anti-His tag抗体,聚组氨酸抗体标签抗体-上海研晶生物技术有限公司
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【简单介绍】
anti-His tag抗体,聚组氨酸抗体标签抗体现货促销，研晶生物科技最专业的抗体供应商为您提供抗体的售前、售中、售后服务，现货供应，这个抗体主要实验应用于IHC、WB、 IF、IP、ELISA，质量保证，无效免费退换，另外本公司生产经营各种标记二抗、免疫印迹常用试剂、免疫组化常用试剂，欢迎来电咨询！
【详细说明】
anti-His tag抗体,聚组氨酸抗体标签抗体，产品经无数次市场验证，若出现质量问题可无条件换货或退货，现货直销,免费送货上门。【产品规格】：0.1ml/0.2ml【抗体来源】：Rabbit OR Mouse【产品用途】：用于免疫组化实验,WB实验,相应的标记抗体有HRP标记抗体,FITC标记,BIO等。【货 期】： 现货【性 状】： Lyophilized or Liquid【浓 度】： 1mg/1ml【亚 型】： IgG【贮 存】： 贮存于-20℃.【相关标记】：HRP Biotin Gold RBITC AP FITC Cy3 Cy5 Cy5.5 Cy7 PE PE-Cy3 PE-CY5 PE-CY5.5 PE-CY7 APC Alexa Fluor 350 Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 555 Alexa Fluor 647 &&anti-His tag抗体,聚组氨酸抗体标签抗体溶解方法：方法1：我们的抗体&已经包含了0.01M PBS、1% BSA和0.1% 防腐剂（叠氮钠或庆大霉素），您只需要加入灭菌的双蒸水就行了。抗体溶解后，置于-20℃保存，最好分装后使用，避免反复冻融，可保证至少1年有效；方法2：也可以只加入一半体积的双蒸水，再用一半体积的甘油补足，置于-20℃保存，这样抗体不会冻，有利于抗体的稳定。后续试验时，再使用对应的缓冲液稀释成工作液，即用即配。我们的抗体（冻干粉），在常温放置下，至少一个月有效；若在-20℃下保存（推荐），至少三年有效。抗体修复方式：方法1：沸水浴修复，将盛有修复液和玻片的烧杯置于沸水浴环境，保持外部沸腾状态15min，自然冷却至室温；方法2：微波修复，将盛有修复液和玻片的烧杯置于微波炉中，高火5min，停火3min，中火5min，自然冷却至室温。酶标抗体效价测定程序：各种HRP酶标记成抗体的效价测定程序如下（如：羊抗鼠IgG-HRP的效价测定）：1、抗原包板：15ug/ml 小鼠IgG-pH9.6&CB液 0.1ml/孔；2、37&C包被60min或4&C过；3、PBST洗板3次，5min/次；4、加入倍比稀释的HRP标记抗体 0.1ml/孔；5、37&C 30min；6、PBST洗板5min/次&3；7、底物液0.1ml/孔 37&C 5-10min；8、终止液：2N H2SO4 0.05ml/孔；9、450nm 测定OD值；10、阳性OD值比对照值大3倍，为判断效价稀释度。&的溶解与保存：多肽有着很多特性，关于一些特殊肽您需要的有关信息可与博奥森公司的技术人员联系。当然首先建议您用少量肽来试验最适合的溶解方法，当多肽完全溶解后，才能加缓冲液（注意：应将多肽加入到适当溶剂中搅拌）。一、冻干多肽的溶解1、多肽溶解的主要问题是二级结构的形成。虽然疏水肽链二级结构的形成更明显，但除最短的肽链外，此现象产生在几乎所有肽链,与极性无关。所以，溶解多肽的第一个原则是使用无菌蒸馏水或去离子水，当然无氧水最好。多肽溶液可能遇到细菌降解，为防止此情况的发生，应溶解在无菌的蒸馏水中或用0.45或0.2孔径的滤膜过滤除菌。含有Cys、Met、Trp的多肽很容易氧化，应溶于无氧的水中，无氧水可通过注入惰性气体（氮、氦、氩）减压除气得到；2、若多肽不溶于纯水，超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。注意:超声处理会引起溶液发热或多肽降解；3、若多肽含有多个碱性氨基酸，使用（1-10%）的乙酸水溶液：对于疏水性强的多肽，应使用50%的乙酸；4、若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用氨溶液（1-10%）或乙酸乙基吗啡或重碳酸盐等挥发性的碱性缓冲液溶解。pH值在层析前必须调整；5、异丙醇和乙腈能溶解中等大小的多肽。若肽要上柱，有机溶剂的量必须很少否则将严重影响停留时间；6、若多肽因含有Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala等芳香链而高度疏水、或为中性肽时，DMF或DMSO等膜变性剂的使用，有利于多肽的溶解：a.