测定ros空白对照值超高(对照值,药物,空白对照,试剂盒) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 测定ros空白对照值超高(对照值,药物,空白对照,试剂盒)
摘要: [测定ros空白对照值超高(对照值,药物,空白对照,试剂盒)] 我用碧云天的活性氧试剂盒检测药物作用悬浮的HL-60细胞后ros水平，具体操作为：1、取2*107细胞，离心后重悬与DCFH-DA 500ul中，作用20分钟，期间每隔2-3分钟颠倒混匀；2、用无血清培养基洗细胞3次；3、加入1 5ml无血清培养基，分为3份4、第1份为空白对照，即不再加入任何药物； 第2份加入碧云天试剂盒中自带的阳性对照rosup 第3份加入实验药物5、在孵箱内作用30分钟，重悬 关键词:[药物 对照值 空白对照 试剂盒 染色细胞 阳性对照 阳性]……
我用碧云天的活性氧盒检测药物作用悬浮的HL-60细胞后ros水平，具体操作为：1、取2*107细胞，离心后重悬与DCFH-DA 500ul中，作用20分钟，期间每隔2-3分钟颠倒混匀；2、用无血清培养基洗细胞3次；3、加入1.5ml无血清培养基，分为3份4、第1份为空白对照，即不再加入任何药物； 第2份加入碧云天盒中自带的阳性对照rosup 第3份加入实验药物5、在孵箱内作用30分钟，重悬于PBS 500ul当中检测结果显示： 1、空白对照可以检测到阳性染色细胞91.3% 2、阳性对照阳性染色细胞93.1% 3、药物刺激反而降低到89.3%预期的实验结果是空白对照阳性率极低，药物刺激后阳性细胞明显增多，请做过的朋友指导一下，万分感谢，十分紧急！
回复请知道的朋友指导一下，先谢谢了回复我不明白的是你为什么是先标记荧光染料，再加刺激？你是在什么地方看到是这种做法的，有相关文献支持吗？一般情况下，都是先培养刺激，刺激完成后各组再加入荧光染料上机检测的。回复谢谢你的回答，我用的是碧云天的ros试剂盒，说明书上写的对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或药物进行刺激细胞。我在文献上确实没看到过这种做法，一些国外的文章都是先培养刺激的。您觉得背景高与这个操作的过程有关吗，我可以试试先刺激细胞吗回复我觉得有这个可能性，试试先刺激细胞，再标记荧光染料吧！回复谢谢，我明天就试试，您觉得我加DCFH-DA作用的时间和加入的量用不用在缩短一些呢回复我今天又按照先加药物刺激后进行染色处理了，这回出现了奇怪的现象，首先背景还是很高，90%多，并且各个实验组都出现了2团细胞，原来都是1团，这是怎么回事呢，请帮帮我，急呀回复请上传流式图。回复我明天拷回来，立即上传，谢谢你，kern6549回复这是空白对照的结果回复这是阳性对照的结果回复不加药组荧光强度都这么高，有可能是你的细胞HL-60本身ROS水平就高。不知道你手上还有没有其他的细胞，试试检测一下其他细胞看看，看看其他ROS水平低的细胞标记该抗体后荧光强度能够达到多少？回复请帮忙看看我上传的流式的图像，我不明白这种结果说明了什么，感激！！回复我查文献看到别人做的HL-60水平是低的呀，我重复了3次都是这样的结果，谢谢你呀，请问2团细胞说明什么呢回复2团细胞说明HL60细胞产生ROS的能力不一样，有高低之分。你的荧光水平这么高也有可能是加的荧光染料浓度太高引起的，所以，建议你测一下其他的细胞看看。回复好的，我想办法测测其他细胞，谢谢你呀回复很简单，这样的情况是流式检测老师的错误：1.他按照常规操作将没染色的细胞信号作为空白对照调阴性置信区，然后与你的染色空白管比对的结果，但在DCFH检测方法中，仅需将你染色的空白管（没处理，染色）作为阴性对照调节荧光信号，并将该管的荧光信号主峰置于直方图中间位置，这样不管你的实验时抑制还是促进均能反应出来。