【求助】在进行凝血酶切除his标签时蛋白沉淀了

各位战友我最近纯化一蛋白，先是用镍柱亲和纯化然后用凝血酶切除his標签。切除是在室温过夜进行的将酶切混合物加到透析袋，以去除切掉的his tag以及elution过程中的大量his蛋白纯化时咪唑的浓度透析液基本与elution buffer一致（50mM tris ph8，500mM NaCl）但elution buffer还有10%甘油，以及250mM his蛋白纯化时咪唑的浓度 结果早上来看，透析袋里边大量出现絮状沉淀
我试着吸出透析袋里的样品，加入NaCl或MgCl2并没有溶解回去，请问各位我要怎么才能把蛋白溶回来啊？有没有可能是被切烂了
样品中还有凝血酶，放着有被切烂的可能吧或鍺因为沉淀了，反而保护蛋白不再进一步被切了请各位出出主义

还有，我的蛋白肯定是可溶的前几次都有浓缩到10mg甚至20mg
还能把蛋白重新溶解回去吗？

也许你可以尝试一下梯度透析看看
透析液里面的加点甘油和米佐分几次透，依次降低浓度
不过我碰到这种情况是因为要除詓盐酸胍时有沉淀而不是米佐

我所在的实验室都是这么酶切的，边切边去his蛋白纯化时咪唑的浓度的
不知道是变性还是析出了，反正试著加盐没有溶回来

你试一下第一次ni柱纯化时洗脱目的蛋白的his蛋白纯化时咪唑的浓度浓度能不能减少一些。
比如减少到150mM imidazole这样再酶切的话沉淀可能会减少，我之前做过很多次试验都是这样同一个蛋白250mM imidazole洗脱下来的，透析酶切都会有大量沉淀但是150m mM imidazole以下洗脱下来的目的蛋白透析酶切都不会沉淀。
还有酶切的温度可以降低不知道你们实验室的室温是多少？

哦室温大概20吧。我有试过4度又一次是再过镍柱的时候沉淀了
还有， 我的蛋白比较大60kd，所以去掉his标签之后不容易看出来跑高浓度胶效果也不好，是个问题。

纯化时洗脱浓度应该从高箌底，确定最佳的洗脱条件我是在纯化---浓缩了之后在用肠激酶切的His标签，效果很好