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纯化蛋白时如何确定洗脱用咪唑的浓度
各位大侠，我第一次做带His标签蛋白的纯化，在对目的蛋白进行洗脱时我使用以下咪唑浓度按照从低到高的顺序进行洗脱：10mm，50mm，100mm，150mm，200mm，250mm，300mm，350mm，400mm，450mm，500mm，洗脱液分别取20微升跑SDS-PAGE胶，结果如图所示，我后面再做这个蛋白的纯化时该如何选择洗脱用咪唑的浓度呢？请各位大侠指点！
10,50咪唑洗脱.jpg
100,150咪唑洗脱.jpg
200,250咪唑洗脱.jpg
300mM对于不同的蛋白都适用吗？
用葡聚糖G－25去咪唑如何操作，具体步骤？
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标题: 镍柱纯化的带his标签蛋白中的咪唑对蛋白活性有影响吗?
摘要: [镍柱纯化的带his标签蛋白中的咪唑对蛋白活性有影响吗?] 镍柱纯化的带his标签蛋白中的咪唑对蛋白活性有影响吗?可以直接用含咪唑的蛋白做细胞水平的活性测定吗?谢谢! 关键词:[咪唑 细胞水平]……
镍柱纯化的带his标签蛋白中的咪唑对蛋白活性有影响吗?可以直接用含咪唑的蛋白做细胞水平的活性测定吗?谢谢!
需要先脱除咪唑，用脱盐柱就可以
谢谢你的回复。脱盐柱？是超滤管吗？我使用过超滤管来透析纯化的蛋白，但效果不好，其它的杂蛋白浓缩了，但我的蛋白没有浓缩，而且我的蛋白极易降解，在4度放几天电泳检测就检测不到了，该怎么办？谢谢！
超滤和脱盐是不同的有多少杂蛋白呢？如果很多，那还没有纯化好。如果纯度达到要求，用超滤也可以除盐，快点操作，然后－80度保存蛋白就可以了
纯化后电泳检测效果不错，只有一条目的条带，杂蛋白很少，现在的问题就是我的蛋白极易降解，开始我用透析袋对PBS透析约24小时，就有白色的沉淀状物质析出，电泳检测量就极少，根本无法做细胞实验。这次纯化出来的蛋白纯度不错，但在4度放了约一周电泳检测只剩一条约30KD的条带（带his标签的目的蛋白为55KD），但这个大小与切割掉融合部分后的目的蛋白大小一直，难道融合蛋白会自动在蛋白酶切位点降解？我很迷惑！
4度放了约一周时间是太长了，透析除盐的过程也很耗时间，对蛋白活性和稳定性影响都很大用超滤和脱盐柱除咪唑时尽量快速纯化后收集的蛋白可加入15％甘油和甘露醇做稳定剂
谢谢您的回复，加了甘油做细胞实验还用去除吗？
我用20%的甘油，三天就降解了，SDS没有了。后来加到50%，-80冻存。能保存很久的。
你知道为什么透析的时候你的蛋白液会有沉淀出现吗？还有你做的蛋白等电点是多少？
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蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
我的蛋白70多KD，上清表达，表达量还可以，在C端加了6His标签，用生工的Ni柱填料挂柱纯化，洗脱后，洗脱液中无目的蛋白，只有杂蛋白，目的蛋白在流穿液当中，说明没挂上，（平衡缓冲液pH8.0，蛋白的等电点4.6左右，上样流速尝试过0.4和0.5ml/min），由于没挂上，打算用切非变性胶的方式纯化，来做后续实验，但将切下的胶电透浓缩后，跑SDS-PAGE分析，有很多杂带，目的条带的量也少，与杂带量差不多，在切的过程中，有时候还切不到自己的目的蛋白，怎么办呀，我已经就纯化蛋白这个问题做了很久了，还没啥进展，希望各位有经验的亲给我一些建议，谢谢谢谢........无数个谢谢。
你可以把你的蛋白做个50kd蛋白得超滤后，用8&&mol尿素变性，在过镍柱试试。
谢谢你的建议，不过换其他tag，我的需要从合成引物开始，因为之前由于考虑到其他实验，所以我引物的酶切位点和其他载体不兼容，所以这个方法可能留在最后尝试了
左边是Marker,中间是空载，右边粗的那条带是表达的蛋白，从图上看说明是表达了的，挂柱的图当时由于想着没挂上，就忘拍了，所以图就不能上传了
你说的那个NaCl&&可能我没表达清楚哈
蛋白有盐溶盐析作用，一定浓度的NaCl可以增加蛋白的可溶度，减少蛋白与蛋白之间的非特异性相互作用，只有浓度很高的时候才会促使蛋白沉淀
如果Tris应该只有盐酸调PH，你说盐酸和NaCl调ph没看太懂，一般过镍柱加300~500mM NaCl比较合适
如果解决不了，看你实验室配置吧 不行就用离子交换先纯化下，然后过个分子筛看你蛋白natural 状态下分子量是多少就知道有没有聚合了
关于你说的非变性胶电透回收，想了解下，跑sds-page你蛋白时你蛋白是没有了 还是变成其它的小分子量的蛋白了呢？
nemo88同学说的有道理，楼主可以参考一下。