注：不染色的空白细胞可不用，即使要用也仅作为FSC和SSC电压调节用，不作为荧光信号调节。2.DCFH 是ROS 的俘获剂，空白对照细胞内正常成在ROS,一经染色同样具有较高的荧光细胞，故不能用不染色的空白细胞作为阴性对照，否则将出现你这样的结果，荧光主峰右偏，不便你实验结果分析，特别是促进实验。祝实验顺利！梁智辉回复楼上的同志说的很有道理。我仔细的看了一下你的对照组和实验组的主峰的位置，发现位置虽然相差不多，但是还是有差别的，实验组的主峰位置更靠右。像这种情况，首先根据楼上所建议，调低FL1的电压将主峰的位置置于数轴的中间，便于观察是必要的。第二，此时你的流式结果用阳性细胞比例就完全不合适了，应该用“平均荧光强度”来表示。但是，请注意，这个平均荧光强度是一个相对的值，一定要在相同条件下，尤其是相同电压设置的条件下检测得到的数据才有比较性，所以，首先用对照组（标好染料的空白组）调节FL1电压，将主峰位置移到中间，记录平均荧光强度值做为基准，然后上样实验组，记录平均荧光强度值就可以看出实验组的ROS水平是否上升。另外，流式图最好采用直方图表示，不要用散点图。回复太感谢你们了！真是太高兴了，没有你们的帮助我真是很难走出这个困扰，我还想请问一下平均荧光强度是我图中那个xmean值吗，我在文献中看到是以均数加减标准差的形式表现的，请问是怎么得到的呢？感激，感激！！回复没错，平均荧光强度就是你图中的那个X mean的值。均数加减和标准差等当然是你多次实验的结果统计计算了。回复谢谢你呀，那多次试验的电压等等需要测流式的老师调整的参数都必须是一样的吗，还是每次都用加了荧光染料的细胞重新调节就可以呢？回复需要每次调节。只有同一批次在相同电压条件下检测到的平均荧光强度才有可比性。不同批次之间即使电压值调节相同也没有可比性。回复请问激发波长和发射波长在流式细胞仪上怎么调压，这个和电压是相同的吗，说明书上说是用488nm激发波长，525nm发射波长，老师也不知道该调什么地方，请指教，谢谢呀！回复调电压确切的说是调节光电倍增管的电压，它与激发波长和发射波长无关。每一个通道都有一个光电倍增管，光电倍增管就是每一个通道接收荧光信号并且将荧光信号转化为电信号的一个装置，在转化过程中还会根据一定的倍数扩大这个信号，而扩大的倍数是可以人为控制的，俗称“调电压”。可能说法不一样，你和操作者直接说调电压他可能听不懂，你直接和他说，FITC信号太强了，将其调低点，将主峰位置从右侧移到中间，他应该就知道如何操作了。回复谢谢呀，周末不能做检测，我周一进行试验，谢谢你们！回复现在结果 怎么样了 我的也是阴性对照 平均荧光强度 过高，用的也是 碧云天的试剂盒 ，有什么进展 交流下 ，偶也在困扰中。。。回复后来药物作用组的作用时间延长了，就出现结果了。我觉得是之前药物作用时间不足，也就是说当初作用时间不足导致ROS水平没有变化。回复学习了回复请问楼主，你后面增加了药物处理时间，是先刺激细胞再加的探针吗？那在时间点上你是不是做了几个时间点的摸索？阳性对照也出来了吗？我做的是贴壁细胞，结果也是空白对照和阳性对照的荧光强度差不多（检测的），实验组间与空白对照和溶剂对照比也差不多，没啥变化。谢谢！
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工 作 研 究 农业开发与装备
2014年第12期 环境空气中二氧化氮的测定如何避免空白值偏高 刘小丽 （鹤壁市农产品质量安全监测检验中心，河南鹤壁
458030） 环境空气中的二氧化氮是法规控制空气污染物，是形成光化学 瓶内（瓶内有玻璃球）加 匙高锰酸钾和 匙氢氧化钡，加纯水开
烟雾的主要因素之一，对人体健康危害很大，即使暴露于二氧化氮 电炉进行蒸馏，取蒸馏过的水10ml，于暗处放置20min，吸光度
