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DNA提出来了
但是PCR就是跑不出条带
是什么原因
大神求救啊
最近几天&&一直在弄这个&&之前跑不出来&&以为是DNA没提出了& &后面dna跑了一次&&条带很明显& &但是用来做PCR就是不出条带&&求大神指导&&拜谢啊
pcr体系、退火温度以及模板用量都正确& &之前老师有跑出来过&&都是用的和他一样的程序和方法& &&&会不会和DNA浓度太大有关& &我是直接提出来后就混样跑pcr了
提完模板要大致定量，PCR体系里的模板量太大或者太小都可能P不出来的。
测过DNA的量了& &今天稀释了一些&&跑跑看&&谢谢
嗯&&今天进行稀释了几个梯度&&看看能不能跑出来&&谢谢
要是今天稀释了还跑不出来& &明天换试剂试试
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随时随地聊科研植物乳杆菌DMDL9010中亚硝酸盐还原酶的克隆表达、纯化及酶学性质--《华南理工大学》2015年硕士论文
植物乳杆菌DMDL9010中亚硝酸盐还原酶的克隆表达、纯化及酶学性质
【摘要】：亚硝酸盐常作为食品添加剂、发色剂添加至腌制、发酵食品中,摄入过量亚硝酸盐会诱发高铁血红蛋白症,同时亚硝酸盐也是亚硝胺的前体物质,亚硝胺是一种强致癌物,可以诱发消化系统中的多种癌变,因此亚硝酸盐是一种潜在的致癌物,控制其在食品中的含量非常必要。而亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,简称NIR)能降解亚硝酸盐。在前期研究中,从中国泡菜中分离一株具有降解亚硝酸盐的乳酸菌,后鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL9010。利用菌株DMDL 9010为基础,克隆其Ni R基因,并构建含有nir基因序列的原核重组表达菌株,利用IPTG诱导表达重组蛋白NIR(recombinant protein NIR,简称r NIR),再利用亲和层析分离纯化得到r NIR,并研究rNIR的部分酶学性质,主要结果为:首先查找植物乳杆菌的NIR蛋白序列,找到nir编码基因序列,大小为1638bp,根据该序列设计引物,以植物乳杆菌DMDL9010的全基因DNA作为模板,PCR扩增得到目的片段约1700 bp大小。将nir目的片段双酶切后定向的连接到p ET-32a(+)上,然后转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和双酶切验证重组质粒连接结果,从而获得成功构建重组质粒pET-32a(+)-nir。重组质粒pET-32a(+)-nir构建成功后,将其转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中,在含Na NO2为50μg/m L的体系中工程菌p ET-32a(+)-nir-BL21能降解亚硝酸盐约45μg/m L。工程菌p ET-32a(+)-nir-BL21以接种量2%接种于液体LB培养基(含50μg/m L氨苄青霉素)中在37°C、180 rpm震荡发酵培养,当OD600≈0.5时,用终浓度为1 m M的IPTG在30°C下诱导培养4 h,利用超声破碎法离心收集得到工程菌的粗蛋白液,粗蛋白液经镍亲和层析法纯化后得到了纯度较高的rNIR,SDS-PAGE电泳检测得到大小约60 k D。纯化浓缩得到的rNIR自身无法降解Na NO2,仅在添加电子供体(细胞色素C或从蜡样芽孢杆菌或干酪乳杆菌鼠李糖亚种中分离纯化得到供体蛋白)后才有酶活,表明该酶要在电子供体存在的情况下才能有反应活性。rNIR酶促反应的最适电子供体是细胞色素C,在反应体系中的最适浓度为0.05 mg/m L,最适反应时间为24 h,其最佳反应温度为37°C,最适反应底物浓度为50 mg/L,最适缓冲液是HEPES缓冲液。
【关键词】：
【学位授予单位】：华南理工大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：TS201.25【目录】：
摘要5-7Abstract7-13第一章 绪论13-28 1.1 亚硝酸盐13-15
1.1.1 概述13
1.1.2 NIT对人体的危害13-14
1.1.3 NIT的药用价值14-15
1.1.4 食品中亚硝酸盐的限量标准及检测方法15 1.2 食品中NIT的控制方法15-18
1.2.1 减少食品中NIT的危害物理方法16
1.2.2 减少食品中NIT的危害化学方法16-17
1.2.3 减少食品中NIT的危害生物方法17
1.2.4 开发食品中NIT的替代物17-18 1.3 反硝化作用与NIR18-23
1.3.1 NIR的分类与结构19-20
1.3.2 CuNIR的概述20-22
1.3.3 cd1NIR的概述22-23 1.4 关于NIR的研究现状23-25
1.4.1 乳酸菌降解NIT的研究23
1.4.2 乳酸菌中NIR的分离纯化研究23-24
1.4.3 关于NIR电子供体的研究现状24-25
1.4.4 关于NIR的酶学性质的研究25 1.5 本论文的研究内容和意义25-28
1.5.1 研究意义25-26
1.5.2 研究内容26-28第二章 重组蛋白NIR大肠杆菌表达载体的构建28-41 2.1 实验材料与仪器28-30
2.1.1 菌株与载体28
2.1.2 主要仪器28-29
2.1.3 主要试剂29
2.1.4 培养基和常用溶液29-30 2.2 实验方法30-35
2.2.1 植物乳杆菌DMDL9010 中nir的编码基因序列的查找及引物设计30
2.2.2 植物乳杆菌DMDL9010 的培养以及DNA的提取30-31
2.2.3 植物乳杆菌DMDL9010 中nir编码基因的扩增31-32
2.2.4 目的基因PCR产物的回收及测序32
2.2.5 目的基因PCR产物及质粒的双酶切与回收32-33
2.2.6 目的基因与载体的连接33
2.2.7 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备与转化33-35
2.2.8 重组子的筛选与鉴定35 2.3 实验结果与分析35-40
2.3.1 植物乳杆菌DMDL9010 中NIR的蛋白序列及nir的编码基因序列35-36
2.3.2 目的基因的扩增36
2.3.3 目的基因PCR产物的测序36-38
2.3.4 重组表达载体的构建38-40 2.4 本章小结40-41第三章 rNIR在大肠杆菌中的表达与纯化41-53 3.1 实验材料与仪器41-45
3.1.1 菌株和质粒41
3.1.2 主要仪器41
3.1.3 主要试剂41-42
3.1.4 培养基和常用溶液42-44
3.1.5 预备实验44-45 3.2 实验方法45-48
3.2.1 大肠杆菌BL21（DE3)感受态的制备及转化45
3.2.2 rNIR降解NaNO_2活性检测45-46
3.2.3 rNIR在大肠杆菌的表达46
3.2.4 重组菌株的粗蛋白的提取46-47
3.2.5 rNIR的分离纯化47-48
3.2.6 rNIR的透析和浓缩48
3.2.7 rNIR的SDS-PAGE蛋白电泳48 3.3 实验结果48-52
3.3.1 NIR降解NaNO_2活性检测48-49
