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【求助】RT-PCR中cDNA的量多了会不会导致没有条带？
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这个帖子发布于10年零109天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位前辈，作为新手有许多很奇特的问题，请谅解。
作RT-PCR两个月了，结果出来过一次，但是因为实验室分光光度计坏了，昨日提出RNA后，目测了一下，:P，就做了，因为我唯恐模板不够，逆转录的时候，加的RNA只多不少:P，结果还可以，但是今天换了个模板，却什么结果也没有，只有引物二聚体，内参也没跑出来。我又作了cDNA的电泳,挺好的，没降解。除了模板其余都一样，会不会是模板加多了也会导致没有条带呢？
最近一直不太顺利，心情比较郁闷，今天看到结果，心都凉了，差点就要哭出来了，老板催着要文章，不发文章不能毕业，时间来不及了。:(:(:(
麻烦各位前辈不吝赐教！！
不知道邀请谁？试试他们
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一般不至于的,你还是耐心再做2两次,PCR有时就是不稳定,这是PCR的缺陷之一
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设几个梯度好了，只要药品没问题，肯定能出来的
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丁香园中级站友
1。做PCR要有耐心，条带的丢失很有可能是摸班的问题或是这个PCR体系本来就不稳定，建议你将条件贴出来供大家讨论。2。摸班的过多的确会影响它和引物的结合，我的建议是先做浓度剃度然后在做温度剃度，而且增加电泳的上样量就会看到条带的
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各位DXYer:我用的是TOYOBO的RT试剂,按照说明书,在RT时加进了所有的组分后,就直接在42度保温1小时,跑cDNA时带很漂亮,再用产物做PCR,结果全是弥散,不管是管家基因,还是我的目的基因。这是什么原因呢，请各位帮忙分析一下，PT-PCR结果附图
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像问一以下你说的cdna得质量还可以来跑 ，是琼脂糖胶，何以看出你的cdna质量好
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感谢各位的安慰，我已竭尽耐心，也会继续努力！！我的条件RT
dNTP (10mmol/L)
AMV 逆转录酶
1ul(1ug左右)
加DEPC水补至
20ul 42度 1小时，99度 5 分钟PCR
dNTP (10mmol/L)
引物上游（10pmol/ul） 1ul
Taq 酶 5U/ul
灭菌蒸馏水
95度 5分钟，94度30秒，59度30秒，72度45秒，循环34次，末次延伸72度7分钟 ，退火温度是用温度梯度摸出来的，Mgcl2的量也是用梯度摸出来的，曾经做的结果很好，可是现在突然就什么都没有了，只有引物二聚体。
借得别人的内参b-actin能做出来，没有问题，但是自己的内参GADPH 却做不出来，是不是引物稀释的过程出的问题？
谢谢各位！！
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摘要 : 逆转录PCR (RT-PCR)具有较高的灵敏性、操作简单等优点，常用于基因定量分析、生物学检测等，此外常用逆转录PCR克隆目的基因。 本文主要讲述了逆转录PCR的原理、重要参数以及操作注意事项。
逆转录（）的原理
逆转录PCR (RT-PCR)具有较高的灵敏性、操作简单等优点，常用于基因、生物学检测等，此外常用逆转录PCR克隆目的基因。 本文主要讲述了逆转录PCR的原理、重要参数以及操作注意事项。
cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。
逆转录PCR重要参数
不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同;因此，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件是导致的终产量达到最大，下述参数十分重要。
1.逆转录酶 有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板，oligo(dT)作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂，可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。
2.单价阳离子 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于c长度的最适钾离子浓度为140-150mM。
3.二价阳离子 对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2 未能观察到活性;产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。
4.脱氧核苷三磷酸 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。
材料与方法
2 仪器、用具
PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR管(1个)、移液器、碎冰
RNase Free dH2O;5&RT Buffer (含25mM Mg2 );dNTP (10mM each);RNase Inhibitor(10U/&l );Oligo (dT)20 (10&mol/L);ReverTra Ace
(1) 以总RNA为模板，合成cDNA第一链，体系如下：
(2) 反转录反应条件为：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。反应结束后冰
注意事项：
① cDNA第一链合成的反应液冰上配制。
使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor 等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡;由于酶保存液
中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
逆转录PCR时，提取RNA是关键，收集RNA沉淀时，离心速度不要低于13000rpm，在离心前的沉淀也尽可能在低温下条件下操作，此外逆转录酶可以选择MMLV逆转录酶，主要是因为这个条件比较容易掌握。
作者：青岚 点击：次
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