高浓度模变性剂通过破坏多肽的二级结构而助溶；b.膜变性剂适于多肽分析液的制备，但可能会对其生物活性的研究工作造成干扰；c.DMF是变性剂（最高浓度可达30%），滴加至多肽溶解；d.反相层析法时，DMF将与洗脱液前锋一起流出，根据入量的多少，峰值可能很高。大多数肽能在大量DMF流出后几分钟内流出，若肽链很小，洗脱太早，多肽的量将很低。二、冻干多肽的保存标有&冻干保存&说明的多肽应该保存在冰冻条件下，以-20℃以下，其活性可保持多年。当使用干冻产品时，开盖前其容器应在装有新鲜干燥箱内升至室温。-20℃的产品，此过程需要一小时或更长，随保装而定。否则，当容器打开，水气进入导致凝缩而降低稳定性。一旦打开，应迅速称量完毕，立即封闭以免潮解，亲水肽更应注意。三、溶解多肽的保存多肽溶液比干粉的稳定性差很多，为了获得较好的效果，遵循以下原则：1、分成小包装避免反复冻融。使用多少解冻多少；2、溶于pH5-7无菌的缓冲液中，-20℃储存；3、由于细菌能降解多肽，储存前应过滤细菌；4、包含Cys、Met、Try、Glu、Asp的多肽易于氧化，因此应保存在无氧化剂的环境中。我公司免费提供抗血清亲合层析纯化服务，得到目的蛋白的抗体IgG。我公司还免费提供真空冷冻抽干服务，得到冻干粉状的抗体IgG产品，以便产品的使用及长期保存。anti-His tag抗体,聚组氨酸抗体标签抗体制备要求/时间/流程制备要求：客户需提供制备抗体的相关蛋白的英文名称的全称，也可同时提供该蛋白的全序列或氨基酸（多肽片断）序列，供参考(不要求) 制备时间：2.5-3个月左右制备流程：签订制备合同&&付首付款&&制备抗体&&付清全款&&免费将抗体寄给客户抗体制备抗体产量：1、20ml兔多克隆抗体血清原液（小鼠为5ml腹水）2、经亲和层析纯化抗体IgG 10mg3、多肽抗原3mg（用于客户自行检测抗体使用）抗体效价：1：8000以上（ELISA）说 明 书：提供抗体制备报告及抗体使用说明书抗原要求：若客户提供通过基因工程表达的抗原，则要求：抗原纯度85%以上，分子量大于10KDa，抗原量12-13mg产品包装：免费真空冷冻抽干，最终为您提供易于保存的冻干粉产品特殊说明：特殊抗体的制备，价格另议anti-His tag抗体,聚组氨酸抗体标签抗体RS-3294R&& &Phospho-Mst1(Thr183) + Mst2(Thr180)抗体,磷酸化蛋白激酶MST抗体RS-3293R&& &Phospho-Mre11 (Ser676)抗体,磷酸化DNA损伤关键蛋白Mre11抗体RS-3277R&& &Phospho-MKK7 (Ser271 + Thr275)抗体,磷酸化丝裂原活化蛋白激酶MKK7抗体RS-3276R&& &Phospho-MEK6 (Ser202)抗体,磷酸化丝裂原活化蛋白激酶MKK6抗体RS-3257R&& &Phospho-Lyn (Tyr397)抗体,磷酸化膜相关蛋白酪氨酸激酶Lyn抗体RS-3256R&& &Phospho-Lyn (Tyr507)抗体,磷酸化膜相关蛋白酪氨酸激酶Lyn抗体RS-3255R&& &Phospho-Lck (Tyr505)抗体,磷酸化淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抗体RS-3254R&& &Phospho-Lamin A + C(Ser22)抗体,磷酸化核纤层蛋白A/C抗体RS-3253R&& &Phospho-LRP6 (Ser1490)抗体,磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白6抗体RS-3250R&& &Phospho-LKB1(Thr189)抗体,磷酸化丝
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&GE品牌组氨酸标签蛋白纯化HIS标签蛋白纯化
在生命科学领域，上海金畔生物为业界提供了丰富的实验室和生物(/)生产研发的(/invest/)。庆祝上海金畔生物正式成为GE品牌组氨酸标签蛋白纯化HIS标签蛋白纯化的签约(/invest/)商，在这里要感谢广大客户多年来对上海金畔生物科技有限(/company/)的支持和厚爱，我们将一如既往的为广大客户带来GE品牌组氨酸标签蛋白纯化HIS标签蛋白纯化高品质的产品和服务，欢迎广大新老客户来电(/)。