3.3.2 rNIR的分离纯化49-51
3.3.3 rNIR的SDS-PAGE电泳分析51-52 3.4 本章小结52-53第四章 rNIR的酶学性质研究53-67 4.1 实验材料与仪器53-55
4.1.1 菌株53
4.1.2 主要仪器53
4.1.3 主要试剂53
4.1.4 常用溶液53-55 4.2 实验方法55-58
4.2.1 NIT标准曲线的制作及酶活定义55
4.2.2 rNIR降解NIT的酶活检测55
4.2.3 rNIR降解NIT的最适电子供体55-56
4.2.4 rNIR降解NIT的最适电子供体浓度56
4.2.5 rNIR降解NIT的最适反应时间56-57
4.2.6 rNIR降解NIT的最适底物浓度57
4.2.7 rNIR降解NIT的最适温度57
4.2.8 rNIR降解NIT的最适缓冲液57-58 4.3 实验结果58-66
4.3.1 NIT标准曲线58
4.3.2 rNIR降解NIT的酶活检测58-59
4.3.3 rNIR降解NIT的最适电子供体59-60
4.3.4 NIR降解NIT的最适电子供体浓度60-61
4.3.5 NIR降解NIT的最适反应时间61-62
4.3.6 NIR降解NIT的最适底物浓度62-63
4.3.7 rNIR降解NIT的最适反应温度63-64
4.3.8 rNIR降解NIT的最适缓冲液64-66 4.4 本章小结66-67结论与展望67-70参考文献70-81附录1 中英文对照表81-82攻读硕士期间取得的研究成果82-84致谢84-85附件85
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【心得】基因定点突变step by step&[精华]
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这个帖子发布于9年零288天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人不久前在生物通上看见一个贴子：随心所欲,玩转你的基因---基因置换、删除、插入、突变,一天完成说基因置换，删除，插入，突变可以一天完成。只不过价钱贵得很，本人一直从事这方面的工作，我们完成可以DIY嘛，大家干嘛再花这些冤枉钱呢？下面将详细列出实验的进程，对于很多老手来说可能这根本不算什么，不过感觉可能会对一些人会有一定的帮助，也想自己加加分，就写了。^_^网上也有其说明书，不过我看了之后，确实感觉它省略了很多实验细节，只说了个大概，对于很多新手来说，也说会是一头雾水，所以我就把我的心得写出来吧。大家有什么疑问我们可以一起讨论讨论一下：, QQ 斑竹多给我加分啊，呵呵。本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？对于第一个问题：怎么设计引物？我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：不过这种突变引物要加上一个原则：一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：X71661.1
TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960现有序列
TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
*********************************************** ************
|------&deletion
AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列
AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
************************************************************（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配） 我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物对于第二个问题：怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。关于第三个问题：直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：1、
根据现有基因设计引物；2、
合成引物并准备好模板；3、
DpnI处理酶切产物；5、
转化酶切产物；6、
筛选 阳性克隆；7、
送测序并测全长。最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型什么QuikChange& Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange& XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（&8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。另外，DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。实验板长出来的菌有两种可能 一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的 （突变体）不过这两种菌长得一模一样^_^，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的， 做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。 如果两者都拿去DNPI处理 就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候就得靠运气了^_^大家有什么问题我们可以继续讨论。, QQ 另外，如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其它办法进行定点突变，只是麻烦一点，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。不过，如果你有钱的话，那就去买那个试剂盒吧，其中QuikChange& Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange& XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（&8kb）的原理我上面已经说了，只是补充了一些我认为的注意事项。如果你更有钱的话，那么你可以叫其它公司帮你做定点突变服务，大约是改一个点1000元左右。如果有需要我可以提供公司的联系方式。
不知道邀请谁？试试他们