首先，用histag蛋白阳性对照确认你的ni柱work。
然后，在buffer中添加变性剂如尿素（可先试一下高浓度尿素以确认确实work），打开蛋白质内部可能包裹的histag。（注：如果histag被包裹在蛋白立体结构内部而无法与ni接触，尿素可以破坏氢键从而暴露内部结构）
最后，还不行的话，用histag抗体做个western，看看你SDS-PAGE胶上的条带中是否存在带histag的蛋白。
祝你好运！
我打错了，是用HCl调，不小心加多了，就用NaoH调，跑SDS-PAGE之后有我的目的蛋白，也有6条其他小分子量的杂蛋白
谢谢，但有一个问题，就是我想获得的蛋白尽量维持天然的结构，用尿素变性之后还能复性到原来的结构吗
额& &为嘛用氢氧化钠？调过了？^_^
有么有试过电透回收后的蛋白放几天再制备次样品，跑个sds-page同时点上前几天的样品做对照& &看看目的蛋白有没有变少、、、
呵呵，是调过了，没有试过放几天再跑，因为回收后的蛋白量很少，放几天的话，很可能降解得看不到了，所以没做
所以你觉着你的蛋白会降解了？那最好还是确定过柱时是否发生了降解，掉了histag
我重新挂了一次柱，改变了一样上样方法，就是把样和填料结合了8个小时，再放出来，再用流穿液继续上样，但出现很奇怪的结果，左边是上样前（粗的那条是目的条带），中间是流穿液第1次和第2次的，最右边直接用500mM咪唑洗脱的，洗脱液中，目的条带上面居然多出一条带，我用的填料是新的，一次也没用过。
离子交换我们实验室都没做过，所以不知道怎么做
N端和C端都有功能区，C端离功能区远点，所以在C端设计的，弱弱地问一句，怎么在His之前加6个Gly，用的histag是载体本身自带的
依次点突变环P,很快就OK了。
或者看在引物里面加对应密码子
这个方法感觉好高大上啊，我不会做，我们实验室有做点突变的，但往往突变的都不是自己希望突变的那个，所以这个依次点突变对我而已无从下手，咋做的哟？但也很感谢你给我的建议
有his标签的蛋白不一定亲和就能成功，可能与蛋白本身有关。离交换很好操作，你的蛋白等电点4点几，溶液ph为8，那么此时蛋白带负电荷，选择阴离子交换，目标蛋白结合在填料上，用高盐进行洗脱。具体操作可以参GE公司的离子交换操作手册。如果你没有我可以发给你。
看来是确实不挂柱子，要想找原因，一个是确定基因序列没有移码确定表达成了his还是表达成了别的氨基酸，另一个就是westrn检测histag是否还在
或者就像前面朋友说的多加点尿素，直接变性，先不用担心复性的问题，先把这个问题解决，复性是有方法的只是可能要摸索下
咪唑直接洗脱多了一条带这个也不好说是多出来的，因为亲和柱属于富集型的柱子，举个栗子，有个蛋白浓度比较低，在你样品中量被稀释了跑电泳可能看不清，但是全部挂到柱子上，那洗脱的时候就相当于被浓缩到你的洗脱液里面，跑电泳就可能看出来了&&这也是有可能的
这个是我以前做的&&左1是破碎完样品 左二离心过滤后样品&&左三流穿 然后是洗脱的&&想说明有些条带变浓是正常的&&
如果被这个问题整的烦，有离子交换的 可以尝试离子交换
从引物上面加
:DMarker跑的很漂亮，赞一个。
谢谢您的回复，目前我的问题已经解决了，谢谢大家的关注
没事 解决就好啦~
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拟南芥SPX1蛋白原核表达及纯化分析
胡涛, 安艳, 吕群丹, 徐英武. 2015
拟南芥SPX1蛋白原核表达及纯化分析
Hu Tao, An Yan, Lü Qundan, Xu Yingwu. 2015
Prokaryotic Expression and Purification of AtSPX1 Protein in Arabidopsis thaliana
胡涛, 安艳, 吕群丹, 徐英武. 拟南芥SPX1蛋白原核表达及纯化分析[J]. 生物技术通报, ):88-93
Hu Tao, An Yan, Lü Qundan, Xu Yingwu. Prokaryotic Expression and Purification of AtSPX1 Protein in Arabidopsis thaliana[J]. Biotechnology Bulletin, ):88-93
拟南芥SPX1蛋白原核表达及纯化分析
胡涛1, 安艳1, 吕群丹2,徐英武1&&&&
1. 浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,临安 311300;2. 浙江大学生命科学学院,杭州 310058
基金项目:国家自然科学基金项目(),浙江农林大学科研发展基金项目()
作者简介:胡涛,男,硕士研究生,研究方向:生物物理;E-mail:
通讯作者:徐英武,男,博士,教授,研究方向:生物物理学;E-mail:yxu@
摘要:包含SPX结构域的蛋白在高等真核生物中广泛存在,这类蛋白的功能多数还不太清晰,但发现有些与磷信号相关,有些与铁信号相关。拟南芥中含有SPX结构域的蛋白可分为4个家族,本研究中的拟南芥SPX1(AtSPX1)属于一个只含有SPX结构域的蛋白组成的家族,其它家族成员还包含额外的基因序列。进化树分析表明,AtSPX1编码的氨基酸序列与双子叶植物具有较高的一致性,与单子叶植物进化距离较远。为了揭示AtSPX1蛋白的结构形态与其生物学功能之间的联系,开展了AtSPX1蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核体外表达载体,在大肠杆菌(E.coli)细胞中获得了该蛋白可溶性高表达。表达的蛋白包含有His标签方便了蛋白纯化,插入的SUMO融合蛋白标签可以通过蛋白酶切除,而目标蛋白通过硫酸铵沉淀实现了纯化。进一步分子筛层析分析表明AtSPX1以单体形式存在。实验结果提供了一套表达纯化AtSPX1蛋白的有效方案。
SPX 结构域&&&&
原核表达&&&&
蛋白纯化&&&&
拟南芥&&&&
Prokaryotic Expression and Purification of AtSPX1 Protein in Arabidopsis thaliana
Hu Tao1, An Yan1, Lü Qundan2,Xu Yingwu1 &&&&
1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin'an 311300;2. College of Life Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058
Abstract:The proteins containing SPX domain exist widely in eukaryotes,and the functions of this kind of proteins are not clear yet,however some of them are involved in phosphorus signaling and some in iron signaling.SPX proteins in Arabidopsis thaliana can be divided into 4 families.AtSPX1 used in this paper belongs to the family containing only SPX domain,while other 3 families containing extra gene sequences.Phylogenetic analysis showed that amino acid encoded by AtSPX1 was close with dicots in sequence,but distant from monocots.In order to reveal the relationship between structural property and biological function,we carried out solubility expression experiments of the proteins in vitro,constructed prokaryotic expression vector in vitro,and had the high soluble expression of the protein in Escherichia coli's cells.The expressed His-tag proteins allowed the purification more convenient,i.e,the inserted SUMO fusion protein tag could be digested by protease,and the target protein could be purified by ammonium sulfate precipitation.The further purification was completed using size exclusion chromatographic column,which yielded a profile corresponding to a monomeric AtSPX1 in solution.This work provided a strategy for the purification of AtSPX1 protein.