&GE Healthcare Life Sciences为原核和真核系统表达的组氨酸标签蛋白纯化提供了种类繁多的产品。现有提供8种层析填料（树脂）-Ni Sepharose& High Performance (HP)、Ni Sepharose 6 Fast Flow (FF)、His Mag Sepharose Ni，它们预螯合镍离子，TALON& Superflow&（预螯合钴离子）、Ni Sepharose excel、His Mag Sepharose excel（预螯合有结合非常牢固的镍离子），以及未螯合金属离子的IMAC Sepharose HP和 IMAC Sepharose 6 FF。为了方便使用，这些填料现提供一系列预装规格。
用于组氨酸标签蛋白纯化的GE Healthcare产品具有以下优点：
&未螯合或预螯合镍/钴填料的灵活选择
&高蛋白质结合能力，低的镍或钴离子脱落
&产品范围涵盖了来自原核和真核表达系统的标签蛋白的纯化
&不同的规格可以进行筛选、捕获纯化和放大。
● 不同的规格可以进行筛选、捕获纯化和放大
高载量的Ni Sepharose产品
Ni Sepharose High Performance (HP)、Fast Flow (FF)和His Mag S epharose Ni为了方便使用预螯合有Ni2+。
●高结合能力
●较低的Ni2+
●脱落在多次循环中具有高度重复性的可靠捕获。
从真核细胞培养上清中纯化组氨酸标签蛋白的Ni Sepharose excel
Ni Sepharose excel是一种新型IMAC填料，预螯合有结合非常牢固的镍离子。
●主要设计用于分泌到真核细胞培养液上清中的组氨酸标记蛋白的捕获和纯化，例如昆虫细胞或CHO细胞。
●也适用于能够导致镍脱落的其他样品中组氨酸标签蛋白的纯化。
高分辨率的TALON Superflow（基于钴离子）产品
TALON Superflow是一种基于钴离子IMAC填料，在螯合镍离子的填料之外提供了另一种选择。
●当目标蛋白的纯度比收率更重要时，它是首选的预螯合填料。
●TALON Superflow以更强的选择性结合具有多组氨酸标签的蛋白，并且对宿主蛋白显示更低的亲和力，从而提供更低的背景。
●它适合在天然或变性条件下纯化蛋白，样品、洗涤和洗脱缓冲液中使用的咪唑浓度一般低于镍离子填料所使用的浓度。
未螯合金属离子的IMAC Sepharose产品
固定化金属离子亲和层析(IMAC)利用螯合的Co2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+和Fe3+离子与含有组氨酸的蛋白质形成复合物。螯合有适当离子的填料可以选择性的吸附组氨酸残基暴露的蛋白质。具有暴露半胱氨酸和色氨酸残基的蛋白也能结合到IMAC填料上，但结合能力要比组氨酸残基蛋白弱很多。
GST标签蛋白的制备和(/sell/76/)
GE Healthcare为重组的GST标签蛋白的纯化提供三种不同的层析填料-Glutathione Sepharose High Perfomance (HP)、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (FF)和Glutathone Sepharose 4B。
Glutathione Sepharose填料具有下列优点：
●温和的、非变性的洗脱条件最大程度保留蛋白抗原性和功能
●一步纯化中获得高纯度
用于蛋白质表达和检测的产品低至6折
用于抗体和抗体片断纯化的产品
抗体亲和纯化的基础是Protein G和Protein A对于各个物种IgG的Fc区的高度亲和力和特异性。Protein G和Protein A被固定在不同的基质上，使用这种填料可以很好的从腹水、细胞培养液上清和血清中分离IgG和IgG亚型。
●GE Healthcare提供的Protein G为大肠杆菌重组表达，天然Protein G上的白蛋白结合区域被去除掉。这种重组Protein G配体被偶联到Sepharose 4 Fast Flow和Sepharose High Performance上。Protein G是实验室规模抗体纯化的首选，这是由于其对真核生物来源的IgG及IgG亚型结合范围更宽。
●天然protein A (nProtein A)也可偶联到Sepharose 4 Fast Flow和Sepharose High Performance上，同时也提供基于Sepharose Fast Flow，偶联有重组Protein A (rProtein A)的纯化填料。MabSelect填料家族也使用重组Protein A突变体作为配体。
●Capto L 是用于抗体和抗体片段提纯的一种亲和色谱分离介质（树脂）。它结合了刚性的高流速琼脂糖基质与重组蛋白L配体，这种配体对于抗体K轻链（Kappa light chain）上的可变区有很强的亲合力。因此，Capto L适用于提纯大范围的抗体片段，例如Fab、单链可变片段（scFv）和结构域抗体（Dabs）。