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我现在遇到的问题是：我最开始是用QuikChange(R)II Site-Directed Mutagenesis Kit做的。送去了一个结果没有突变！dingo8369您好：做点突变有三步最重要，其它的并不是很关键第一点就是引物要设计好，也就是说要确保要突变的那个点在引物的中间，如果只是突变一个碱基，那么两边各15个BP那肯定没问题，如果是突变三四个碱基，那么两边 就要适当地加长，如加长到18个BP甚至更长。第二点就是要PCR，如果PCR做不出来，那实验肯定失败，虽然PCR阳性的话跑胶并不一定能够跑出来，但是如果跑胶能跑出来的话那么肯定就是PCR阳性。一般情况下跑胶跑不出来也可能是因为循环数做得太少。一般情况下(R)II Site-Directed Mutagenesis Kit配的Turbo那个扩增酶保真性能挺好的，也是PFU酶嘛，所以循环数可以多一点没关系，二十五个应该没问题的，不会有新的点突变的。这样跑胶就能看出来阳性阴性。同时做PCR时要做负对照。第三点就是DPNI处理了。这个不要说了，如果处理得不干净，那么模板质粒长出来，那么一测肯定就是没突变过来了。dingo8369我猜可能你是DPNI没处理好，我的建议是你取1uLPCR产物去做DPNI处理就行了（加上BUFFER和DPNI，最后体系10UL），早上放去酶切，下午两三点拿去转化，按我的经验它可以将PCR产物的模板去除得非常干净。由于你说的不够具体，所以我不能做进一步的帮忙。airforce8128 ：你稍等一下吧，写这个挺费神的，我会尽快把它写出来的。
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lxylly你好，最近用试剂盒做突变，把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化，所用培养基是以氨苄为抗生素吗？ 你好：这个不一定是以氨苄为抗生素的。你原先拿什么质粒做PCR的模板的呢？这个质粒是什么抗性，那么转化用的平板就是什么抗性。突变试剂盒只是在质粒上面做小修小补，而且主要也是针对里面基因的。所以一般不会改变到质粒载体的抗性。美玉太感谢了！我最近也在做定点突变，我的序列有2000多bp，好不容易拉出来，却发生了突变，RT又重复不出来，快烦死了，实验室没有做定点突变的试剂盒 ，您能告诉我另一个方法吗？ 正如dingo8369所说：“你可以重叠PCR.首先p两个片段，回收后在放在一起p.在回收连不带有酶切位点T载体，然后酶切/连接到原来载体。虽然能做出来，但是却很烦琐！！！”我也经常会设计含有typeII 酶的引物来连接这两个片段，从而完成点突变，同时这也是拼接两个片段的常用方法，现在太晚了，我没办法详细写出来，下次吧。不过我不建议你使用这种方法，这种方法一般是针对大片段的缺失或插入而采用的方法，在设计引物时还要考虑到相应的TYPEII酶切信息，也要买TYPEII酶。我的建议是不要用这种方法去做定点突变，还是用DpnI的方法去做定点突变，比较容易操作，引物设计也简单。去买小包装的DpnI酶，然后自己设计引物用PFU酶去做定点突变，一个点一个点地去改吧，除非你有多点突变试剂盒，里面含有那个特殊的taqligase类的东东。如果还有什么具体问题你也可以再具体讨论。快乐无忧：非常感谢！我也有个问题想请教！我正在做大片段的多点突变。按照试剂盒说明操作，先PCR,得到带突变位点的长片段。以这个长片段为引物，以质粒为模板，本指望PCR出全质粒，但转化后却没有长菌落。将PCR产物跑胶也看不到任何质粒大小的条带，只有不太亮的引物条带（600BP）。模板质粒在两个PCR反应中是一样的，第一个反应可以获得大量产物，在第二个PCR反应中，应该也没有问题。酶和BUFFER都是用的试剂盒里的。不知为什么得不到全质粒的扩增呢？是否长引物有影响？请赐教！谢谢！不好意思，拿600bp的条带当引物去做PCR我没有做过，你应该是PCR没做出来，我觉得你做PCR时的退火温度可以认真考虑一下，做个梯度PCR吧，它跟模板质粒能搭上多少碱基呢？这些碱基的TM值是多少呢，好好计算一下，再做一次PCR，PCR可以做多几个循环，PFU保真性能挺好的。PCR有时候很奇怪的，你要多摸索摸索一下条件，引物的设计也很关键，加模板的量也很讲究，有时加多了就做不出来了，把模板稀很可释十倍看看，一般有二三十纳克就很足够了。不知道这样回答你们满不满意。
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grzhangjing:您好，我感觉你应该是PCR方面出了问题：你PCR之后跑胶有没有看到条带呢？你转化之后是不是没有长菌呢？我估计是PCR根本就没有做出来。所以我的建议是调整你的PCR，看看引物有没有问题啦，看看模板质粒多长啊？你用的是什么BUFFER啊，你多少个循环啊？你的退火温度是多少啊？这些都有可能影响到PCR结果。我的引物大概是30个碱基，突变点在第16位，也应该没什么问题吧。首先我觉得你突变一个点用三十个碱基在引物长度方面应该是没有问题的，一般都要求在定点突变的两端至少要有十二个碱基。其它的只要你符合引物设计的最基本原理就行了，当然，我没看到你的引物序列，我也不敢就引物方面给出什么建议。公司的技术支持建议我先用别的高保真酶进行PCR，以确定能否能扩增出目的片段，如果没有问题再用试剂盒中的试剂进行操作。由于一般单点突变的试剂盒是把整个质粒都扩出来的，而质粒的长度一般都比较长，所以一般试剂盒会提供比较好的PCR酶和BUFFER，像TURBO就挺不错，非常好的扩增酶，扩增能力强而且保真性能好。只不过像TURBO这样扩增能力强而且保真性能好的酶一般比较贵。扩增能力和保真能力似乎是一对矛盾，一般酶要么扩增能力强而保真性能差像TAQ，要么保真性能强而扩增能力弱像PFU，所以有可能出现要么扩不出来，要么扩出来保真性能差的现象。所以公司技术支持的意见是对的：要先把PCR做出来，这时就不必过于强调保真性能，镁离子多一点，循环数多一点都无所谓，先把它P出来，然后再优化PCR条件，提高其保真性能。其实那个试剂盒里面就PCR酶和BUFFER好一点而已，再加上一点DPNI酶，其实这两个东西单买的话都不贵啊。还有一个顾虑，会不会在PCR过程中又引入新的突变呢？这种几率大吗？期待您的回帖指导！有可能出现这种机率，这要看你做PCR时的体系了，酶啊，BUFFER啊不过如果你最后用的是试剂盒里面的BUFFER和酶，那么这种概率很小，小到我做了几十个才引进过一次新的突变，运气不会那么差吧，PFU酶配上比较好的BUFFER保真性能还是不错的。你提供的信息有限，我也只能帮你分析到这里了。
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flyeye edited on
sahara81你好，其实突变只不过是用引物上的序列代替质粒上的序列，其实DNPI的优点就在于可以用引物把整个质粒都扩出来，然后再转化得到突变体，从而避免了把PCR产物亚克隆进载体（如酶切连接）的麻烦事而已。你是打算PCR后再把PCR产 物克隆进载体吧，这个完全可以不用DPNI处理的，其实DNPI只是去除模板质粒罢了，如果你的模板不是质粒，那么根本就用不到DPNI。如果模板是质粒的话，你可以利用胶回收去除模板质粒或者把PCR产物克隆进其它抗性的载体然后通过抗性筛选 来去除模板质粒。我准备改造的目的片断大约600BP,两端各有一个突变点，在所设计引物的中间，突变点的两头各有12个左右碱基。其实我的建议是突变点尽量靠近引物的5端，因为3端的引物主要是与模板配对的，而5端的引物才是主要的人工改造（如加酶切位点啊突变啊）部分，不过如果在突变点的后面还有十二个碱基的话，应该没有问题。现在准备用已经将含目的片断连在载体上的质粒为模板，用高保真Extap直接用两个突变引物P,然后不用DPNI去甲基化，直接进行筛选听得不是很明白，PCR后把PCR产物直接拿去转化？600bp的PCR产物是长不出来的，长出来的也是模板的那些东东。应该PCR后把它连接进载体后再拿去转化，如果是连回原来的那个载体，那么PCR后记得胶回收去除模板，如果是连回其它抗性的载体，则不用胶回收，直接连接后转化就行了。
