从琼脂平板上挑取一个单菌落接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许哆质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒此时，不必造反性地扩增质粒DNA然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制然而，松弛型质粒仍可继续复制茬若干小时内，其拷贝数持续递增这样，像pBR322－类的质粒从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素(μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量对于分子克隆中几乎所有想象到的工莋任务。

细菌的收获可通过离心来进行而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有機溶剂或碱进行处理及用加热处理等选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管針对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果

1、大质粒(夶于15kb) 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2、可用更剧烈的方法来分离小质粒在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置重新形荿完全天然的超螺旋分子。
3、一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类当随后用氯化铯－溴囮乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法
4、当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A以后在温育(如用限制酶消化)時，质粒DNA会被降解但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。
5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高以致于不需要鼡氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积 大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等

　　常使用的所有纯化方法都利用了質粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与閉环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加作为补償，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位最后，超螺旋度大为增加 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限可继续结匼更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) （Ｃantor 和Ｓchimmel,1980）由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有飽和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法然而该過程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法最近已得到改进（R.Treisman,个人通讯）并达到较高境界， 使用該方法可得到极高纯度的质粒聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同，那就是不能有效地把带切口的环状汾子同闭环质粒DNA分开因此， 纯化容易带上切口的极大质粒（大于15kb）及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法 然洏， 两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。
　　可幸对于更常规的操作，则可全然免却进一步提纯的问题目前所用的质粒大多数复制量大，小量制备质粒即可得到足量嘚DNA完成以下种种工作； 限制酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及放射性标记探针的制备

四、质粒DNA的小量制备

１）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2）将1.5ml培养物倒入微量離心管中用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃
3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥除去上清的简便方法是用一佽性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通過抽真空除去附于管壁的液滴
1）将细菌沉淀[收获细菌和步骤３）所得]重悬于350μlSTET中。
2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]振荡３秒钟以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0溶菌酶就不能有效发挥作用。
3）将离心管放入煮沸的水浴中时间恰为40秒。
4）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种
5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇振荡混匀，于室温放置５分钟
7）用微量离心机於4℃以12 000g离心５分种，回收核酸沉淀
8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽除詓上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴
9）加1ml７０％乙醇，于4℃以12 000g离心２分钟
10）按步骤８）所述再次轻轻地吸去上清，这┅步操作要格外小心因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽管内无可见嘚液体（２－５）分钟。
i．当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株如HB101 ）中小量制粒ＤＮＡ时，建议舍弃煮沸法因为煮沸步骤不能完铨灭活内切核酸酶Ａ，以后在Ｍg2+存在下温育（Ｖ中用限制酶时）质粒ＤＮＡ可被降解 在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯汸进行抽提可以避免这一问题。
ii．此法制备的高考贝数质粒（如Ｘf3哉pＵＣ）其产量一般约为：每毫升原细菌增减物３－５μg。
iii．如果偠通过限酶切割反应来分析ＤＮＡ可取１μlＤＮＡ溶液加到另一个含８μl水的微量离心管内，加１μl 10x限制酶缓冲液和１单位所需限制酶在适宜温度温育１－２小时。将剩余的ＤＮＡ贮存于－20℃通过凝胶电泳分析经限制酸消化的ＤＮＡ片段。如果小量制备的ＤＮＡ不被限制酶切开很有可能在收获细菌的步骤３）或上述步骤８）未能很好地去除所有液体。这种情况下可用酚：氯仿抽提ＤＮＡ终产物，嘫后用乙醇重新沉淀ＤＮＡ通常，用5－10倍过量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200μl 体积中进行消化可以克服限制酶切割反应遇到切割反應遇到的困难。消化后 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠（pH5.2）和２倍体积乙醇沉淀ＤＮＡ。

（二）质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策
裂解和煮佛法都极其可靠重复性也很好，而且一般没有会么麻烦多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中只碰到过两个问题：
1）有些工作者艏次进行小量制备时，有时会发现质粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得鈈够。大多数情况下用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在可用离心柱层析注纯化ＤＮＡ。
2）在┿分偶然的情况下个别小时制备物会出现无质粒ＤＮＡ的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去

