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电转化法制备高转化效率的E．coli感受态细胞研究关注今日：1 | 主题：298004
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即送15丁当
【求助】电转化试验不成功，求高人指导
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这个帖子发布于3年零294天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
最近在做重组菌的试验，希望通过电转化的方法将~18kb的质粒导入JM109等细胞中。感受态细胞制作简要：OD600=0.3~0.4，超纯水2次5000g离心，10%甘油一次，甘油重悬直接放入-80℃保存简要操作：电击采用bio-rad的内置程序1.8kV，然后用-20℃解冻的Takara推荐的SOC培养基培养1h，涂板以前我用此方法能够长出来非常多的菌落，但近半个月一个都没有问题筛查：①解冻的JM109接种于LB、SOC中都能长②电转用的质粒采用CaCl2处理的DH5α的方法能在平板上长出~20个③电转化仪参数显示正常我不知道哪个地方除了问题，哪位大神能指导一下吗？
不知道邀请谁？试试他们
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做硕士论文的时候做过电转，刚开始我也是自己做感受态，但是尝试了很多次，转完都不长斑。后来买的商业化的电转感受态，一次就搞定了。所以，个人觉得感受态的效率是做电转最重要的因素。你在做电转之前最好先测一下你制备感受态的效率，最好在10此方以上。否则就不用往下做了。有条件，建议你买现在的电转感受态吧。另外，电转杯最好也买稍微好一点的。质量差的在点击时容易爆杯，如果爆了，你的所有工作就全废了。我个人觉得，就这两点。你参考一下吧。
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wyz06 最近在做重组菌的试验，希望通过电转化的方法将~18kb的质粒导入JM109等细胞中。感受态细胞制作简要：OD600=0.3~0.4，超纯水2次5000g离心，10%甘油一次，甘油重悬直接放入-80℃保存简要操作：电击采用bio-rad的内置程序1.8kV，然后用-20℃解冻的Takara推荐的SOC培养基培养1h，涂板以前我用此方法能够长出来非常多的菌落，但近半个月一个都没有问题筛查：①解冻的JM109接种于LB、SOC中都能长②电转用的质粒采用CaCl2处理的DH5α的方法能在平板上长出~20个③电转化仪参数显示正常我不知道哪个地方除了问题，哪位大神能指导一下吗？感受态细胞的质量很重要，建议制备新的感受态细胞试试
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我在第一次制备电转感受态细胞的时候，用已知提纯的质粒做出来的效果跟从Takara购买的感受态细胞差得不多（约少一半），后面一直是用同样的方法操作的。有一个可能的原因是最后感受态细胞的浓度较低，取出来放在4℃冰箱过夜之后沉淀下来的菌液（50ul/1.5ml离心管）占液面高度的2/3，不知道是不是10%甘油加多了。
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wyz06 我在第一次制备电转感受态细胞的时候，用已知提纯的质粒做出来的效果跟从Takara购买的感受态细胞差得不多（约少一半），后面一直是用同样的方法操作的。有一个可能的原因是最后感受态细胞的浓度较低，取出来放在4℃冰箱过夜之后沉淀下来的菌液（50ul/1.5ml离心管）占液面高度的2/3，不知道是不是10%甘油加多了。下次回复最好点一下“引用”，否则别人不知道有回复了。Takara自己的电转感受态本身就不咋样，你自己做的再比它差点，其结果可想而知。不是我打击你，自己想做出高效价的电转感受态不是那么容易的，不像一般做转化的感受态，自己随便做出来也能满足大多数实验要求了。为了实验，我还是建议你买国外进口的电转感受态吧。贵点，但的确好使。
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18K的质粒完全可以用化学感受态做，简单、方便
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breezemail 下次回复最好点一下“引用”，否则别人不知道有回复了。Takara自己的电转感受态本身就不咋样，你自己做的再比它差点，其结果可想而知。不是我打击你，自己想做出高效价的电转感受态不是那么容易的，不像一般做转化的感受态，自己随便做出来也能满足大多数实验要求了。为了实验，我还是建议你买国外进口的电转感受态吧。贵点，但的确好使。请问现在哪里可以购到invitrogen或者stratagene的电转感受态细胞。打电话问了，现在的手续都很麻烦，说是国家对大肠杆菌类严控，要购买要提交一堆的表格……请教有什么其它办法可以购得电转感受态细胞？谢谢
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问一下试剂公司,他们会有一定办法.