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sahara81你好1 关于DPNI的具体作用能说明白点么？我一直以为它就去甲基化作用，处理后的PCR产物再进行筛选的话减少假阳性的。“DNPI的优点就在于可以用引物把整个质粒都扩出来，然后再转化得到突变体“ 不是很明白？其实我们实验的方法很不一样，我介绍的是依赖于DPNI酶的方法，就是通过引物在质粒上做小修小补，没有改变载体的性质。所以要依赖于DPNI酶，在整个实验中我并不需要引进限制性酶切位点，也没有酶切连接的过程，只是用PCR把整个质粒都给扩了出来，而我想改变的点就已经在引物上变过来了，如此而已，这 是一种懒人的做法，也可以加速实验的进程。其特点就是没有改变质粒的其它任何地方，只是改变了那一两个点而已。此时PCR产物和模板质粒的长度是差不多的，所以不可能通过胶回收的方法来去除模板质粒，PCR产物和模板质粒也只有一两个点的差异，也不可能通过抗性筛选 来区分它们，所以只能通过模板质粒在大肠杆菌中已经甲基化而PCR产物没有甲基化这个区别，用DPNI识别甲基化位点再把模板质粒消化掉而已。而你不仅变动了那两个点，而且连载体也一起变了，当然就要涉及到酶切连接的过程，这个时候你有很多方法去除模板质粒，蓝白班，抗性筛选 ，胶回收，根本就不需要用到DPNI酶。2 &听得不是很明白，PCR后把PCR产物直接拿去转化？600bp的PCR产物是长不出来的，长出来的也是模板的那些东东。&我是准备PCR后把产物连接进载体后再拿去转化的。这个没问题，我误会了你的意思了。整个实验方案我觉得没什么大的问题，祝你实验顺利。
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下面我以一个例子为例来讲100个bp以下的碱基插入缺失或者改变实验方案。其实这种方案并不是那么好的，只不过考虑到大家一般都没有TYPEII限制性内切酶或者UDG and NTHIII（另外两种方法），所以才打算先介绍这种方法。首先先说明一点，这种 方法在原理上存在一定成功机率，也就是说有运气成分。而定点突变则一般都是百分之百成功的，而这种100bp以下的插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好的克隆，大家如果要用请慎重考虑。同样的，我只变那几十个碱基，并没有改变载体及其它地方，所以我还是依赖于DPNI酶。举例：Homo sapiens FzE3 是一个人类基因，其含有32个氨基酸的信号肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVAVAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLTWFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDALRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTVPATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIVGITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信号肽和成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个Leucine。即在信号肽和成熟肽之间插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十个bp）实验设计：信号肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG成熟肽：CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGCAAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCCGTACCTGGGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAACGGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGGTCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGGCGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCCGTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCGCTTCTCGGACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTCATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACTTGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTACTTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGCCAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCGCTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTGCTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAGACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTGCCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAGCGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGGCCACTTCCCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTCGGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTCTACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG通过引物3端大于或等于18个碱基的匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5端的序列来补上那三十个碱基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来，上游和下游引物就刚好把那三十个碱基给补上了，再参照引物的设计原则做一些润色，细心的朋友可以具体分析一下这两条引物。