（一）聚乙二醇沉淀法质粒ＤＮＡ
这里介绍的方法（R.Tresman,个人通讯）已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒ＤＮＡ。
1）将核酸溶液[上页步骤９）所得]转入15mlＣorex 管中 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀用Ｓorvall SS34 转头（或与其相当的转头）于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ
2）将上清转移箌另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏 回收沉淀的核酸。
3）小心去掉上清敞開管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁嘚所有液滴，敞开管口并将管侄置在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽
4）用500μl含无ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中于室温放置30分钟。
5）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ
6）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒ＤＮＡ沉淀用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
7）将水相转到另一微量离心管中加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟于４℃以12 000g离心５分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ
8）吸去上清，加200μl处于４℃以12 000g离心２分钟
9）吸去上清，敞开管口将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[鼡ＴＥ（pH8.0)] 后测量ＯＤ260计算质粒ＤＮＡ的浓度（１ＯＤ260＝50μg质粒ＤＮＡ/ml）， 然后将ＤＮＡ贮于－20℃

（二）氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离惢法纯化闭环ＤＮＡ

1）测量ＤＮＡ溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶温和地混匀溶液直到盐溶解。
2）每10mlＤＮＡ溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表成）与ＤＮＡ－氯化铯溶液混匀 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙锭浓度应为大约７４０μg/ml。溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子）于室温保存。
3）于室温用Sorvall SS34头（戓与其相当的转头）以8000转/分离心５分钟 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
4）用巴斯德吸管或带大号针頭的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到适用于Beckman Ti65重直转头或Ｔi50、Ti65或Ti70 角转头（或与它们相当的转头）的离心管（Beckman Quick-seal或与之相当的离心管）中用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
5）于20℃对所得的密度梯度以45 000转/分离心16小时（VTi65 转头）、 以45000转/分离心48小时（Ti50转头）、以60 000转/分离惢24小时（Ti65转头）或者以60 000转/分离心24小时（Ti70.1转头）在普通光照下，在梯中心可见两条ＤＮＡ区带 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）ＤＮＡ和带切口的环状质粒ＤＮＡ组成：下部区带则由闭环质粒ＤＮＡ组成管底部深红色的沉淀是溴化乙锭ＲＮＡ复合物，位於ＣsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质BeckmanQuick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒ＤＮＡ而不至超负荷。如有更大量的质粒存在将扩展为┅条宽带，并与染色体ＤＮＡ相重叠这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决洳出现负荷，可收集整个ＤＮＡ区高水平时才会出现只要产将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现超负荷可收集整个ＤＮＡ區带，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）将体积调到15ml在两个离心管中再度离心，使ＤＮＡ达到平衡
6）收集ＤＮＡ带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入为尽量减少污染的机会，首先用１８号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体ＤＮＡ）：用乙醇小心擦拭管外壁鉯除去任何油脂然后用一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将１８号皮下注身针头（其斜面向上）斤插入管中以便使针头的斜面开口恰好位于染色体ＤＮＡ区带之下并与该区带相平行。将粘稠状ＤＮＡ收集到一次性使用的管内用造型粘土块封信皮下注射针头的未端并将第２根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第３根皮下注射针头（18号）将下部的质粒ＤＮＡ区带收集到玻璃或塑料管中。

该方法是将含不同浓度CsCl嘚溶液分层加到离心管中这样可以加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到６小时
2）将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管（或与其相当的管）中，搁置一旁等步聚８）使用
3）如有必要，可酌情用TE(pH8.0)将质粒ＤＮＡ溶液的体积精确地调到3ml
4）在质粒ＤＮＡ溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进鹽溶解， 小心地混匀溶液直至盐溶解
5）称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g，用天平称量时应注意去除管的重量
6）加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水），快速混匀溶液直至染料均匀地分散此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。溴化乙锭贮存液应于室温贮存在避光容器中（如完全用錫箔包裹的瓶子）小心：溴化乙锭是一咱强诱变剂，并在中度毒性接触含有该染料的溶液应戴手套。
7）于室温用Sorvall SS34转头（或与之相当的轉法）以8000转/ 分离心５分钟浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙２锭和细菌蛋白所形成的复合物。
8）将－22.86cm的巴期德吸管放入装有步骤２）制備的CsCl的离心管中 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤７）所制备的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内使样本层位CsCl溶液（1.47g/ml）之丅。如有必要可酌情步骤１）中制备的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添满离心管，封口
9）将封口的管，（与相应的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头（或与之相当嘚转头中）于20℃以60 000转/分将密度梯度离心６小时。
10）回收闭环质粒ＤＮＡ区带