& &&上海金畔生物科技有限公司（）提供生命科学研究领域系列产品，包括色谱(/sell/20/)、生化(/sell/21/)、诊断试剂、实验(/sell/78/)和(/sell/23/)。Laysan&bio、Avanti、NANOCS品牌的修饰性PEG（修饰性聚乙二醇）、WAKO品牌的表面张力测试剂、WAKO品牌的日立氨基酸(/sell/76/)仪配套试剂-缓冲液、显色液、Lumiprobe品牌的标记分子氨基活性染料。免疫诊断试剂包括Roche、TOYOBO、NEB品牌的酶、Abcam、CST、Santa Cruz品牌的单克隆抗体、多克隆抗体以及BD Pharmingen的流式抗体，R&D和Biovison品牌的ELisa试剂盒、MP bio品牌的DNA提取试剂盒等多种产品和Amersco品牌（55折）。标准品包括Sigma试剂（8折）美国APSC品牌分子质量测量高分子量标准品、德国DR和TRC以及(/article/3/)USP、EP、中检所品牌标准品、Reagecon品牌的离子和各种金属标准品、(/sell/24/)和仪器包括NUSSUI、BD difco（85折）、OXIOD品牌的培养基、whatman、Millipore品牌的各种滤膜、滤器和柱子填料等、Reseach diets品牌的动物饲料、Labnet、康宁Coring、Axygen、Falcon 、Eppendorf品牌的离心机离心管、移液枪及枪头等实验室常用仪器耗材。&
如果您对上述产品感兴趣，请致电或QQ：，上海金畔生物科技有限公司进一步了解详情。
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上海市浦东新区东靖路669弄38-101 &&邮编：201208
Sigma代理 &Abcam代理 &CST代理 &Santa Cruz代理 &Biolegend代理 ebioscience代理 &Invitrogen代理 &&millipore代理 &BD流式抗体代理 Laysan bio代理 &NANCOS代理 &Avanti代理 &wako代理 &lumiprobe代理 &&&NEB代理 Roche代理 Toyobo代理 &USP代理 &EP代理 &Dr代理 &TRC代理 &TCI代理 Megazyme代理 R&D代理 Biovison代理 Hampton代理 whatman代理 GE代理 康宁代理 Axygen代理 Falcon代理 &NISSUI日水代理 Himedia代理 OXOID代理 &BD培养基代理 Ludger代理 &Eppendorf代理 Labnet代理 &标准品代理 抗体代理 酶试剂代理 &培养基代理 耗材代理 Elisa试剂盒代理 。
风险防范建议：合作之前请先核验对方身份，如：传真营业执照等；涉及资金往来，建议均使用对公账户。药品资讯网保留删除上述展示信息的权利；我们欢迎您举报不实信息，共同建立诚信网上环境。His蛋白纯化原理、方法和问题分析-五星文库
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His蛋白纯化原理、方法和问题分析
导读：组氨酸(His)标签蛋白的纯化，His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，不带标签的蛋白纯化就非
组氨酸(His)标签蛋白的纯化
His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。
IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。 步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：
一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤：
大肠杆菌的破碎方法：
1） 收集培养发酵液，4度g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。)
2） 取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到
3） 把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种,总共四次,中间间隔要保持2分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在7-8,还是用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为1升,破碎三次,压力为800 bar.
