我在做考马斯亮蓝测蛋白质含量,在标准曲线制作时.老师要求R值0.99以上,我现在只徘徊在0.984附近,我实验用的就是移液枪.但是有点不准,我就是想知道是不是移液枪不准会对实验结果影响有我的这么大
没做过这个实验 但是可以确定的是做曲线这个活儿 要看运气 配标准品时量具要准 尽量小体积来配制 这样可以用枪 枪比其他量具的稳定性（误差拨动小）好 用小体积的标准品时 可以用96孔酶标板来测定OD值 保证测量误差均一我现在做蛋白浓度测定是用的pierce的BCA试剂盒 用酶标板测定 r值一般在0.997以上 移液器一般要定期校准,一般至少半年到一年得校准一次,枪的不稳定性确实会给实验带来比较大的麻烦,还有你可以试试另外一种方法“深吸浅打”,就是将枪按到第二档位吸液,打的时候打到第一档
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求助！关于考马斯亮蓝制作标准蛋白曲线的问题，麻烦各位进来看下！
用的是1mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液制作标准曲线，配制成20μg 40μg&&60μg&&80μg&&100μg ，总体积是1ml，可是测出来的OD值好大啊 ，连续测了两次都后面的浓度全都超过1了，正常的一般是0~1之间的啊！
& && & 寻求各位虫子的帮助&&谢谢 ！
可是蛋白含量已经很低了啊& &&&我师姐以前都是用200μg&&400μg 600μg 800 μg 1000μg 做的标曲&&线性也可以的啊
最后总体积是0.1ml，蛋白质含量分别是20μg 40μg&&60μg&&80μg&&100μg ，加的3ml考马斯亮蓝，没有用到酶标仪啊
而且我测的还是负值啊&&不知道怎么回事 做了十个梯度&&前五个递增 后五个递减 不知道是怎么回事！
首先要说明的是，你在这个帖里说“最后总体积是0.1ml，蛋白质含量分别是20μg 40μg&&60μg&&80μg&&100μg ，加的3ml考马斯亮蓝”，样品体积为0.1ml，考马斯亮蓝为3ml，一共3.1ml。但在这个帖里&&http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=3323351&&说的是“每个最后体积是0.1ml ，最后加入3.5ml的考马斯亮蓝”，到底你用的是什么样的体系？参考的是什么样的文章，可信度如何？
测定体系较大，是不是你用的分光光度计一定要3ml样品才能测定？我觉得浪费试剂。我们的分光光度计不用3ml那么多的，你看看能不能把体积缩小。
姑且不考虑样品和显色剂体积的问题，就从显色之后溶液中BSA的浓度来看，你样品中含有100微克BSA时，显色之后溶液中BSA的浓度为100/3100约等于0.032微克每微升，在我的实验里，这个浓度是在线性范围内的。虽然我用酶标仪来测定，但是线性范围内的浓度范围是不变的。
在我的实验里，单单是考马斯亮蓝的吸光度就达到了0.6，线性读数最高不超过0.95，也就是说考马斯亮蓝法测定的线性范围只有0.35而已。如果有酶标仪就别用分光光度计，用BCA法，线性范围可以达到1.0，测起来舒服得多。
你这张帖里 http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=3323351 读数那么奇怪，我怀疑是操作错了，或许没有做三个重复，没有标准偏差的。
附上我做的一次标准曲线