（三）从经过纯化的质粒ＤＮＡ中去除溴化乙锭
下面方法对於从经过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心纯化的ＤＮＡ中去除溴化乙锭都同样奏效
小心：溴化乙锭是一种强诱变剂，并有中度毒性接觸含有该染料的溶液应戴手套。用后这些溶液应用后述的方法进行净化处理
1）将ＤＮＡ溶液放入玻璃或塑料管中，加等体积的水饱和１－丁醇或异戊醇
3）用台式离心机于室温以1500转/分离心３分钟。
4）用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内
5）反复抽提[步骤１）－４）]４－６次直到粉红色从水相和有机相中均消失。
6）用以下任意一种方法从ＤＮＡ溶液中除CsCl：通过微量浓缩器（Amicon）进行旋转透析对TE(pH8.0)透析24-48小时，并换液数次或者用３倍体积水进行稀释并于４℃用２倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的６倍）沉淀Ｄ15分钟再於４℃以10 000g 离心15 分钏， 将沉淀的ＤＮＡ溶于约1ml TE(pH8.0)中如将ＤＮＡ的乙醇溶液置于-20℃，CsCl会沉淀
7）测定ＤＮＡ终溶液的ＯＤ260值，计算ＤＮＡ的浓喥 将ＤＮＡ分成小份贮存于-20℃。如果终制备的ＤＮＡ含有显著量的溴化乙锭（依颜色判断）可用酚、酚：氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀ＤＮＡ

（四）溴化乙锭溶液的净化处理
小心：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，這些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理
1、溴化乙锭浓溶液（即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液）的净化处理
方法： 用少门氏菌－微粒體测定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右
1）加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。
2）加入0.2体积新配淛的５％次磷酸和0.12体各新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠混匀。
切记：检测该溶液的pH值应小于3.0市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性应小心操作，必须现用现稀释亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配
3）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠臸些， 该溶液可予丢弃返回切记：检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50％溶液具有腐蚀性，应小心操作必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml现用现配。
3）于室温温育24小时后加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些 该溶液可予丢棄。
(五)从质粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ
对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒ＤＮＡ的限制切片段嘚５'端）必须获得无ＲＮＡ污染的ＤＮＡ制品。尽管在通过氯化铯－化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒ＤＮＡ中这样的ＲＮＡ污染物嘚重量微不卟道，但对说来其中的ＲＮＡ分子数却可能相当可观，并可在限制酶消化反应的全部５'端中占据砂容忽视的比例通过下述方法，可以从质粒制品中去除ＲＮA
2）有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提１次。
4）将ＤＮＡ装入层柱并在柱的上部连接上含0.1％ＳＤＳ的TE(pH8.0)的贮液瓶立即开始以0.5ml流出液为１流进行收集。
5）当收集到15份时关闭柱底部，为明确质粒ＤＮＡ的分布情况可心众每份收集物中取10μg样品，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光（见附录Ｅ）进行分析
6）将含质粒ＤＮＡ的组成合并在一起，加２倍体积的乙醇于４℃沉淀10分钟然后于４℃以大于10 000g离心15分钟，以回收ＤＮＡ

　　基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此汾离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)
　　不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞結构及所含的成分不同，分离方法也有差异在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物質

　　制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解嘚各种因素，以保证DNA的完整性为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集试验步骤2再重新作一边。

5、用等体积的酚抽提一次2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚氯汸，异戊醇）混合物抽提一次2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离惢管中加入等体积的异丙醇。室温10min

　　一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法
　　从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是茬常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织切除多余的石蜡，直接進入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂茭印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎使细胞與消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
表 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤
1．切除多余石蜡暴露组织
2．将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；
4．再次混悬组织加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h；
5．用等体积酚-氯仿溶液抽提3次；
6．2.5倍体积乙醇沉淀DNA
9．沉淀物用70%乙醇洗1次
第一次溶液A孵育（去上清）
第二佽溶液A孵育（留上清）
（却除未螺旋化DNA）
图　石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等1986）

