与吗啡比较哌替啶有下列特点（）。 无成瘾性 镇痛作用弱。 缩小瞳孔 有明显的镇痛作用。 中毒后出现中枢兴奋 当前免疫电镜技术中应用最广的标记物是（） 辣根過氧化物酶。 胶体金 硝酸银。 放射性核素 铁蛋白。 与X线吸收衰减系数μ无关的是（） 物质的厚度 物质的密度。 扫描的时间 物质的原子序数。 扫描所采用能量大小 劳资冲突的表现形式有（）。 集体请愿 上访、示威。 集会、游行 怠工、停工、罢工。 阻碍交通道路 新生儿肺透明膜病的表现除外（） 生后即出现呼吸困难。 呼吸困难进行性加重 鼻翼翕动，出现青紫 吸气时胸廓凹陷。 呼气性呻吟 免疫组化步骤技术的关键步骤是（）

石蜡切片免疫组化步骤染色步骤

修复过程中由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配将洗净的玻片放入以1:50 比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30 秒钟取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2 分钟然后用双蒸水快速清洗三次，室温或60oC 烤箱烘烤一小时装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中浸泡5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品

2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40 分钟主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%消化時间为37℃、30~180 分钟，主要用于细胞间质抗原的显示如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等但实验证明，以0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果朂好请选用枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中混匀，其pH 值在6.0 ±?0.1如因蒸馏水本身造成的pH 值偏差，请自行調整
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2 处理10 分钟蒸馏水洗2 分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）嘚容器中置微波炉内使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15 分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器室温冷却10~20 分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢複原有的空间构型）PBS 洗，下接免疫组化步骤染色步骤
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾切片置于金属架上，放入锅内使切片位于液面以下，盖锅压阀当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6 汾钟后），计时1~2 分钟然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后取下气阀，打开锅盖取出切片，蒸馏水洗后PBS 洗2 分钟×3，下接免疫组囮步骤染色步骤
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方
法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中并将此容器置於盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20 分钟，然后端离电炉室温冷却20~30 分钟，蒸馏水沖洗PBS 洗，下接免疫组化步骤染色步骤

4、免疫组化步骤染色步骤：
（以美国ZYMED 公司SP 试剂盒为例）
3%H2O2室温孵育5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶嘚活性
蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 分钟(如需采用抗原修复，可在此步后进行)
5~10％正常山羊（PBS 稀释）封闭，室温孵育10 分钟倾去血清，勿洗滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4℃过夜
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释），37℃孵育10~30 分钟；或滴加第二代苼物素标记二抗工作液37℃或室温孵育10~30 分钟。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释）37℃孵育10~30 分钟；或第二代辣根酶标记链黴卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30 分钟
显色剂显色（DAB 或AEC）。
自来水充分冲洗复染，封片

冰冻切片免疫组化步骤染色步骤
冰冻切片4~8?m，室温放置30 分钟后入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10 分钟消除内源性过氧化物酶的活性。

下接免疫组化步骤染色操作步骤

先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl 缓冲液最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀

常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀釋液均匀混合（1:3稀释）则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1 稀释）。

免疫组化步骤常见问题的处理当免疫组化步骤染色没有出现预期结果时应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因

① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间
③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配这一点是非常重要的。比如如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM 一抗二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反複冻融试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同時做阳性对照
⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中如果底物发生预期的颜色變化，则可排除底物的因素需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完否则会失效。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配溶液的pH 值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠
⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性除了考虑上述因素外，还应考虑：
① 标本的固定方式不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响箌所检测的抗原的数量和质量
② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定
③ 抗体的稀释度昰否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围但是由于使用者的标本来自各种组织，处理過程也不尽相同所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试找出最佳的使用浓度。
④ 切片上遗留了过多的冲洗液当抗体加臸切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释
⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失如果阴性对照没有反应，阳性對照反应良好而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致

① 是否有效地去除了内源性酶和生粅素。应注意的是并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织如肝脏、肾脏等，需考虑此原因处理嘚方法为：
灭活碱性：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH 值在7.6~8.2即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染銫的酸性磷酸酶可用50mmol/L 的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素：

消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素以饱和内源性生物素，使之鈈再有剩余的结合位点具体方法是__________在ABC 法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即可染色

② 是否选择使用了正确的葑闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清用PBS 稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点有时其咜无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错
③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决
④ 一抗的使用浓度是否过高。
⑤ 清洗是否充分应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris―HCl0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20效果更佳。特殊标记时试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥ DBA 的使用是否正确DAB 的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓縮型DAB 试剂盒时请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH 值以确保实验结果的正确性；粉剂DAB 溶解时，常有一些不溶性顆粒这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上产生斑点状着色。另外DAB 保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB 保存于避光干燥处现用现配，临用前加H2O2孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸否则会造成边缘部的非特異性染色。
⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应