Key words:
SPX domain&&&&
prokaryotic expression&&&&
protein purification&&&&
Arabidopsis thaliana&&&&
SPX结构域是由最早发现的3个蛋白名称的首个字母缩写来命名的,这3个蛋白分别是酵母的SYGI[]和Pho81[]以及人类的XPRI[],它们的氨基端都含有一个相对保守共同结构域。目前在动物和植物以及很多高等真核生物中都发现了含SPX保守结构域的蛋白,根据所含结构域差异的分类,拟南芥和水稻基因组中所有编码含SPX结构域蛋白可以分成4个基因家族:SPX家族、SPX-RING家族、SPX-MFS家族及SPX-EXS家族[, ]。
酵母体内存在着一个被称为PHO体系的磷反应通路,该通路多个成员含有SPX结构域。在磷饥饿胁迫下的转录调控机制中,PHO通路研究最为详细,研究表明,植物缺磷时会产生类似于酵母PHO操纵子的多基因协同表达,组成一个高度协作的分子网络来适应磷胁迫[, , ]。植物中许多含有SPX结构域的基因参与对缺磷胁迫的反应,一些基因参与植物特异的磷高效吸收和利用机制,而其它基因则参与调控缺磷诱导的多基因表达[, , , , ]。植物中对磷饥饿响应的许多基因都已被克隆,如AtSPX1、AtSPX3,并对其表达调控做了深入研究[, , ]。在植物的根、叶、茎中存在着SPX蛋白家庭成员大量的表达[]。MYB家族的转录因子PHR2是植物磷信号通路中心因子,研究表明在水稻中SPX4蛋白作为PHR2的负调控因子参与了植物磷信号转导和磷平衡[]。在拟南芥和水稻中,SPX1蛋白具有同样的负调控PHR2的功能[, , , ],同时SPX1与SPX4蛋白均通过与PHR2蛋白结合抑制PHR2的功能[, , ]。
综上所述,SPX在植物磷信号通路中发挥了重要功能,但是SPX蛋白如何与PHR2结合并抑制后者的功能还未阐明清楚。对蛋白结构进行研究有助于阐明其中原因。本研究尝试通过克隆拟南芥AtSPX1基因,在原核细胞内过量表达AtSPX1蛋白,使用亲和层析和分子筛层析技术进行蛋白纯化,旨在为进一步解析SPX1的蛋白结构奠定基础。
1 材料与方法
哥伦比亚野生型拟南芥由浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地实验室栽培。E.coli DH5α感受态细胞,E.coli表达菌株BL21(DE3)以及表达质粒pE-SUMO为本实验室保存;RNA提取试剂盒购自北京鼎国昌盛有限公司;反转录试剂盒、DNA聚合酶、各种DNA限制性内切酶购自宝生物工程有限公司(大连);DNA连接酶购自New England Biolabs公司;DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京);引物由生工生物工程股份有限公司(上海)合成;其余各试剂均为国产分析纯。
1.2.1 AtSPX1基因克隆
用Trizol法提取拟南芥叶片组织RNA,反转录得到cDNA。根据拟南芥SPX1基因的cDNA保守序列以及该蛋白的二级结构预测进行引物设计进行AtSPX1基因全长克隆,上游引物A:5'-CGGGATCCATGAAGTTTGGTAAGAGTCTC AG-3'和下游引物B:5'-CCGCTCGAGCTATTTGGCT TCTTGCTCCAACA-3'(下划线为BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切位点),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。聚合酶链式反应得到的产物连接到pMD-18T并转化到E.coli DH5α感受态细胞,经过菌检和双酶切实验后进行测序。将测序正确的菌株扩大提取质粒后,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒和pESUMO、pET-HTT和pET-GTT载体,切胶回收目的片段。回收产物连接到含有同样黏性末端载体上,连接反应在16℃过夜。反应混合物转化到DH5α感受态细胞并涂布于抗性的LB平板上,挑菌培养后菌液PCR检测,并将检测正确的菌液进行测序,由此克隆得到了pE-SUMO-AtSPX1、pET-HTT-AtSPX1和pET-GTT-AtSPX1重组质粒。