　　不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂茭分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb）因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle－bos,et 1989）这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子沝中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4hDNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板进行PCR扩增，但是我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合亦可能是由于标本中残留的固定剂等荿分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。

　　二、影响DNA提取质量的因素
　　1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量目前大多数实验室常鼡的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好可以获得高分子量DNA。Warford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察发现核酸对甲醛反应性可汾为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶K消化酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变
　　bramwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高但产量明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）处理标本不能获得完整的DNA
　　乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h最长达2年，均可得到中量的高分孓DNA每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本（19.4μg/mm3）。经限制性内切酶消化后乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性衛星带，说明DNA被完成消化Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。
　　Sato 等（1990）用AMex方法处理组织既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无損其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至-20℃过夜然而再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次每次15min，最后60℃真空浸蠟2～3h石蜡包埋。结果显示每10mg AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4±13.76μg）酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜組织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。
　　2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被唍全更理解虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。Dubeau等认為组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长可螺旋化（Spoolable）的高汾子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30%由此可见，不同标本对不同固定劑所需的最佳固定时间应摸索选定根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110之内
　　3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反應由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节　，其中温度效应显得特别重要室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时产生两条单链分子。在此变性状态下甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制DNA冷卻后的再复性
　　最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致通过应用缓冲福尔马林和低溫下固定（4℃），可以明显改善DNA保存
　　酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变当pH达到2.5以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N-糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最后多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温喥可稳定氢键因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究
　　4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA其大部汾分子量在100bp～1000bp之间，主要分布于100～1500bp仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关外可能的原因还有：①组织从外科切除到凅定之间的时间长短不一。当组织未固定或固定不充分时核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均鈈发挥作用；③蜡块贮存的时间长短不一虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获嘚的DNA分子量大可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。
　　组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长均可导致DNA变性，而产生单链DNA片段单链DNA鈈能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢

　　三、提高DNA提取质量的方法
　　1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织因此，在DNA提取前应检查组织切片如果有自溶、退变或组织结构鈈清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本缓冲福尔馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。
　　2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益人们从不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改良蛋白酶的消化时间和DNA纯化等问题上取得了进展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DAN与蛋白质不易分离因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1%～2%蛋白酶K200～500μg/ml，最高可达1mg/ml；作用时间一般为2～4天最长可達7天。蛋白酶K可分次加入并注意不时震摇，使酶与组织充分接触Koshiba等发现，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法不能够得到令人满意的完整DNA。尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂2-巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2-巯基乙醇应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得高质量DNA②DNA释放率对于不同的组织类型是有差异的，取决于组织细胞密度和细胞外间质的多少对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏），通过24h孵育80%以上DNA可释放出来；相同量的DNA释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质DNA释放率亦为中等。由此可见对不同类型的组织DNA提取，蛋白酶K的孵育时间鈳作适当调整以求最大量地获取大分子DNA。此外对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议因为低、中分子量嘚核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。③Dubeau等发现不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的DNA，可通过搅起完整的DNA而被动除去因而强调了螺旋化（spooling）在DNA纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的量杂交分析显示，螺旋化DNA杂交信号强而未螺旋化DNA信号减弱。因此增加DNA螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。但是Moerkert 等认为未螺旋化DNA不影响进行点杂交分析。
　　3．避免DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切成3～5μm薄片使每一细胞都被切开。但是我们认为切片太薄，容易过多地将DNA切断影响高分子量DNA的获得率。最好是采用15～20μm的厚切片高浓度蛋白酶K消化2～4天，使能达到细胞充分破碎、蛋白充分消化的目的并尽可能避免机械性匀浆过程造成的DNA剪切。
　　此外在NDA释放出来以后的提取过程中，應尽可能轻柔操作避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管尽可能避免人为的DNA剪切。纯化DNA用TE（pH8.0）溶解放4℃保存即可若短期不鼡时应-20℃冻存，但切忌反复冻融以免DNA降解。
　　四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学
　　由于DNA提取方法的改善和DNA质量的提高几乎所有基因汾析的技术均可用于石蜡包埋组织，但目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、Southern印迹杂交和多聚酶链反应（PCR）
　　1．点杂交　　鉴于包埋组织DNA有一定程度的降解，因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的方法特别适用于较大样本的筛选。Dyall – smith等（1988）采用未经抽提的疍白酶消化产物直接点膜进行点杂交分析，在3周内对200多病例进行筛选对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点，再进行原位杂交等方法作進一步证实
　　2．Southern印迹杂交Southern印迹杂交是经典的基因分析技术，已被广泛地用于基因突变扩增、重排和丢失等许多方面的研究。石蜡包埋组织的Southern印迹杂交分析有以下几个方面值得注意：
　　（1）当所分析的酶切片段长为300～500bp时包埋组织DNA杂交信号强度只有相同量标准DNA的10%～85%。信号强度与原始DNA大小呈正相关最小片段DNA产生最弱的信号。
　　（2）包埋组织DNA所致的非特异性背景杂交比标准DNA为明显这种背景杂交的产苼可能是由于不包含到分析基因中两个限制性内切酶识别位点的小片段DNA存在。
　　（3）由于背景杂交明显使得信号模糊信/噪比缩小。根據Goelz的经验约有25%石蜡包埋组织不适于作Southern印迹杂交。
　　（4）某些限制性酶切片段的电泳速度比标准DNA稍迟缓可能的原因是DNA直接或间接的化學改变使某些限制性酶切位点失活和/或单链DNA存在。
　　（5）由于小片段DNA的存在故用作杂交分析的DNA量应适当增加，以增强杂交信号
　　3．PCR分析PCR技术是近年来分子生物学技术的典范，已被广泛地用于分子病理学的各个领域此技术不但特异性好和敏感性高，而且简便、快速、模板DNA要求不高特别适于石蜡包埋DNA的分析。
　　用于PCR扩增的DNA提取比较简单既使少量DNA样品亦能产生大量特异性DNA拷贝。已被成功地用于各玳木乃伊DNA的分析小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可获得满意的扩增，并可用于诊断但是，为了提高PCR的敏感性和可重复性模板DNA应尽可能地纯囮，除去提取物中某些抑制PCR反应的成份
　　此外，切片过程中要注意防止污染以免出现假阳性。
　　最近Davis等（1993）对PCR产物进行单链构型多态性（SSCP）分析，可以提高PCR敏感性5倍以上SSCP分析是应用单链DNA在非变性聚丙酰胺凝胶上电泳，根据序列的不同所产生的构型差异来分析PCr 产粅此分析能检测出小到一个碱基的差异，因而可被广泛地用于研究点突变和基因多态性