扩出来后再用DPNI酶把模板质粒去掉，再用连接酶把PCR产物的两端连接起来（虽然是平端连接 ，可是由于是同一条PCR产物的两端连接，效率会很高），转化后，测序验证，OK。设计引物forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG88.5reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT86.9但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一个碱基的效率最多也是百分之九十九点几而不是百分之一百，所以我们拿到手的引物其实是一个混合物，比如说我们合成一条长二十个碱基的引物，实际上拿到手的是一个混合物，里面即含有二十个碱基的引物，也含 有一定比率的十九个、十八个、十七个……碱基的引物。所以我们用这种方法做PCR时，如果连上的是足额长度的引物，那么实验也就成功了，如果连上的是少一两个碱基的引物，那么实验就失败了，不过引物当中主要的仍是足额长度的引物，所以成功机率还是蛮高的。不过送测序时就要做好准备，可能要测三五个才能拿到一个好的。如果觉得这样不好的话，我稍后会附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它们是通过互补粘端来连接，就不存在这个问题。下面附上详细实验过程：第一步：设计引物；其实只要符合一般引物设计原理就行了，顺便说一下，引物一般的话，越长其质量就…………第二步：引物PNK处理，一般合成的引物其三端是没有磷酸化的，所以我们要自己进行磷酸化，一般可以让其磷酸化过夜，不磷酸化的话最后一步连接就连不上哦。第三步：PCR，跟基因定点突变一样，要用好的扩增酶和BUFFER，因为要把整个环高保真的圹增出来嘛；第四步：DPNI处理，跟基因定点突变一样，要把模板去除干净。第五步：连接，加上连接BUFFER和连接酶连接，第六步：转化。OK大家如果有什么疑问，我们可以一起继续讨论。
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flyeye edited on
同意gre007的看法，所以我没买过试剂盒，Turbo我也没买，我是用自己实验室纯化出来的Phusion，DPNI正在打算看能不能自己纯化出来，PCR反应体系25UL，取一微升去DPNI酶切就行了，补水补至10微升去切。转化取三四微升就行了。对于插入突变来说，想把一段序列去掉是容易的事，至于这段序列是多长，是1600bp，还是10bp或者3000bp，其实做法都是一样的。比较麻烦的是要把一段比较长的序列补上去。
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随机突变试剂盒就是通过PCR来引入新的随机突变，虽然都是通过PCR反应来引入突变，但是二者有很大区别：基因定点突变是带有目的性的，例如：我要把某个碱基变掉，我要把某段序列删掉；而随机突变是随机的，也就是说实验后究竟变了哪个碱基我们在做实验前无法预测，只能通过测序去看结果。这是研究蛋白的两种不同的方法。其实主要通过降低PCR反应的保真性来增加PCR反应的突变来达到引入新的随机突变。本人没有做过这方面实验，故无法发表更多评价，不过感觉上这种试剂盒应该也可以DIY的。附上随机突变试剂盒说明书
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my1978：你好：其实你这样是完全可以的啊，另外一种思路。我这样做的好处是快和方便，基本上当天可以做转化。至于保真性能：我们也可以不用太过担心：因为定点突变（第一种方法）的PCR反应根本就不是一个PCR反应：你可以画图：在模板变性后，互补反向引物分别与模板的两条链退火，然后延伸，完成第一次扩增后，其扩增产物是一条链完整（模板）另外一条链带有切刻（扩增产物）的环。之后第二次变性后，一条链完整（模板）和另外一条链带有切刻（扩增产物）分开，一条链完整（模板）能够与引物搭上继续下一步反就，而另外一条链带有切刻（扩增产物）则因为带有切刻无法延伸。接下去…………总之，只有模板的两条链能够做为模板被扩增，而PCR出来的链切由于带有切刻而无法做为模板进行下一步的扩增，所以它根本就不是一个指数增长的PCR过程，而是一个线性增长的过程，只有做为模板的两条链（不会错配）被反复扩增，而不会出现平时PCR反应里面的错配被不断叠加的情况，从而大大降低了出现突变的可能性，从原理上大大提升了反应的保真性能，再加上高保真的PFU酶，总不会只扩增一个循环就突变了吧，也有这个可能，但机率很小。
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这个根据你的PCR酶而定，说明书上写多少就是多少。
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congcongrenlei你好，退火温度根据引物的TM值而定，一般是TM减去3至5度，延伸一般是72度。PCP做不出来有很多原因，常用的解决方法是用试剂盒重新纯化质粒啊，换个好一点的酶啊，查查引物有没问题啊等等。
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但将这两个得到的片断连接时却总是连接不上，跑PCR时看到总是有长长的托尾，无目的条带我的意见：先将得到的片段做进T载体，先保存起来先，PCR产物毕竟没法长期保存，以免到时又得重头开始。然后，检查一下两个片段的连接那地方的引物设计有没问题，如果没问题的话PCR时加入连接产物的量减少试一下。
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我自己写的………纯属原创如有雷同纯属奇迹其它网站转载了可能没注明出处罢了……最原始的测序文件我都有……
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gandalf886
你好,嗯,序列确实是搞错了,我想在原文上面改,却发现已经过了三百六十天,改不了了,谢谢你指正我的错误.正确序列应为(目的序列有九个A,而现有序列为八个A,要把八个A突变成九个A),X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924*********************************************** ************|------&deletionX71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984************************************************************（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）zhengyanling:连进T载体有可能是正连也有可能是反连,各有百分之五十的机率,只要测序正确就可以了,用来做定点突变完全没问题,把它切下来也没有问题,不管是正连的还是反连的,切下来都一样.
