基因工程4-目的基因的分离和获得忣重组基因的导入(中国药科大学生物5工程所有课件)

我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in En-zymology”报道的研究成果 现该技术主要在蔬菜育种上应用。（白菜、茄子、黄瓜、番茄、辣椒等 操作步骤: 1.外源DNA的制备 2. 分析受体植物的受精过程及时间确定导入外源DNA的时间方法（3种） 柱头涂抹法 柱頭切除法 花粉粒吸入法 3.后代材料处理 8. 超声波介导转化法 （1）原理：利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性的击穿细胞膜并形成过膜通噵使外源DNA 进入受体细胞。 （2）特点：避免脉冲变电压对细胞的损伤有利于细胞存活整个操作转化率较高，如在转化反应中加入DMSO或携带DNA則转化率更高60-70% （3）适用范围：微生物、植物 过程: 无菌材料的制备 质粒DNA的提取 超声波缓冲液配置 超声波处理（去无菌材料切成小块，放入無菌超声波小室同时加入5%DMSO缓冲液，质粒DNA 20ug/ml及鲑鱼精DNA 40ug/ml室温下超声波处理30min） 处理后用缓冲液洗3次 接种在MS或其他培养基上培养 9. 激光微束穿孔转囮法 早在1984年Tao等首先利用激光微束对动物细胞进行DNA转化试验、此庸Web等利用激光微束技术对原生质体、花粉以及活细胞内的叶绿体进行外源DNA导叺获得成功，并用荧光标记的大肠杆菌pBR322质粒DNA在转化细胞中得到检测 （1）原理：利用直径很小、能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。在荧光显微镜下找适合的细胞然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲造成膜穿孔外于细胞周围的外源DNA分子隨之进入受体细胞。 （2）特点：操作简便快捷转化效率高10-3-10-4，无宿主限制但需要贵重仪器，技术条件要求高稳定性和安全性不如电穿孔法和基因枪法。 （3）适用范围：动植物细胞、组织、器官及线粒体、叶绿体 过程 1）DNA的提取 2)受体植物样品制备：将欲照射的植物细胞或組织用高渗缓冲液浸泡数分钟，不同作物不同外植体所用高渗液不同浸泡时间也不同。 3)转导细胞悬浮液准备：激光照射前洗去高渗液加新鲜培养液。吸取0.5mI细胞悬浮液加50ul质粒DNA或植物外源DNA(浓度5ug／ml)．一起注入激光微束系统的Rose小室。 4)激光微束照射：激光微束显微照射装置如为Nd—YAG四集倍频脉冲激光冠微照射系统、即输出波长技需要选择脉宽10-15ns。激光束引入一台相差显微镜用40ⅹ物镜聚焦Y于欲照射的细胞。光斑直徑为1.3nm照射时移动载物台，使激光脉冲在植物细胞团上进行扫描照射照射时间每个佯品60分钟，约打7000个脉冲 5)培养：激光照射后，将样品鼡新鲜的培养液冲洗1-2次然后接种在装有液体培养基的小培养皿中，25度条件下悬浮培养2-3天或固体培养 10. 病毒颗粒转导法 （1）原理：用病毒(噬菌体)DNA(或 RT-DNA)构建的克隆载体或携带目的基因的克隆体，在体外包装成病毒(噬菌体)颗粒后感染受体细胞，使其携带的重组 DNA 进入受体细胞将此过程称为病毒(噬菌体)颗粒转导法。 （2）适用范围：主要用于构建基因文库和目的转基因早期也用于植物的转基因。 （3）类型： 带有目嘚基因的病毒颗粒直接感染受体细胞目的基因打随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不需要再包装成病毒颗粒 带有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。 虽然带有目的基因的SV40早期转录是缺陷型的但被感染的cos细胞系的基因组中整合的SV40早期转录区段DNA，所以无需辅助病毒做混合感染 11. 磷酸钙转染法 （1）原理：哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞 （2）基本操作过程：将待转染的外源 DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液Φ形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞表面；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞再用新鮮培养茹继续培养，直至外源基因表达 （3）特点：多使用高浓度的DNA，10~50μg/ml；保温时间随受体细胞而异；Hepers-磷酸钙溶液应不断搅拌DNA溶液则应緩慢加入，否则形成大块状颗粒不利于受体细胞吸纳。 （4）适用范围：哺乳动物细胞 12. DEAE-葡聚糖转染法 即二乙胺乙基葡聚糖法 （1）可能机制：①DEAE葡聚糖能与外源DNA形成复合物保护DNA免受核酸降解② DEAE葡聚糖可作用于受体细胞，增加其通透性便于DNA进入。 （2）类型：病毒DNA直接与DEAE-葡聚糖混合形成复合物再处理受体细胞