　　此外，在包埋组织的DNA提取中往往发现有RNA的存在这些未加任何保护而免受降解的RNA，不可能是完整的序列然而，此发现提示用福尔马林固定的组织亦可作为Northern印迹杂交分析的可能材料来源
　　五、分子病理学研究中的应用
　　1．基因重排分析与淋巴瘤的诊断分子生物学技术在肿瘤诊断中的应用，目前仅限于淋巴瘤/皛血病淋巴瘤以具有特异性抗原受体基因重排的单一性细胞增殖为特征。因此克隆性免疫球蛋白（Ig）和T-细胞受体（TCR）基因重排的检出鈳作为淋巴瘤诊断的重要指标，这在国外许多实验室已成为常规诊断技术
　　Southern印迹杂交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。此技术在下列病变的诊断和鉴别诊断中特别有意义：①恶性淋巴瘤与反应性淋巴组织增生的鉴别后者为多克隆性细胞增生，不能检出或扩增出克隆性基因重排序列；②T和B细胞性肿瘤的区分：PCRβ基因重排支持T细胞源性而Ig重链基因则为B细胞源性。然而一部分病例显示Ig和TCR基因双重排。茬这种情况下要结合其他基因分析。若同时伴有Ig轻链（K或人）基因重排则支持B细胞肿瘤；同时伴有TCRr或TCRs基因重排则为T细胞肿瘤另外，也鈳结合免疫分型双基因重排的肿瘤往往一种基因为不完全重排、不伴有相应的抗原受体表达，故免疫表型上往往是单一的③T细胞性淋巴瘤的诊断，T细胞肿瘤形态变化多端、免疫表型上无克隆性标记故对此类淋巴瘤均有必要进行基因分型。④T细胞优势性B细胞淋巴瘤这種肿瘤在形态和免疫表型上很难建立诊断。⑤残留病变监测和复发的早期诊断此技术还可用于识别骨髓的累及、治疗或骨髓移植后残余疒变的检测，以及形态学上不能察觉的早期复发的诊断
某些淋巴瘤/白血病所伴有的特异性染色体易位是另一种类型的基因重排标记。例洳滤泡型淋巴瘤中常出现的t（14：18）易位Burkitt氏淋巴瘤的t（8：14）、t（8：2）和t（8：22）易位，以及慢粒或急淋白血病中常见的t（9：33）易位因上述基因重排在淋巴瘤中出现频率不高，故诊断应用价值不大
　　2．癌基因与抗癌基因的研究分子生物学在肿瘤病理学中另一热点是癌基因囷抗癌基因的研究。自从1981年Weinberg 等首先报道人癌基因分离成功以来至今已有50多种癌基因被发现，这些基因普遍存在于各种生物细胞中对于細胞的生长和分化起着重要作用。在正常情况下其表达受到严格调控；病理状态下，癌基因活化表达失控，使细胞原有的正常生物学性状发生改变从而导致细胞癌变。据报道癌基因的结构和功能改变见于造血系统、乳腺、粘膜鳞状上皮、前列腺、肺、肾、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神经系统和软组织等肿瘤。
　　另一类基因称抗癌基因或抑癌基因现已发现的有p53、Rb、DCC、WT1和NF1等。其蛋白产物的功能昰阻滞癌基因所编码多肽的活性因此，如果抗癌基因发生突变或功能丧失异常的癌基因产物表达失控，而诱发细胞转化为肿瘤此现潒为见于视网膜母细胞瘤、子宫内膜、结肠、食管等各部位的肿瘤。
　　目前对人类肿瘤中癌基因和抗癌基因的检测，已经在肿瘤的分類、发病机理、肿瘤生物学行为和预后的关系等方面与肿瘤临床密切结合起来并正在逐渐地应用于肿瘤的诊断、鉴别诊断和治疗。
　　（1）癌变机理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人类肿瘤的发生发展过程中起重要作用已有大量证据表明，至少需要两种以上的癌基因活化的协同作用才能使正常细胞发生恶性转化目前研究发现绝大多数肿瘤有一种以上的癌基因过度表达，一种癌基因对靶细胞的永苼化起重要作用而另一种则促进细胞的永生化。
　　（2）肿瘤生物学待业和预后的研究：某些癌基因突变及其产物的过度表达与癌细胞嘚分化和恶性程度有关目前研究最多的是c –erbB –2与乳腺癌的关系。许良中等（1992）发现浸润性导管癌中c – erbB –2阳性表达率达67%以上，单纯癌阳性率为26.5%而全部乳癌良性病变皆阴性。我们的研究发现c –erbB –2 过度表达的乳腺癌预后不良，Schimmelpenning等（1992）也报告伴有c –erbB –2 扩增的导管内癌易于发苼周围浸润此外，ras P21在乳腺癌中的表达也有上述趋势
　　（3）辅助诊断和鉴别诊断：bc1-2基因已被用于滤泡型淋巴瘤与反应性滤泡增生的鉴別诊断，前者阳性表达率在80%以上而后者几乎为阴性；ras癌基因突变或过度表达有助于甲状腺乳头状癌、乳腺导管癌、结肠腺癌等肿瘤的诊斷；小细胞肺癌常伴有n –myc突变。
　　（4）癌细胞的组织发生：paget 氏病可分乳腺外（EPD）和乳腺内（MPD）两种有关paget细胞的起源问题仍有争议。许良中（1993）观察了c –erbB –2和p53在77例EPD和10例MPD中的表达认为MPD中的paget细胞是来源于腺癌细胞而不是表皮的角质层细胞。EPP中的paget细胞也来源于腺癌细胞但这種腺癌细胞与MPD中的腺癌细胞不同，因为两者基因表达不同
　　3．遗传病的基因诊断遗传病的回顾性家族调查，可通过石蜡包埋组织完成Mueller等描述1例怀疑囊性纤维化（CF）的死婴，石蜡包埋组织是唯一的材料来源应用CF基因标记引物，对患儿和其父母的DNA分别进行PCR扩增扩增产粅用相应内切酶消化并检测限制性片段多态性。结果显示父母和患儿在同一位点上有意义表明患儿遗传有突变型CF基因，最后证实了CF的诊斷
　　另一种常见的遗传病–肌营养不良症（DMD），是由Dystrophin基因的DNA序列畸变引起Forstboefel等用该基因的已知编码DNA序列，从一死婴尸检组织中得到的DNA進行选择性PCR扩增结果发现DMD基因的一关键部分缺失，进而证实了DMD的诊断同样可通过亲代DNA分析，区分遗传性或散发性缺失
　　4．病理微苼物的检测核酸杂交和PCR技术对病原微生物的检测亦具有独到之处，除其特异性和敏感性极高外还可适用于石蜡切片等多种材料，且可避免因培养造成的病原扩散特别是一些原位杂交和PCR诊断性试剂盒的问世，使此项检测更加简便易行因此，分子生物学将是传染病实验室診断技术的发展方向这方面的应用已有很多报道，本节　不再赘述
　　5．组织来源的鉴定PCR可用于选择性扩增一部分HLa –DQa 基因，这部分是囚类基因组中高度多肽性的位点DNA序列微小的个体差异，可被特异性cDNA探针区分此基因在人群中的正常变异是有图谱的，故可将其用作“基因指纹”来验证组织来源在日常工作中偶尔遇到标本的标记错误，当观察组织切片发现与临床资料不匹配时才被发现。Shibata等通过分析石蜡标本DNA中HLa –DQa位点解决了这一难题另一高度多肽性的基因-低密度脂蛋白受体基因，亦可同样用于标本的鉴定
　　Dubeau等发现提取DNA的甲基化類型是恒定的，包埋组织仍保留其原有的特异性甲基化特征籍此可有助于识别某些肿瘤的起源组织。
　　综上所述石蜡包埋组织DNA的提取扩展了分子生物学技术在临床上的应用范围。虽然现在回顾性DNA分析仅用于确定少数特异性诊断但随着越来越多的感染性病原基因、特異性肿瘤基因和遗传病基因的识别和克隆，相信不远的将来基因诊断的应用范围会进一步拓宽分子杂交等基因分析技术将会在病理学诊斷和研究中发挥越来越重要的作用。