1.2.2 AtSPX1理化性质分析
用DNASTAR5.0软件分析cDNA序列和开放阅读框;利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expert Protein Analysis System,ExPASy)提供的生物信息学工具Protparam,分析预测蛋白质的氨基酸残基性质、分子量及理论等电点。采用Signal IP 3.0 Server分析信号肽序列。
1.2.3 AtSPX1的原核表达
重组表达质粒分别转化表达菌株RosettaTM (DE3)和BL21(DE3),从抗氨苄霉素和卡那霉素平板上挑取单克隆,接入2 mL LB液体培养基37℃培养,当菌体OD600达到0.6时,其中一部分加入0.3 mmol/L IPTG诱导,在37℃摇床上诱导5 h,收集菌体。另一部分加入0.3 mmol/L IPTG诱导,在20℃摇床上诱导14 h,收集菌体。超声(工作5 s间歇6 s,总时间1 min,功率20%)破碎,SDS-PAGE检测蛋白表达及可溶性情况。
1.2.4 重组AtSPX1蛋白的纯化与SUMO标签酶切
8 000×g离心收集诱导后的1 L菌液细胞,加入20 mL裂解液(1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tirs-HCl pH 8.0,10% glycerol)冰水下功率为200 W,工作6 s间歇8 s超声20 min,静置15 min后,在4℃条件下转速17 000 r/min离心35 min。收集上清液,将上清液加入已经平衡好的Ni-NTA柱,放入冰浴摇床缓慢摇动结合30 min后,将纯化柱置于支架上,收集未特异性结合琼脂糖树脂上的杂蛋白液,用20个柱体积Wash Buffer (1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,10% glycerol,100 mmol/L Imidazole)洗脱非特异性结合的杂蛋白,最后用15倍树脂体积的Elution Buffer (1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,10% glycerol,250 mmol/L Imidazole)收集目的蛋白。向蛋白洗脱液中加入ULP1蛋白酶,低温4℃酶切过夜。
1.2.5 硫酸铵沉淀纯化AtSPX1蛋白
将上述酶切反应液用超滤浓缩柱进行浓缩,在目的蛋白的浓度达到0.3 mg/mL时,测量浓缩液体积并查表确定硫酸铵的用量。将硫酸铵分4次加入浓缩液中,每次加入硫酸铵后都轻微摇晃离心管,最后将离心管冰上静置10 min,12 000 r/min离心5 min后弃上清,加入3 mL裂解液(1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tirs-HCl pH8.0,10% glycerol)将离心管底部沉淀悬浮。
1.2.6 分子筛层析分析目的蛋白与质谱鉴定