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用DH5a可以的没问题的。
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不好意思，好久没来维护这个贴子了，不知现在回复还有没有用。to
liuyicheng84427看到你的帖子我不是很明白，既然长不出来克隆菌落你是怎么确定你的突变PCR肯定P出来的那？直接进行琼脂糖凝胶电泳 就知道有没P出来。to
风姿花撰楼主你好，请问一般的退火温度是引物tm值减5， 为什么protocol要求的引物tm值是大于或等于78而建议的退伙温度是55呢？ 引物的TM值大于或等于78度是为了确保突变成功，这一点要特别注意，一般在突变位点的两端各取十五个碱基即可，如果AT含量过多可适当增加长度。建议退火温度55度这一点无所谓，只要PCR能P出来就好，不一定要55度，黑猫白猫抓得住老鼠的就是好猫。to
xuxu_lyy您好，看了您的帖子收益非浅，有几个问题想请教下您：1.我目前做一个质粒的单点突变不成功。采用KOD-plus,16cycle,我的引物是参照stratgene mutagenesis kit 设计的，31bp,突变点在最中间，左右各15bp,Tm=64度，我PCR采用的退火温度为55度，PCR结束后，取10ulPCR产物采用dpnI酶切（20ul体系）37度6小时，然后总共20ul转化JM109,37度180 rpm摇1小时，然后涂板。但是一个克隆都没有长。这个是我们实验室的通用做法，但是不知道为什么作不出来，请问您觉得是什么原因导致失败？本来我觉得就是PCR没有产物，但是根据实验室经验，一般16个循环跑胶根本看不出，所以没法判断。我PCR时，采用KOD-Plus, 1000bp是1分钟，不知道时间是不是短了。请您指点迷津。2.定点突变PCR出来的产物都是有缺口的，而公司的Kit使用的感受态，一般能够修复缺口，但是我们使用的自制感受态JM109也能修复DNA缺口么？期待您的回复！ 第一个问题最大可能就是PCR根本没P出东西来，也就是说突变PCR失败，PCR失败的话那么后面也就没有任何意义了，虽然试剂盒上说PCR成功的话琼脂糖凝胶电泳并不一定能跑得出来，但是如果能跑得出来的话说明PCR已经成功，所以建议PCR后取5微升进行琼脂糖凝胶电泳，有条带后再进一步进行下一步实验。第二个问题；自制的也可以，一样的，只要菌株没问题即可。
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to 雕弓满月射天狼各位站友，我最近也在做点突变，一直做不出来，我的做法是：（1）PCR（2）将PCR产物用回收试剂盒回收后，用DpnI酶切（3）直接取10ul转化这个步骤有没有问题啊？会不会是PCR产物纯化后回收效率太低？PCR产物可以不纯化直接用DpnI处理吗？原来PCR的缓冲液成分会影响DpnI酶切作用吗？我的做法是不回收，直接取1至5微升（根据PCR条带的强弱变化）进行DPNI酶切，当然要加BUFFER，也要补水，最后反应体系是10微升，一直都是这么做的，实践证明没有问题。当然这时是要求感受态必须是商业化的感受态（转化效率达到十的七次方以上)，自己用氯化钙制备的感受态由于转化效率太低经常误事，有可能做出来了，但是由于转化效率低而不长菌或者长菌很少。TO 宋喜梅谢谢有这么好的帖子,收获很大.我是一新手,现在正打算做两个缺失突变,各6bp,下面是我的思路.请大家多多指教.先谢过了1.有酶切位点（后来要连表达载体的）的目的片段连T载体2.在缺失第一个6bp的两端设计引物，PCR(高保真酶)，电泳，···？··· ，DPN1酶切，转化，检测3.在测序确定后的质粒上采取类似操作。基本思路是这样，可以吗？具体的问题是：1.在第2步中用的引物除了位置被限定外，其它和普通PCR引物一样吗，有没哪些不同的呢？2.在PCR之后得到的是DNA链，怎么连接成环呢？连接前要不要磷酸化什么的？3.是不是存在这种可能：PCR后电泳能看见条带，但是转化不超过，不能长菌，会不会可能在PCR过程中质粒上的非目的片段区域发生突变，以致失败？知识还很欠缺，问题可能很弱，让战友们见笑了。期待回应中···················· 第一个问题：没有什么不同，在被限制的情况下尽量按照经验优化引物。第二个问题；并不需要连接，第一种方法QUICKCHANGE是在细菌里面自连的。第三个问题：PCR后电泳能看见条带，但是转化不长菌，有可能是由于PCR是假阳性，因为我们一般都是用质粒去做突变PCR，质粒的浓度挺大的，所以即使PCR 阴性，反应体系里面用做模板的质粒也能跑胶显示出条带，所以建议做PCR时做一个负对照，除了引物什么都加，那么这个肯定P不出来，但是它也有可能有条带（质粒的带），但是如果和阳性PCR管一起跑胶的话，阳性PCR管的条带会明显的比阴性PCR管的条带要亮。
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TO cathy719其实我自己做定点突变也挺有经验的，用你提到的方法已经做了6，7个mutation了。但是这次做的时候总是有问题，请问一下楼主看能不能帮帮忙。引物是25bp，里面有2个不匹配的碱基，Tm是58.3度。PCR的时候用的是touch-down,用的是 Pwo酶。95度 2min95度45s63度30s72度4min30s95度45s61度30s72度4min30s。。。95度45s53度30s72度4min30s重复9个循环72度7min退火温度从63到 53，62到52，60到50都做过，就是p不出来要的东西，跑胶只能看见引物二聚体。模板DNA酶切鉴定过了，没有问题。而且我用载体测序的引物p过了，可以p出目的带。所以可以说模板，酶什么的都没有问题。