的经济负担和精神上的折磨让我心痛。”作为从事最前沿科学研究的科学家，使命感让罗敏华走出实验室。她和她的团队在自己并不擅长的领域建了HCMV网络宣传教育平台。　　“电视节目、科普宣传画、板报墙报、预防手册等也能有效增强广大群众的预防意识和能力。”罗敏华呼吁媒体对此进行关注。　　结合自己的研究成果，罗敏华还创作了通俗易懂的儿歌：“HCMV，是病毒，易感大脑和神经。智障儿，患脑瘫，婴儿疾病最常见。易感染，常潜伏，育龄妇女需注意。莫惊慌，不惧怕，做好预防是关键。准妈妈，做产检，确定是否被感染。好习惯，要养成，减少病毒的感染。换尿布，勤洗手，千万不要嫌麻烦。若爱他（她），抱抱他（她），尽量不要亲脸颊。餐饮具，分开用，不要共享食和物。全社会，共关注，构建幸福美满家。”　　目前，罗敏华和同事们已经能够利用自己的科研基础为HCMV检测提供技术、试剂条件，并且提供筛选高水平抗HCMV中和抗体血清的技术和平台，对特殊人群（感染的新生儿和器官/细胞移植受者）进行治疗。目前也有公司介入与课题组洽谈技术转移。　　与此同时，她正在和美国国立卫生研究院合作推动该公益项目，但她希望我们国家的相关部门能够加大关注力度，避免更多潜在的家庭悲剧发生。　　“光靠市场行为来推动这项公益性的事情实在太慢了。”罗敏华说。　　“希望能有更多的专项研究基金持续加大对新生儿先天性HCMV感染的投入，重点推进疫苗研发。”罗敏华正在鼓励更多科研、医疗人员从事新生儿先天性HCMV感染研究、筛查、护理和宣传工作，建立知识结构合理、专业素质较高的科普宣传队伍。您现在的位置：&&>&&>&&>&&>&正文
作者：Beyond
来源：生物谷
关键词：Science,人巨细胞病,核糖体
日 讯 /BIOON/ --人巨细胞病毒是一种很常见的疱疹病毒，感染约50-100％的成人，但通常没有不良影响，并且它可以保持潜伏多年。人巨细胞病毒感染是比较常见的，发展中国家感染人数比发达国家人数多。
该病毒可导致出新生儿生缺陷和免疫系统受损，可能会导致致命疾病。该病毒也与癌症发展有关联。这项新的研究分析了病毒的蛋白质组，并描述了所有表达的蛋白质。
研究人员认为，以往研究潜在编码蛋白质的基因组很大程度上是计算机模型上的，这是不完整的。二十多年来，16个病毒株人巨细胞病毒基因组已被测序。
这是一个特别大的病毒基因组中，约240,000个碱基对。该小组开始研究感染HCMV的人成纤维细胞的核糖体。核糖体是细胞内制造蛋白质的细胞器。他们用​​分析以确定是否存在预测的蛋白质。
研究发现了数以百计的蛋白质编码基因，这些基因此前未被确定在基因组中。编码蛋白质的DNA片段被称为开放阅读框架，在基因组序列的分析基础上，以前的研究预测有200帧。
了解病毒基因组表达的蛋白质可能有助于确定该病毒是如何影响宿主细胞的。相关研究论文发表在Science上，研究小组说核糖体分析技术和相结合方法可用于研究其他复杂病毒的蛋白质组。（生物谷：）
Decoding Human Cytomegalovirus
Noam Stern-Ginossar, Ben Weisburd, Annette Michalski, et al.
The human cytomegalovirus (HCMV) genome was sequenced 20 years ago. However, like those of other complex viruses, our understanding of its protein coding potential is far from complete. We used ribosome profiling and transcript analysis to experimentally define the HCMV translation products and follow their temporal expression. We identified hundreds of previously unidentified open reading frames and confirmed a fraction by means of mass spectrometry. We found that regulated use of alternative transcript start sites plays a broad role in enabling tight temporal control of HCMV protein expression and allowing multiple distinct polypeptides to be generated from a single genomic locus. Our results reveal an unanticipated complexity to the HCMV coding capacity and illustrate the role of regulated changes in transcript start sites in generating this complexity.
(责任编辑：yan.mao)
小编提示：87%用户都在上阅读，扫描立刻下载!
欢迎行业评论、发现、小道消息、官方爆料、采访约稿
订阅我们的资讯
关注我们新浪微博
中国的市场的确存在很大的隐患，干细胞行业是个专业性要求较高的行业
个体化医疗是未来医学研究与应用的趋势，而个体化治疗的关键在基于生物分子标志物的诊疗策略
中国疫苗市场的巨大潜力，吸引了世界排名最领先的跨国疫苗制造巨头前来淘金。}