4） 破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4度50000g离心30分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。
1.大肠杆菌的破碎离心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使终浓度为20mM，样品的总体积为10ml。
2.过柱子的样品最好过0.45μm的滤膜，避免堵柱。
3.可溶性蛋白的纯化：
1） 平衡缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含20mM咪唑。
2） 洗脱缓冲液：pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含500mM咪唑。
3） 取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清10ml样品以0.5ml/min上样，然后2ml/管分管收集。
4） 用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
5） 用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。
6） 再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭，以备下次使用。
7） 此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优化的办法是洗脱可以用50mM，100mM，300mM，500mM分阶段洗脱，各洗脱5个柱体积，这样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。
8） 收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度。
二、常见问题及解决方法
1.不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM巯基乙醇避免沉淀。
2.白不吸附：这是最常见的，通常的原因有：1是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，如果用脲变性吸附不好，可以改用盐酸胍，个人经验是这样通常可以使吸附不上的蛋白得到改善，顺利纯化。2可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。3样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。
3.难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱。
4. 电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近，
这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步0.5M pH5的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM巯基乙醇避免，如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。
三、影响IMAC纯化结果的因素
1.填料的种类：
不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
2.填料的配基种类、密度、金属离子种类
填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下IDA填料的亲和力要比NTA的强，所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料。
3.螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子，IDA的强于NTA。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时镍离子是最常用的，如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA琼脂糖凝胶.
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>> 蛋白质融合表达的标签及切割研究
蛋白质融合表达的标签及切割研究
来源：来源网络
蛋白质融合表达的标签及切割研究
摘要：随着蛋白质组学技术的迅猛发展，重组蛋白的使用在近年来大大增加。许多蛋白质、结构域或者肽类能与目标蛋白融合。利用融合蛋白的有助于目标蛋白的纯化和检测这个优点被广泛赞同。本文对多种融合标签及切割方法做了简单的概述。
引言 近年来,一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质.这些亲和标签系统具有以下特征:(a)一步的吸附纯化,(b)对三级结构和生物活性影响小,(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质,(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确,(e)适用于大量的不同蛋白质.有几种不同的策略用于大规模生产重组蛋白质.其中一种办法是使用很小的肽标签,这些标签不会与融合的蛋白质发生干扰.使用最为广泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚组氨酸-, S-, and Strep II-tag等. 对于某些应用,小标签无需去除.这些标签不像大标签具有免疫原性,经常可以直接作为抗原用于产生抗体. 小标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成.另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合蛋白.，它们的使用可以增加目标蛋白的溶解性.缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等,标签必须加以去除.一般来说,对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统.这取决于目标蛋白本身(如稳定性,疏水性),表达系统,纯化后蛋白的用途.
1．融合标签
融合标签的作用是用于检测和纯化目的蛋白，有时也用来增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。
阳离子交换树脂
在碱性pH&8.0 NaCl线性梯度0-400mM
Co2+-CMA (Talon) 150 mM 咪唑或低 pH
谷胱甘肽S-巯基转移酶
5-10mM 还原型谷胱甘肽
Strep-tag II
Strep-Tactin (修饰的链球菌抗生物素蛋白)
2.5 mM 脱硫生物素
RNaseA酶 的S片断
3M硫氰酸胍0.2M 柠檬酸pH 2,3M 氯化镁
HAT (天然组氨酸亲和标签)
Co2+-CMA (Talon)
150 mM 咪唑或低 pH
钙调蛋白结合肽
EGTA 或1 M NaCl中加 EGTA
纤维素结合结构域
1型:盐酸胍或者尿素大于4M 2/3型:乙二醇
SBP Streptavidin(链球菌抗生物素蛋白)
2 mM 生物素
壳聚糖结合结构域
内含子融合:30-50mM 二硫苏糖醇,β巯基乙醇,或半胱氨酸
麦芽糖结合蛋白
10mM 麦芽糖
Anti-FLAG单抗
pH 3.0 或 2–5 mM EDTA
1 .1多聚精氨酸-标签(Arg-tag) 精氨酸-标签通常由5或6个精氨酸组成.它已被成功用作细菌C末端标签,精氨酸是碱性最强的氨基酸,带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合.结合后,带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到.当C末端为疏水性区域时,多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构.氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除.这一酶促处理已被成功用于一些例子,但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制.然而精氨酸标签并不常用,与第二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具.