后来查引物，发现引物GC%有点低，33%，不过我实验室以前有个mm也做过类似的，后来也能p出来。不知道要从哪里优化比较好？ 回答：说实话，确实引物TM值比较低，但其实没关系，我试过很多TM值很多的引物同样也能P出来，但有些突变PCR会死活做不出来。这时可以有二条出路：第一：继续换条件摸；第二：换方法，换成重叠PCR法，这时需要有两端的引物，如果你有的话那么马上换成用重叠PCR法来做吧，这样基本上只需要劳动力而不需要什么新的东西。TO 茯苓猪爱设计的引物需要用PNK磷酸化吗？可以用胶回收方法回收PCR产物吗？我用4ulPCR产物跑胶，一条非常亮的约5000bp条带（120v,120mA,20min）刚出孔，一条2000bp条带和3ul marker亮度差不多。是不是应该回收 线性的那条啊？ 回答：你用的是第一种方法也就是QUICKCHANGE那个方法吧，这种是不需要用PNK磷酸化的，我的经验是可以不胶回收，直接进行DPNI处理，当然你胶回收也没问题。当然是要那条长度和你的原质粒一样长的那条（我猜测应该是五千的那条吧），不过这个时候也可以不用胶回收，那条两千的那么短，一般缺少了载体的必要元件，反正转进感受态里面也长不出来。
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楼主请问设计突变位点的两条引物都要包含突变位点吗？还是说只要有一条有就行，另一条可以不用包括回答：你好，本贴的第一种方法（quickchange法）两条引物都要包含突变位点，突变位点一般在中间，两条引物是反向互补序列。
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正要做点突变，已买了英俊的盒子，不知道楼主用过没有，需要注意点什么？to 你好，需要注意的是，第一：引物要设计好；第二：PCR要做出来，第三：DPNI处理要彻底。请问：退火温度设置为Tm-5?定点突变延伸温度一般为68度，如果这个时候Tm-5比68大怎么办啊？to 延伸温度调成72度即可，若Tm-5很大，可以做两步法PCR，即把退火和延伸合并在一起，都是68度或者72度，时间再延长一点即可。
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下面是我与一个站友关于定点突变的通信来往，我觉得对其它站友可能有帮助，我在征得对方同意后决定把它贴出来，并已经把相关信息隐去，希望能给其它人带来帮助，大家有什么问题也可以直接联系我，我会尽我所能帮助大家：, QQ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@嗨，你好：在网上看到你发的一个很经典的关于定点突变的帖子（/bbs/topic/7734237?onlyHost=1），受益匪浅。其实我在2009年4月份研究生期间，在做关于一个定点突变表达蛋白试验的时候，就仔细研读了你的文字，那次还算顺利。现在读博士了，做的是关于micoRNA的东西，又要做一个定点突变的小试验。就又找到你的帖子，再次拜读，看能否有更深的领悟。不过与上次不同的是，这次用quick-change site-directed mutagenesis kit.因为我用的时候，几乎都没有了，所以在等待新kit过程中，就试图用非试剂盒的方法去做。可是怎么都不不出来，特来请教您，请给与指点。WT（原来序列） CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT agt att aTA GGT ACT ATA AAC CC
A GGU AGU AAU GGG CCG UCA UAA UWT中的小写字母部分呢，是基因A与mir-甲的binding sites,我现在要采取突变，将AGT ATT A突变，使之不能结合。MUT Fwd引物5?CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT Aca taT ATA GGT ACT ATA AAC CC
MUT Rev引物
5?GGG TTT ATA GTA CCT ATA TAT GTA GGT ACT ATA TAC TAG GAT TG Tm 70.18°C
GC 32%Tm &78°C(Quickchange II Site-Directed Mutagensis Kit)1．
实验室有1个试剂盒（这个质量保证，但是用完了），3个旧的，不知放了多久了，不保证质量。我的protol附件中的要求做的：Plasmid
2ul,Fwd primer 1ul，Rev 1ul, dNTPs 1ul, 10*Buffer 5ul, ddH2O 40ul, pFU 1ul. 用的buffer等都是用这些旧的试剂盒拼凑的。然后就是DpnI 处理1h，转化。但是试剂盒提供的XL1- Blue supercompetent cells 没了，我就用实验室自己做得XL1-Blue or DH5a.结果平皿上只有2 or 5个克隆，测序鉴定都不是突变株。2．这个时候觉得那些老的试剂盒也许失效了。就试图用手做，反正常用的试剂实验室都有。Fwd primer 2ul, Rev 2ul, plasmid 2ul, 10*PCR buffer(实验室自己的，非pfu的）5ul,dNTPs 4ul,pfu 1ul, ddH2O 34ul94度预变性30s，98度15s，53度15s，68度4min30s，15个循环后，72度5min.将50ul PCR 产物，100ul 无水乙醇和15ul 3 M NaAc 均匀混合后，-20度30min, 12000rpm 10min, 去上清，75%酒精漂洗1次，37度烘干。最后加入17.5ul的去离子水，0.5ul DpnI 0.5ul和10*buffer 37度60min.