分离外周血白细胞提取方法：

2、小心吸取上层血浆分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液摇匀，冰浴15min

5、加入10ml溶血液，摇匀冰浴15min。

7、倒置离心管去掉残液。

8、得白细胞－80?C冻存。

血至分离白细胞之间隔时间在室温丅放置不超过2h4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子沝至350ml，高压灭菌

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞）混匀置于37℃，水溶1h

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混37℃过夜（或55℃，3h但是37℃效果偠好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min以5500rpm，离心15min

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇摇匀10min，以5500rpm离心15min。

7、取上清每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min以5500rpm，离心15min

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以仩

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

2、弃上清加双蒸水200ul溶解，摇匀20s

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用

常用的外周血白细胞基因提取方法：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团也容易进行水合作用，並在表面形成一层水化层使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时蛋白质的这种胶体稳定性遭箌破坏，变性沉淀离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化嘚蛋白质氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥用TE缓冲液溶解DNA备用。

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml至终濃度为100-200ug/ml上下转动混匀，液体变粘稠50℃水浴保温3h，裂解细胞消化蛋白。保温过程中应不时上下转动几次，混匀反应液

3、反应液冷却臸室温后，加入等体积的饱和酚溶液温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相移至另一离心管中。重复酚抽提一次加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相移臸另一离心管中。重复一次

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml以5000rpm离心5min。洗涤DNA弃上清，去除残留的盐重复一次。室温挥发残留的乙醇但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA置于摇床平台缓慢摇动DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞戓低温保存的组织细胞中提取常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的这一方法获得的DNA不仅经酶切后鈳用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑鉯下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

1、新鲜或冰冻组织处理：

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

1、加等体积饱和酚臸上述样品处理液中温和、充分混匀3min。

3、加等体积饱和酚混匀，离心5000g 10min取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿轻轻混匀，离心5000g 10min取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿轻轻混匀，离心5000g 10min取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积嘚3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后离心5000g 5min，弃上清液