的时间很短，肺功能也会受到损害；如果长时间暴露于二氧化氮， 值为0.001。这证明纯水与蒸馏过的纯水无明显差异，纯水可用来
可能导致肺部永久性器质性病变。在进行环境中二氧化氮的测定 试验。
时，往往会出现空白值偏高的情况，本文对如何快速查找空白值偏 2.1.2　显色液对空白值的影响。显色液：称取5.0g对氨基苯磺酸
高，进行了系统分析研究。 溶于约200ml热水中，将溶液冷却至室温，全部移入1000ml容量瓶
材料与方法 中，加入50ml冰乙酸和50.0mlN－（1-萘基）乙二胺盐酸盐储备
实验原理 液，用水稀释至刻度。 空气中二氧化氮与吸收液中的对氨基苯磺酸进行重氮化反应， N－（1-萘基）乙二胺盐酸盐储备液：称取0.50gN－（1-萘
再与N－（1-萘基）乙二胺盐酸盐作用，生成粉红色的偶氮染料， 基）乙二胺盐酸盐于500mL容量瓶中，用水溶解稀释至刻度。
于波长540～545nm之间处，测定吸光度。 空白值是2mL纯水+8mL显色液获得的，纯水经试验合格，那
仪器 么一定是显色液的问题，显色液中有三种试剂构成，对氨基苯磺 紫外分光光计（日本岛津UV-1700）、空气采样器、50ml多孔 酸、冰乙酸、N－（1-萘基）乙二胺盐酸盐储备液，这三种分别进
玻板吸收瓶、10mL具塞比
正在加载中，请稍后...环境空气中二氧化氮的测定如何避免空白值偏高--《农业开发与装备》2014年12期
环境空气中二氧化氮的测定如何避免空白值偏高
【摘要】：正环境空气中的二氧化氮是法规控制空气污染物,是形成光化学烟雾的主要因素之一,对人体健康危害很大,即使暴露于二氧化氮的时间很短,肺功能也会受到损害;如果长时间暴露于二氧化氮,可能导致肺部永久性器质性病变。在进行环境中二氧化氮的测定时,往往会出现空白值偏高的情况,本文对如何快速查找空白值偏高,进行了系统分析研究。1材料与方法1.1实验原理空气中二氧化氮与吸收液中的对氨基苯磺酸进行重氮化反应,
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：X831【正文快照】：
环境空气中的二氧化氮是法规控制空气污染物,是形成光化学烟雾的主要因素之一,对人体健康危害很大,即使暴露于二氧化氮的时间很短,肺功能也会受到损害;如果长时间暴露于二氧化氮,可能导致肺部永久性器质性病变。在进行环境中二氧化氮的测定时,往往会出现空白值偏高的情况,本文
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在不加试样的情况下，按照与试样分析同样的步骤和条件进行的测定，试验得到的结果称为空白值
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碱吸收法测定土壤呼吸中，空白值比样品处理大会是什么原因？怎么解决 ？
称取50g鲜土平铺于500ml 广口瓶底部，将盛有5ml 1mol/L氢氧化钠的塑料瓶悬挂于土壤上方，尽量接近土壤，用保鲜膜和橡皮筋密封广口瓶。将广口瓶放于25度下培养。并作空白对照（不加土壤）。到达培养时间取出用HCl滴定。
现在的问题是我的某些样品处理（有好多个都是）消耗的HCl 比空白还大！而有的又比较正常。不知道是什么原因！求帮忙啊！谢谢了！
我自己觉得我的密封不是特别好，但是也不至于样品比空白高啊。（1）是不是由于二氧化碳的水溶性哦？我发现样品处理的广口瓶壁上有水珠。（2）是不是二氧化碳根本进入不了塑料吸收瓶？但是别人也是这么做的啊，我也是参考的别人的做法。
恩，你加油吧。我当时也是刚开始做实验，很多漏洞，这部分数据最后我没有要。
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