1．2 多聚组氨酸-标签(His-tag) 已广泛采用的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和标签的重组蛋白质.固定化金属螯合层析的基础是固定在基质上的过渡态金属离子(Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用.组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸,组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键.基质材料洗涤之后,可通过调节柱缓冲液的pH或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类。虽然在变性条件下系统对于带6个组氨酸标签的蛋白质纯化有效,带3个组氨酸标签的蛋白质在生理条件下可有效纯化.然而带6个组氨酸标签的蛋白质可以在天然条件下,在低或高浓度盐的缓冲液中结合到Ni2+-NTA 基质上.结合后,目标蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脱.低浓度的咪唑(如0.8 mM)可减少带有组氨酸的宿主蛋白质的非专一吸附.6个组氨酸标签的蛋白质可用20到250mM咪唑浓度范围洗脱. 使用咪唑的缺点是咪唑的存在经常导致蛋白质的聚集.另一种用于纯化多聚组氨酸标签蛋白质的材料是TALON.这由Co2+-羧甲基天冬氨酸(Co2+-CMA)组成,并偶联到固相的树脂上.TALON使得标签蛋白在温和条件下洗脱,已有报导与Ni2+-NTA树脂相比,其非特异性蛋白结合更少,从而达到更高的洗脱产物纯度.一种酶制剂通过SDS-PAGE鉴定的纯度高于95%.
1.3 谷胱甘肽S-转移酶-标签 1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的多肽的一步纯化.来自日本血吸虫(schistosoma japonicum),26-kDa的 GST被克隆在大肠杆菌表达载体中.融合蛋白可从未经处理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽亲和层析加以纯化.结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱..GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测.标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性.在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的.推荐采用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白切除GST标签.蛋白酶解后,GST载体和蛋白酶通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析去除.GST标签可位于N端或C端,可用于细菌,酵母,哺乳细胞, 和杆状病毒感染的昆虫细胞. GST融合蛋白已成为分子生物学家的基本工具.
1.4 Strep-标签(Strep-tag) Strep-标签是一氨基酸肽开发来用于在链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)柱上亲和纯化相应的融合蛋白.链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)在特定位点第44, 45, 和47位的突变体与天然形式相比,对八肽Strep-tag II的亲和力更强,.Strep标签的蛋白质在生理缓冲液条件下结合到生物素结合区域中,并可用生物素衍生物温和洗脱.洗脱时推荐使用2.5 mM脱硫生物素.基质可以用4-羟基-偶氮苯-2-羧酸再生,这种物质在溶液中呈黄色,当结合到基质上则呈红色.结合条件是非常专一的.生物素化的蛋白质如大肠杆菌的羧基载体蛋白可以结合,但生物素或者生物素化的蛋白质则用抗生物素封闭.纯化条件是多种多样的.螯合剂,温和性去污剂,还原型去污剂,和高达1M的盐可以加到缓冲液中. Strep-标签系统适合用于研究蛋白质之间的相互作用以及当那些大的标签或者带电荷的标签无效时的特殊用途.
1.5 S-标签 S-标签是个融合肽标签可以通过快速灵敏的均匀分析或者在Western blot中用比色法加以检测.该系统的基础是15个氨基酸残基的S-tag与103氨基酸残基的S-蛋白质之间的强烈相互作用,这两个都来自RNaseA.S-蛋白质/S-标签复合物的Kd接近0.1μM,这取决于pH,温度和离子强度.标签由4个带正电荷残基,3个负电荷残基,3个不带电的极性残基和5个非极性残基组成.这使S-标签保持可溶.S-标签的快速分析是基于核酸降解活力的恢复.标签蛋白可以结合到S蛋白质基质上.洗脱条件较苛刻,如pH2.0的缓冲液.然而为了获得有功能的蛋白质推荐用蛋白酶切割标签.该系统可用于纯化的重组蛋白质来源包括细菌,哺乳细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞抽提物.该系统经常与第二标签联用.RNase酶A高度灵敏的荧光底物的发现使得该系统可用于与高通量筛选联用的检测.