转化，测序。我做了2次，第一次，平皿上有12个克隆，对照平皿（就是你帖子中说的）5个。第二次，平皿上1个，对照没有。我都测序了，没有突变株。不过有一个挺有意思的，我需要突变的那一段，它自己跳跃过去了（ORI是原始序列，SEQ是测的序列）（见附件）我从新设计了引物：Fwd: CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT GGC GTT ATA GGT ACT ATA AAC CCRev: GGG TTT ATA GTA CCT ATA ACG CCA GGT ACT ATA TAC TAG GAT TG75.35°C
44bp 请问有没有好的建议呢？另外我还是想问个问题，你在帖子上也说了，Tm要求大于78度，可是实际扩增就是55度左右吧。你的Tm是怎么计算的？有要求吗？我是根据试剂盒的公式计算的退火温度。可是实际拿到的，如果不是这个数字，我扩增的时候该怎么选择呢？@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@你好，不好意思最近事情比较多，所以回信比较晚，我仔细看了你的情况，下面是我的一些建议，希望我的经验能给你带来帮助。你设计的第一对引物及第一次尝试，结果都是没有突变株，没有做负对照，实验平板上面有2个或者5个，均不是突变株，我本人估计原因可能有三个，一、引物设计得好不好？我看了你突变位置的序列，GC%很低，而且要突变四个碱基而不是一个，这在原则上都要求在突变位点的两端加多一些碱基，一般指的两边要有15个碱基是针对GC%在40-60%的单碱基突变，我发现你第一对引物的左边有22个碱基，而右边有18个碱基，感觉左边是够了，右边要是能再加上四个碱基就好了，这也很可能是你出现这种“诡异”测序结果的原因。其实引物设计上不仅有总的TM值要求，还要在引物的两边尽量平衡，并不是说两边引物长度差不多，而是指两边TM值差不多，两边如果AT多的话那么引物就长一点，如果GC多的话那么引物可以短一点。二、究竟PCR有没有做出来？如果PCR没有做出来，那么一切都是白搭，不过你第一次实验做了多少个循环？如果可以的话可以把实验管和对照管一起跑个胶，看电泳结果一不一样，如果实验管比对照管条带亮，那么就表明PCR阳性，感觉不做这个电泳总是心里没底。还有一点就是，做PCR时模板质粒并不需要加2微升那么多，加0.5感觉都太多了，一般加0.2就行了。不过体积不重要，重要的是你加了多少质量进行，多少纳克？现在提出来的质粒一般有100ng/ul以上，这样加一微升的话肯定够了。三、DPNI处理得干净吗？发现你每次都只处理1个小时，我心里总是发虚，感觉不踏实，你加了2微升质粒，确只给了DPNI一个小时的时间去把质粒干掉，会不会干掉了大部分而有小部分成了漏网之鱼而长在平板上呢？我的建议是前面做PCR质粒少加一点，取一部分PCR产物进行DPNI处理即可，DPNI处理的时间延长至三-四个小时，总之一切都是为了把模板彻底地去除干净，减少未突变体的产生。由于你第一次未做对照实验，失败原因不好说，引物设计要是在右边加多四个碱基就好了，可能是PCR没有做出来，也可能是DPNI没处理好。至于第二次，由于你说的那种“诡异”测序结果的出现，而且阳性平板克隆数12个，多于阴性对照的5个，可以证明你的PCR是做出来了，但由于还有没有突变株，且阴性对照还是有5个，正常情况是一个都没有的，所以我觉得DPNI同样没处理好，PCR时质粒太多，DPNI酶切时DPNI加太少，酶切时间也太短。你重新设计的引物我感觉还是存在我前面提到的问题，两边不平衡，要是在右边加多几个碱基就好了。希望我的回复能够对你的课题带来帮助。, QQ @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@谢你的回复！关于设计的连续4个碱基突变的引物，我个人感觉不好。转化等，长出菌，我想是不是扩增的结果，是DpnI 没有处理完全。只有一次，我觉得测序结果，包括我需要的4个突变碱基在内的几个碱基缺失，我想应该是扩增的结果。我从新设计了引物：3对：3’UTR WT:AA TTT CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT AGT ATT ATA GGT ACT ATA AAC CCT AAT TTTTTTTMUT3()Fwd: CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT CGG
CGT ATA GGT ACT ATA AAC CCT Rev:
AGG GTT TAT AGT ACC TAT ACG CCG AGG TAC TAT ATA CTA GGA TTG74
Mut6()Fwd: CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCTGGC GTT ATA GGT ACT ATA AAC CCRev: GGG TTT ATA GTA CCT ATA ACG CCA GGT ACT ATA TAC TAG GAT TG75.35
44bpMut 9 Fwd: CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT CGG
ATT ATA GGT ACT ATA AAC CC 76.37
44bp这几对引物，你倾向那个呢？从原始序列可以得出，如果像你说的那样，2边再多些碱基，但都是AT,所以我们也没有办法。还有，计算出来的Tm，实际扩增的时候，用什么温度呢？能不能告诉我你得PCR的扩增程序啊？@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@你好，仅仅从定点突变的角度：我个人比较偏向于第三对，第二对次之，第一对最末，即推荐以下这一对：Mut 9 Fwd: CAA TCC TAG TAT ATA GTA CCT CGG
ATT ATA GGT ACT ATA AAC CC 76.37
44bp退火温度用70度，延伸时间要长一点，比如说质粒全长6K，一般要加多两分钟，延伸时间设为8分钟比较合适，循环数可以多一点，突变机会很小，可以设为25个循环，做完后可以跑个胶看看有没P出来，注意做一个阴性对照，要不你两微升质粒当模板的话即使PCR阴性原来那两微升质粒还是可以跑胶跑出来的。祝好运，如果有进一步实验结果不知你是否能告知，让我也同喜一下，谢谢！, QQ
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那你最好还是用酶切连接的方法来完成吧，由于刚好是在多克隆位点上，那么只要挑两个酶切位点，做一个PCR扩增并改过突变，再做一个酶切连接即可，由于片段可能比较小，回收时要小心丢失。
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其实私底下都已经回复你们了，怕其它人觉得我不回答问题，还是再回答一遍楼主你好，一直没看到您出基因片段删除的讲解，我要做TCF-4的N末端30个氨基酸缺失的DN-TCF，所以想向您请教。一、片段删除用什么kit？二、方法是否就像这个帖子中说的那样？谢谢！ to
小师妹由于你是将人的基因转进人的细胞，所以不太需要考虑物种间密码子喜好的问题，如果是将人的基因转进细胞或者酵母等其它表达体系，那就需要将外源基因优化成表达体系喜好的密码子。所谓喜好的密码子，也就是说编码同一个氨基酸的有好几种密码子，不同表达体系有它们偏好的密码子，用表达体系偏好的密码子，能够更好地表达这个蛋白。因为在这个表达体系里面同样是翻译一个氨基酸，虽然有好几种密码子，但体内携带这个密码子的tRNA比较多，而携带另外一个密码子的tRNA比较少，用前者肯定有利于表达啦。
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大家有什么疑问我们可以一起讨论讨论一下：weixin: luckamily
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