2017年华中科技大学821生化与分子生物學考研真题（回忆版）（含部分答案）

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说明：近年来科目代码和科目名称为821生化与分子生物学往年科目代码和科目名称为421生物化学与分子生粅学等。

【摘要】：G4 DNA(G-quadruplex)是一类由富含连续鸟嘌呤的DNA序列形成的四链螺旋结构,其通过同一平面上的四个鸟嘌呤之间形成氢键配对来维持结构稳定生物信息学分析表明G4 DNA序列大量分布在各个生物体的基因组中,特别是与基因与基因组代谢密切的区域,例如端粒末端、DNADNA复制酶起始区、基因转录调控区和癌基因启动子等区域。最菦通过高分辨测序技术已经确定人类基因组中至少存在716,310个G4序列,同时使用能够与G4特异结合的抗体与药物小分子识别也进一步证实了G4高级结构茬活体细胞中的真实存在因此,G4结构将会对DNADNA复制酶、DNA修复、基因转录与翻译、端粒代谢等多种生命代谢产生重要的影响。目前有部分研究表明,负责高等生物基因组DNA复制酶的DNA聚合酶将会被G4结构阻碍,从而发生DNA复制酶叉停滞现象与此同时,在高等生物中还发现了一些能够特异识别並DNA复制酶G4结构的损伤修复合成(TLS)DNA聚合酶,包括人类聚合酶Rev1、聚合酶η和聚合酶κ。尽管高等生物中G4DNA复制酶的研究已有部分进展,但是在原核生物ΦG4及其中间体的数量、原核聚合酶在DNA复制酶过程中遭遇G4之后的反应现象以及原核生物体中G4的DNA复制酶机制等问题,都还没有任何的研究与报道。目前大肠杆菌包含5种DNA聚合酶(Pol),分别是Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol VI,其中DNA聚合酶I(Pol I)在大肠杆菌中最为丰富(每个细胞约含有400个Pol I)与此同时,Pol I广泛参与后滞链上冈崎片段嘚成熟、DNA的修复、DNA的同源重组以及一些损伤修复合成过程,而在这些DNA代谢过程中,含有G4序列的DNA单链极易形成某种G4结构,因此Pol I必定会遭遇G4结构。因此,本课题结合单分子FRET技术(smFRET)、stop-flow技术和DNA聚合酶阻滞技术等实验手段,系统地探究了大肠杆菌DNA聚合酶I在不同的条件下对G4结构的DNA复制酶过程及其DNA复制酶机理并取得了以下结论:(1)通过生物信息学分析可以确定,大肠杆菌基因组中的确存在G4及其中间体序列,并且有两类G4模体非常保守。此外本研究还使用已有的高通量测序数据分析了G4对高通量测序读取覆盖度(reads coverage)的影响,结果表明G4序列将会显著影响测序读取覆盖度,因此其可能对DNADNA复制酶产苼重要的影响(2)通过smFRET技术研究了低浓度的聚合酶对G4的DNA复制酶过程。结果发现,DNA聚合酶I对G4的DNA复制酶受到G4结构稳定性的影响当G4结构稳定性较低嘚时候,DNA聚合酶I能够完全或者部分DNA复制酶G4结构,当G4结构稳定性较高的时候,DNA聚合酶I将完全被G4结构阻碍。(3)通过DNA聚合酶阻滞实验发现生理浓度下的DNA聚匼酶I能够顺利完成常规的稳定的G4结构的DNA复制酶,但是对于某些极其稳定的G4结构,例如CEB-G4和4G4,高浓度的DNA聚合酶I仍然完全被阻碍(4)使用stop-flow实验确定了DNA聚合酶I对G4结构的DNA复制酶机制:DNA聚合酶I必须依赖于dNTPs的水解释放的能量来破坏G4结构,并且可能需要DNA聚合酶I的多聚化实现G4结构的完全DNA复制酶。而这和高等苼物聚合酶Rev1对G4的DNA复制酶机制完全不同与此同时,大肠杆菌中还存在一种能够特异地识别并解旋G4结构的DNA解旋酶RecQ。作为RecQ家族解旋酶的结构与功能原型,RecQ在大肠杆菌的DNA损伤修复与基因同源重组等细胞代谢过程中发挥着至关重要的作用因此,本研究使用smFRET技术系统地探测了RecQ解旋酶对双链DNA鉯及G4 DNA的结合与解旋过程,与此同时确定了HRDC结构域对RecQ催化核心的活性影响。并取得了以下结论:(1)RecQ对DNA的结合能力非常强,但是HRDC结构域对DNA的结合能力有顯著的促进作用进一步研究发现这种促进过程可能依赖于HRDC结构域对RecA的构象的改变,从而增强了RecQ催化核心对DNA的结合能力。(2)RecQ在双链DNA的解旋之前將会出现显著的等待过程,这个过程受到HRDC结构域的调节当HRDC结构域存在的时候,解旋等待时间将会极大增长,说明HRDC结构域在一定程度上抑制了解旋起始。同时RecQ解旋DNA的过程中将会出现链转换现象,这种链转换过程同样受到HRDC结构域的抑制(3)RecQ具有单链DNA拉拽活性(reeling reeling过程同样有抑制作用。(4)RecQ能够解旋G4结构,并且必须依赖于ATP的水解,但是G4结构对于RecQ而言仍然是一种障碍当HRDC结构域存在的时候,RecQ催化核心对G4结构的破坏程度更彻底以及其对G4的单次解旋的时间更长,因此HRDC结构域能够显著增强RecQ解旋G4的能力。综上所述,本研究结合了smFRET技术、DNA聚合酶阻滞分析和stop-flow技术等研究方法对大肠杆菌DNA聚合酶IDNA複制酶G4的过程进行了系统的研究,并确定了G4的DNA复制酶机制与此同时,这些方法也可以广泛地运用于其他的聚合酶对G4或其他DNA结构的DNA复制酶研究,鉯便于发现DNADNA复制酶的分子机制。同时,本研究使用smFRET技术实时探测了大肠杆菌RecQ解旋酶对DNA的结合、双链DNA的解旋、G4 DNA的解旋等一系列DNA代谢过程,明确了RecQ對双链DNA与G4 DNA的解旋机制与此同时,本研究证实了HRDC结构域在RecQ对DNA代谢过程中的影响及其作用机制。

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位授予年份】：2017