2. 融合蛋白的切割
为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。亲和标签的存在可能影响待研究蛋白的重要特性或功能.很早就已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使这个方法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶、Xa因子和烟草蚀刻病毒(TEV)等)通常被用来切割融合蛋白。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。蛋白的标签切割后不能降低蛋白质的活力. 另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。切割后蛋白酶的去除对于使用带亲和标签的重组蛋白酶或者生物素化的蛋白酶较为容易.生物素化的蛋白酶可通过Strep-tag/Strep-Tactin亲和层析直接加以纯化.
1．肠激酶由于专一识别5个氨基酸多肽(D-D-D-D-K-X1)并在赖氨酸的羧基上切割,是N末端融合通常选择的蛋白酶,在其他残基的不规则切割发生水平较低,这取决于蛋白质底物的构象(Choi et al.2001). 肠激酶轻链的分子量为26.3kDa. 一个单位定义为在23℃下切割50ug 融合蛋白在8小时内达到95%切割率所需的酶量.生化分析已经表明切割效率取决于D4K识别位点下游的X1 氨基酸残基.
2.TEV 蛋白酶是位点专一的蛋白酶,具有7个氨基酸残基的识别位点,序列为 E-XX-Y-X-Q-S, 切割在两个保守的谷氨酰胺和丝氨酸之间进行. X可以是各种氨基酸,但不是全部氨基酸都可行.最佳的切割序列为 E-N-L-Y-F-Q-S; .当TEV蛋白酶识别位点在两个结构域之间是结果最理想.当切割不理想时,插入增加结构灵活性的小连接肽可改善效率. 高专一性,多种底物的活力以及低温下的有效切割使TEV蛋白酶成为从融合蛋白移除标签的理想工具.
3.凝血酶是一种广泛用于切割标签的蛋白酶.切割可在20到37℃之间切割0.3到16小时.与肠激酶相反,Xa因子和凝血酶切割后,在目标蛋白C末端增加了两个氨基酸.凝血酶最佳的切割位点是X4-X3-P-R[K]-X1'-X2',这里X4 和 X3 是疏水氨基酸而X1'和 X2'是非酸性氨基酸.一些经常使用的识别位点是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和MY-P-R-G-N在X4-X3-P-R-G-X2'之间切割比在X4-X3-P-K-L-X2'更有效.其他识别位点是 X2-R[K]-X1', 这里X2 或者 X1'是甘氨酸.例如A-R-G和G-K-A,这里切割发生在第二个残基后.在凝血酶切割位点和N末端标签之间插入五个甘氨酸残基可改善切. 通过这一"甘氨酸连接肽"只需较少酶量就可达到完全切割,而且也可以避免可能发生的错误切割.有效的消化缓冲液是纯的Tris缓冲液,pH8.0.在缓冲液中存在的NaCl具有抑制作用.凝血酶可从切割产物中用p-氨基琼脂糖亲和纯化,或者superose-12 FPLC 柱凝胶过滤或者苯甲脒琼脂糖移去.
4.在标签和目标蛋白之间的Xa因子识别位点可作为有效的工具完全去除N末端的亲和标签.Xa因子在四氨基酸肽I-E[D]-G-RX1的羧基切割, 这里X1可以是除了精氨酸和脯氨酸以外的其他氨基酸.切割可以在4到25℃之间进行.绝大多数Xa因子的分子量大约43 kDa,由两个二硫键连接的多肽组成,一条27 kDa,一条 16 kDa.在 SDS-PAGE,还原的肽链具有30 kDa 和20 kDa的表观分子量. 通过位点专一的蛋白酶如Xa因子切除标签有时候是无效的,有Xa因子切割非专一的报导.原因可能是融合蛋白的不溶性或者变性剂的存在.可通过引入5个氨基酸的多聚甘氨酸区域来增加切割.丹磺酰氯-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-氯甲基酮在室温下1分钟内可使Xa因子活性不可逆失活95%.虽然由于切割需要更长的孵化时间而且效率较低而使Xa因子越来越少使用,但仍有使用Xa因子的成功报导。
裂解融合蛋白以除去fusion tag
IMPACT系统的推出是融合表达系统的一个重大突破。该系统最大的优点是表达的融合蛋白无需蛋白酶
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