将硫酸铵沉淀法所获的目的蛋白悬浮液用超滤浓缩柱进行浓缩,4 000×g离心浓缩至500 μL体积后上样,使用分子筛SuperdexTM 12 10/300 GL分离纯化目的蛋白,以缓冲液(1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tirs-HCl pH 8.0)0.5 mL/min流速分离纯化目的蛋白,取10 μL fraction蛋白样品加入2 μL蛋白上样缓冲液,煮沸10 min,点样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE),完成电泳后观察目的蛋白的纯化情况。将切取的目的蛋白SDS-PAGE胶点转入离心管中,样品质谱鉴定由上海博苑生物技术有限公司进行。
2.1 AtSPX1蛋白理化性质及信号肽预测
利用ProtParam工具预测表明AtSPX1蛋白的相对分子质量为30.07 kD,理论等电点(pI值)7.76,含酸性氨基酸(DE)16.4%,碱性氨基酸(KR)16.8%,亲水性氨基酸(AILFWV)、极性氨基酸(NCQSTY)和带电氨基酸(RKHYCDE)的比例分别为35.6%、22.6%和30.9%。根据在线网站Signal IP 3.0 Server分析AtSPX1蛋白,结果显示AtSPX1蛋白序列中预测到一个双向核定位信号,位于该蛋白序列的第30-46位氨基酸的位置。
2.2 pE-SUMO-AtSPX1原核表达载体的构建
测序验证表明成功构建重组AtSPX1质粒,转化成功的菌株提取质粒进行PCR鉴定(图 1-A)和双酶切(图 1-B)均得到目的片段,成功构建了pESUMO-AtSPX1原核表达载体。
图 1 AtSPX1基因PCR扩增结果(A)和pE-SUMOAtSPX1限制性酶切分析(B)
2.3 重组蛋白AtSPX1的表达检测
诱导温度、时间及载体对原核表达蛋白的可溶性有重要影响,高温条件下菌株快速表达目的蛋白容易使蛋白形成不正确的构象折叠最后以包涵体的形式存在,不利于获得可溶性蛋白。菌液浓度在OD600值0.4-0.6时,以37℃不加入IPTG培养5 h为对照组,以IPTG终浓度0.3 mmol/L的为诱导条件,分别在37℃,5 h和20℃,14 h的诱导条件下进行诱导培养。SDS电泳结果(图 2)显示,3种载体只有pE-SUMO-AtSPX1蛋白在20℃条件下上清有表达(图 2-C)。
图 2 分别含pET-HTT (A)、pET-GTT (B)和pE-SUMO (C)三种载体的AtSPX1融合蛋白的表达检测
2.4 Ni-NTA法纯化重组AtSPX1蛋白
不同咪唑梯度洗脱蛋白后的SDS-PAGE检测结果(图 3)显示,从第7号孔道可以看出,在高浓度咪唑(1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,10% glycerol,250 mmol/L Imidazole)条件下,可洗脱出条带单一目的蛋白。
图 3 SDS-PAGE检测AtSPX1 Ni-NTA亲和层析纯化
2.5 硫酸铵沉淀
在15 mL洗脱下的蛋白液中(1 mol/L NaCl,20 mmol/L Tirs-HCl pH 8.0,250 mmol/L Imidazole,10% glycerol),加入0.1%(W/W) ULP1蛋白酶,低温4℃酶切过夜,用硫酸铵沉淀的方法能够将靶标蛋白和标签分开(图 4)。生物信息学分析表明,AtSPX1蛋白N端存在一个17个氨基酸的双向核定位信号,这个片段在纯化过程中很容易降解掉,所以图 4中酶切过后出现两条带。
图 4 硫酸铵沉淀
2.6 分子筛层析分析