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dimocarpus 请问现在哪里可以购到invitrogen或者stratagene的电转感受态细胞。打电话问了，现在的手续都很麻烦，说是国家对大肠杆菌类严控，要购买要提交一堆的表格……请教有什么其它办法可以购得电转感受态细胞？谢谢哦，这是好几年前的事了。可能当时管的不是很严吧。我就是直接找invitrogen在国内的代理商订购的。他们也没让出具什么证明。可能现在审查很严格吧。不好意思，帮不到你了。
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breezemail 哦，这是好几年前的事了。可能当时管的不是很严吧。我就是直接找invitrogen在国内的代理商订购的。他们也没让出具什么证明。可能现在审查很严格吧。不好意思，帮不到你了。哦，谢谢。现在突然出了这个政策，麻烦大了……哪家公司都不卖了……
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dimocarpus 哦，谢谢。现在突然出了这个政策，麻烦大了……哪家公司都不卖了……我最近用天根的化学感受态细胞转18kb的质粒没问题，能满足自己研究的需要，如果你的片段不太大的话也可以试试。好久没登论坛了，抱歉。
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关于丁香园请问电转化感受态细胞最后一次洗涤为什么要用10%甘油洗？如果不冻存，最后的悬浮能不能直接使用超纯水而不用甘油？
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电转化最后一步加甘油洗涤的目的是感受态在-80℃冻存时起到保护作用。因为甘油在溶液中易结合水分子发生水合作用，弱化了水的结晶过程，减少冰晶形成，从而起到了保护效果。
如果感受态制备好直接转化时可以用不加甘油的缓冲液洗涤的。
做过化学感受态，没接触过电转化感受态。应该是为了冻存时候保护细胞。第二个问题应该是可以。
同样想知道答案，不知楼主是否已经得到解答！！
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red系统敲除用的感受态能放多久？同源臂太长会不会反而不好敲？
red重组系统中含有pkd46质粒的菌在加阿拉伯糖诱导后做成电转感受态，它在转线性片段之前能在-80冰箱里放多久呀？我敲的是大肠DH5a，同源臂搞了个两边各800bp的，结果转了2次，长了好多，结果就一个可能是我要的，是不是同源臂太长了的缘故？
原来如此，看来不能偷懒啊，原本因为dh5a和bl21(de3)都要敲，所以按照bl21弄了个长的同源臂，结果就弄不好了
娌℃湁锛岄暱寰楀ソ濂囨,鐢佃浆鍚庨暱浜嗘弧鏉,绋閲10000鍊嶅啀娑傛墠绋嶅井濂界偣
烦人的乱码，Bl21没敲成功，pkd46很难转进去，进去之后电转线性片段长得又很奇怪，每次都长成片，稀释了10000倍才有单菌落，都不知道是什么情况
我用长同源臂敲BL21的基因也是长了一大片，但是挑了20多个菌都没有正确的是怎么回事啊~你遇到过这种情况么~谢谢~
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扫描下载送金币感受态细胞转化效率低可能是什么原因呢(转化效率,感受态细胞,连接产物,毛病) - DNA技术 - 生物秀
标题: 感受态细胞转化效率低可能是什么原因呢(转化效率,感受态细胞,连接产物,毛病)
摘要: [感受态细胞转化效率低可能是什么原因呢(转化效率,感受态细胞,连接产物,毛病)] 如题 连接产物转不进去 空质粒的转化率也很低 做了好几批感受态了 可能是哪里出了毛病呢？ 关键词:[转化效率 感受态细胞 连接产物 毛病 感受态 空质粒]……
如题 连接产物转不进去 空质粒的转化率也很低 做了好几批感受态了 可能是哪里出了毛病呢？
回复是用化学法第二套方案做的感受态 能保存吗？如果保存的感受态不好 那么后来又制的转化效率也低..........郁闷中......回复是呀，转化试验是很容易做的，但是我也是转了两次，什么也没有长，怎么回事？
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