首先&&样品体积和染色液体积我看的参考书里没有特别规定&&0.1ml总体积加入3.5ml染色液的有 ，也有1ml加入5ml染色液的。我们的分光度计型号UV-756型分光光度计，不是说比色皿所装液体的体积要超过其四分之三吗，那至少是要3ml啊
还有& &你说的三个重复&&是在一次实验里测三次吗&&还是重复做三次实验呢？
明白了&&还有& &制作标准曲线的时候 到底是按照浓度还按照蛋白的量来做横坐标呢？
谢谢！ 我最近做的一次 R方是0.9792，行吗？ 测蛋白含量只是为了后面确定电泳上样量& & 是不是一定要非常精确呢
导师不管这个的&&实验的目的主要是为了跑后面的电泳 所以不知道依据这样线性关系的加的样品跑出来结果怎么样
唉~我做出来的是Y=0.005X+0.4151&&X蛋白含量&&Y 吸光值& &
刚测出来一个样品里吸光值只有0.059& &就是您所说的截距大了& &这怎么克服呢？难道在做一次标准曲线？
用紫外分光光度法，Brad-ford方法测蛋白浓度，考马斯亮蓝的吸光度不可能像你说的那样达到0.6，我测得的空白的考马斯亮蓝吸光度都是很低的，线性也可以达到0.99，当然用ＢＣＡ试剂盒酶标仪来测定很快速，线性也很好，灵敏度理论上是毕考马斯亮蓝法高，但ＬＳ有没有考虑到酶标仪测定是非常迅速的，光达到一个样立马一到达下一个样品，在一个样品上所需的时间很少，这也不能说它完全没有误差，况且BCA试剂盒不能反复冻融，各有各的缺点和优点吧，看自己实验室条件如何，而且一批实验用同一种测定蛋白浓度的方法，误差也是差不多的，趋势不会有太大改变
恩&&呵呵&&请问下 你的那个标准曲线图的横坐标1~8是蛋白的微克数吗？
“考马斯亮蓝的吸光度不可能像你说的那样达到0.6”
你看看我十楼的测定体系，依照放大倍数放大到你的总体积时，所加稀释液体积是不是一样的，如果体系中那些比例不同就难说了。你说不可能，我觉得不应该说得这么绝对。
“BCA试剂盒不能反复冻融”
这东西是室温保存的，我们实验室的试剂盒上写着的，不用冻存，使用时也不用融化。你用的BCA是-20度保存的？
“但ＬＳ有没有考虑到酶标仪测定是非常迅速的，光达到一个样立马一到达下一个样品，在一个样品上所需的时间很少，这也不能说它完全没有误差。”
我加样品的时候非常快，而且BCA是显色半小时才测定OD值的，只要我在一分钟内可以加完50管就可以无视误差了。你该不会是把蛋白质样品加到显色液里吧？那样太慢了，而且也不能混匀，我是把BCA试剂加到样品里的，20微升的样品加180微升的显色剂，大体积的显色剂一加进去有冲力，一下子就混匀了，所以我可以一秒钟加一管显色液，加样时间产生的误差相对于30分钟的显色时间来说完全可以无视。
“而且一批实验用同一种测定蛋白浓度的方法，误差也是差不多的，趋势不会有太大改变”
问题是，这不是R平方值能达到多少个9的问题，而是楼主的B值太大了，使得曲线完全无效，你没有看他的那条标准曲线？
是的，样品体积为20微升，含有0-20微克的BSA，如果换算成浓度就除以二。
配好的蛋白溶液不是会失活吗& &&&失活的话测出来还准嘛
嗯 是的&&我也是用BSA粉末现配的&&我的意思是说 配成蛋白溶液放在室内 会不是变性&&对测值会不会有影响啊？不是说蛋白质的稀溶液非常容易变性吗
呵呵 由于实验需要 今天又来看了下 你关于三次重复的说法 可是按照你说的这样 说白了不就是重复三次所做的实验吗&&只不过你说的是&&在同一次实验中 就设置三个相同的浓度& & 我觉得和做三次实验 结果不都是一样的吗？
嗯 ！那我重复所测得的试验结果 最后再平均 是这个意思吗？
我的样品吸光度只有0.008，而截距有0.317，截距很大，计算会出负值的，怎么办?楼主找到解决方法了么?
