有同源臂引物pcr引物是什么意思

点击联系发帖人 时间：2019-03-02 00:32

同源引物

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准备用Gibson Assembly Mix把一个片段插入一个质粒，所以在这个操作前先用PCR把有同源臂引物pcr臂扩入这个质粒。质粒全长6000bp多PCR中，使用Q5-HF 25微升推荐的体系。正向引物TM59.2. 反向引物TM54.2程序如下：98度30秒， 98度30秒50-58度梯度7分，72度30秒72度10分，6度无限长hold

最后扩增出来的条带图如下：全部积在槽子里。不知道怎么回事求指点。

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专业: 生物物理、生物化学与分子

程序错了吧怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒反了吧，你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有有同源臂引物pcr序列的PCR产物进行Gibson cloning如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物看看有没有问题。还有就是你用质粒做模板的话，只需要加几ng的质粒就够了不需要太多。

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对也罢错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好崎岖无妨……但问，吾心坚否若坚，纵使歧路以铁心，贯穿而过亦为大道！不坚，便是坦途也难登临绝顶，观险峰

专业: 微生物生悝与生物化学

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专业: 微生物遗传育种学

72度时间太短，增长延伸时间

专业: 基因表达调控与表观遗传学

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退火和延伸的时间是不是弄反了？延伸的时间1kb 1min退火时间为30s.

专业: 微生物生理与生物化学

一是退火延伸时间反了，二是如果你片段比较短鈳以把重组臂扩在片段上，短的片段总比长的质粒好扩

6000太长，分两段扩

程序错了吧怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒反了吧，伱这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

对我打错了。延伸时间7分钟退火30秒。

首先你的片段6000所用的酶或Mix可以不可以支持这么长片段的PCR反应，其次伱的程序设置错误，退货温度7分钟延伸时间30秒，设反了吧

没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切然后和两端带有有同源臂引物pcr序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话注意你的引物，看看有没有问题还有就是，你用质粒做 ...

质粒提取浓度是300多ng每微升加了0.25微升。

专业: 生物大分子结构与功能

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98度30秒，50-58度梯度7分72度30秒---这是退火时间和延伸时间反了吧？

最爱的那个人會出现在身边

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