将硫酸铵沉淀法获得的蛋白用10 kD超滤浓缩柱浓缩至体积500 μL,通过AKTA Purifier,上样至凝胶过滤层析柱SuperoseTM 12 10/300 GL作进一步纯化。作为标准的牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(Ovalbumin)、木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain)大小分别为67、43和25 kD,对比作为标准的3种蛋白的洗脱体积和分子量关系可知[],目的蛋白峰位置所对应的分子量大小在卵清蛋白(43 kD)位置之后和木瓜凝乳蛋白酶(25 kD)之前(图 5-A),初步确定其为单体(30 kD),并且重组蛋白只出现明显的单峰,说明蛋白的均一性较好。分子筛层析后,分管收集的蛋白变性后用聚丙烯酰胺凝胶变性电泳检测,结果(图 5-B)显示蛋白分子量为30 kD,蛋白纯度较高。
图 5 AtSPX1的凝胶过滤层析图(A)及SDS检测(B)
2.7 MALDI-TOT/TOF质谱鉴定重组蛋白
对SDS-PAGE考马氏亮蓝染色后的目的蛋白进行MALDI-TOT/TOF质谱。上海博苑生物技术有限公司提供的检索结果显示(检索程序是Mascot:,数据库为NCBInr),目的蛋白为gi|,检测结果中有21条肽段与目的蛋白AtSPX1序列相匹配。图 6-A红色部分表示与目的蛋白所匹配的多肽片段,覆盖率超过60%。图 6-B是Mascot Score直方图,右边红色表示匹配的结果,得分为938分且有显著性差异(P＜0.05)。左边阴影区域为小片段相匹配的肽段,不具备显著性差异,为不可信任结果。
图 6 AtSEP3蛋白质肽质量指纹图谱鉴定(A)及Mascot Score直方图(B)
近年来,关于植物响应磷营养胁迫的生理生化机制和信号传导途径的研究已经有了较大的进展,研究显示一部分SPX蛋白参与了磷的吸收代谢过程。但也有研究结果表明,OsSPX1基因表达水平下降引起植物对冷胁迫的敏感性增强[, ]。AtSPX1基因和OsSPX1具有50.5%的相似性,表明AtSPX1和植物低温耐受性也可能有关。同时SPX结构域在多个物种间有着较高的保守性,说明了SPX结构域对这些蛋白所行使的功能是不可缺少的。目前亚细胞定位的结果显示了AtSPX1定位于细胞核中,这与生物信息学预测AtSPX1蛋白在氨基端含有一个17个氨基酸的双向核定位信号相一致。这个片段在纯化过程中容易被降解掉,也解释了硫酸铵沉淀后出现两条带的结果,两条带经过质谱实验测定都是AtSPX1蛋白。在目前的原核表达过程中,20℃诱导发现有可溶性AtSPX1蛋白表达,而37℃诱导可溶性表达则明显减少。进一步改变诱导温度、时间以及IPTG浓度,发现可溶性没有明显增加,同时改变蛋白表达宿主细胞也没有明显效果。这个问题计划在后期的实验中通过重新构建不含核定位信号的表达载体来解决,这有可能提高蛋白的产量。
分子筛实验表明纯化的AtSPX1蛋白是以单体形式存在,同时这个蛋白只包含一个SPX结构域,表明SPX结构域自身并不倾向于形成同型二聚体。拟南芥的SPX2、SPX3、SPX4与SPX1相似性分别是66%、47%和44%,它们都只包含一个长度大约为150个氨基酸的SPX结构域。这个分析暗示拟南芥同源SPX家族成员也可能是单体。但是不同SPX蛋白的SPX结构域长度明显不同,例如,水稻的OsSPX4的SPX结构域包含170个氨基酸,拟南芥11个PHO1蛋白都含有300-360个氨基酸不等的SPX结构域,不能排除这些蛋白形成多聚体的可能性。有实验表明,拟南芥的AtSPX1蛋白的功能与铁和磷营养有关联[],可能是这两种信号转导途径的交叉点之一,研究SPX结构域在其中的作用以及与它蛋白的互作是值得关注的方向。
本研究成功构建了拟南芥SPX1基因原核表达载体pE-SUMO-AtSPX1,在大肠杆菌(E.coli)细胞中获得了该蛋白可溶性高表达,经过亲和层析、硫酸铵沉淀、分子筛层析方法得到高纯度的AtSPX1蛋白,分子筛层析分析表明AtSPX1以单体形式存在。
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