我也遇到这个问题了，楼主解决这个问题了么
吸光度最小的样，不要把样稀释，浓点去测。。然后再计算。
我也遇到这个问题，求助。
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随时随地聊科研考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线?一、 标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量.因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术.二、 蛋白质含量测定方法 1、 凯氏定氮法 2、 双缩脲法 3、 Folin-酚试剂法 4、 紫外吸收法 5、 考马斯亮蓝法 三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇,8.5%（W/V）H3PO4.2、 标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）.2、移液管使用（）.（三）、标准曲线制作：试管编号 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 1、 2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线.1）、利用标准曲线查出回归方程.2）、用公式计算回归方程.3）、或用origin作图 ,测出回归线性方程.即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上.4）、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧.（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内）,依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量.一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算.（五）、注意事项：1、 玻璃仪器要洗涤干净.2、 取量要准确.3、 玻璃仪器要干燥,避免温度变化.4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照.
清枫仏痺暎
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、 标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量.因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术.二、 蛋白质含量测定方法1、 凯氏定氮法2、 双缩脲法3、 Folin-酚试剂法4、 紫外吸收法5、 考马斯亮蓝法三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇,8.5%（W/V）H3PO4.2、 标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）.2、移液管使用（）.（三）、标准曲线制作：试管编号 0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm
1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线.1）、利用标准曲线查出回归方程.2）、用公式计算回归方程.3）、或用origin作图
,测出回归线性方程.即A595nm=a×X(
)+6一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上.4）、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧.（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内）,依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量.一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算.（五）、注意事项：1、 玻璃仪器要洗涤干净.2、 取量要准确.3、 玻璃仪器要干燥,避免温度变化.4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照.药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步骤（一）、实验准备：1、 准备所需的药品和玻璃仪器.2、 洗涤.（怎样洗涤算干净?）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1)、G/V比例如配1% NaCl,称1g NaCl溶于100ml 水.2）、V/V比：例如配75%乙醇100ml,75%×100%=100%×X,
X=75ml.取75ml无水乙醇,加25ml蒸馏水.乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml,各取200 ml,100 ml,200 ml混合.3）G/V比：用的较少,如计算灰分中某种元素如Fe的含量.2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明.1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml.M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g
摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100mlmM=毫摩尔数/体积（L）
称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g
毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量3）、0.1uNaCl配100mlmM=微摩尔数/体积（L）
称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg微摩尔数=G（ug）/摩尔质量
称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、 混合溶液配制的计算：如配3uMEDTA,2.25mM NBT以及60uM
溶液100ml,用50mM磷酸缓冲液配制.注意：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合,但总体积不能
为100ml（三）、标量：1、 根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器,如量筒或移液管.2、 电子分析天平的使用.（四）、溶1、 根据药品配置要求选择溶剂.蒸馏水,双蒸水,无离子水等.2、 只能用烧杯溶解.注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右,剩余溶剂洗涤烧杯三次左右,直到洗涤干净.小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式,可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）.如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解,但pH应在被要求的范围内.3、 加热促进溶解,但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好.如:配0.1%的淀粉,水裕加热（温度在80-90.C）,过量会糊化.（五）、定容：1、 用容量瓶定容；2、 用玻璃棒引流或用小漏斗；3、 用溶剂加入到接近刻度,然后用滴管加入到刻度.要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；4、 上下窑洞容量瓶几次,混合均匀即可.(注意不再定容了,防止溶液漏掉.)（六）、装入试剂瓶,贴上标签.标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等.（七）、清理实验场所.二、磷酸缓冲液的配制.（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液.用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液.选用药品：Na2HPO412H2O（碱）和NaH2PO412H2O（酸）配缓冲液100ml.书中说明.（二）、计算 ：1、 注：书中有注明配置的量.2、 计算：Na2HPO412H2O称取71.64×0.1=7.164gNaH2PO412H2O称取 31.21×0.1=3.121g3、 含有不同结晶水的换算.书中配1/15mol/L的缓冲液配1L,书中用Na2HPO42H2O需要11.87g/L但用Na2HPO412H2O需多少g?11.87=（178/358）×X,X=23.87g.（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）.即：0.2M
Na2HPO42H2O和NaH2PO42H2O100ml.（四）、按书中的量配制取量再混合.如：pH=6.8,分别去缓冲对49ml和51ml.（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值,检测配置是否准确.（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ,以你配制的母液稀释即可.计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；取0.2M
pH=7.2的缓冲液25ml,用蒸馏水定容至100ml即可.
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