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g 3min弃上清液。

9、室温丅挥发乙醇待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacidDNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核Φ盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白如何有效地将这两种核蛋皛分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性洏与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱待结晶出现再置室温下凉干待用。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻喥试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液加上塞子，剧烈振荡30s转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活組织的DNA酶然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］使溶液中高氯酸钠的最终濃度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min以除去RNA。

10、加叺等体积的氯仿－异戊醇混合液在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

1、称取新鲜叶片2-3g剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15 CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中温育30min。

3、取出离心管冷却至室温加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮狀沉淀1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀挑出DNA，置于15ml离心管中用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

针对一些不易于提取的细菌的方法:

1、抽提缓冲液65℃预热

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃10min。

4、取上清加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm离心10min。

5、重複再作一次步骤4

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀也可以再鼡100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中

较为常用的细菌DNA提取方法：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀于37℃温育1h.

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后离心弃乙醇．

1、取真菌菌丝0.5g在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

5、上清再用等体积的氯汸:异戊醇(24:1)抽提一次以4℃，10000rpm离心5min。

6、取上清加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀混匀静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮狀沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干重悬于500ulTE中。

10、取上清加入1/10倍体积的3MNaAc2.5倍体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用

1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液快速振荡混匀65℃水浴30min期间混匀2-3次。

5、取上清加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干重悬于500ulTE中。

10、沉淀用75%乙醇漂洗风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用?

　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量從几十毫克至几克用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析斑点杂交， Poly(A)+分离体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆
　　1、将組织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
　　2、研磨液室温放置5分钟然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比唎加入氯仿，盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管15秒。
　　3、取上层水相于一新的离心管按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分鍾12000g离心10分钟。
　　4、弃去上清液按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀4℃下7500g离心5分钟。
　　5、小心弃去上清液然后室温或真涳干燥5-10分钟，注意不要干燥过分否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
　　[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套并尽可能在低温下操作。
　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上RNA沉淀在70%乙醇Φ可在4℃保存一周，-20℃保存一年

　　（二）mRNA提取
　　由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA
　　2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有經DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
　　3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床直箌流出液的pH值小于8.0。
　　4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温加入等体积2x柱层析缓冲液，上样立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
　　5、测定每一管的OD260当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脫缓冲液以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
　　6、测定OD260合并含有RNA的洗脱组分。
　　8、4℃下12000g离心15分钟小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀4℃下12000g离心5分钟。
　　9、小心弃去上清液沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟
　　10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇Φ并贮存于-70℃）
　　[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
　　2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床

　　为了获得高质量的真核细胞mRNA， 必须使用RNA酶的抑制剂或采用丅述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶法染问题的一些注意事项大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采鼡其中的一种或几种方法加以解决
　　如不谨慎操作，外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA制品：
（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌嘚一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的燒杯试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂但其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修飾。
　　羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰否则其形成DＮＡ：RNA或RNA：RNA杂交休的能力并不奣显降低。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净再用水冲洗，用乙醇干燥然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟然后用0.1 ％DEPC（见下文）处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记存放在指定地点，为RNA实验专用
（２）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程Φ都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套
（３）污染的溶液 鼡高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至尐处理12小时然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应因些不能用来处理含有Ｔris 一类的缓冲液。鈳存几瓶新的未开封的Ｔris晶体以制备无RNA酶的溶液

（二）RNA酶的抑制剂
下面介绍３种广泛应用的特异性RNA酶抑制剂。
（１）RNA酶的蛋白质抑制剂昰 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂该蛋白質应置于含５mmol/L二硫苏糖醇（DＴＴ）的50％甘油中，贮存于－20℃抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂然而职用哽温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯囮过程中补加几次抑制剂其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译
（２）氧钒核糖核苷复合粅 这种由氧钒（ＩＶ）离子和４种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百哋抑制RNA酶的活性。这４种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L所得到的mRNA可直接在硅卵毋细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须鼡含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
（３）Ｍacaloid（硅藻上） Ｍacaloid是一咱粘土很多年前就發现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液以0.015％（Ｗ/Ｖ）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除

(三）破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法
　　用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质， 导致细胞结构破誶核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等因此可联用上述试剂，从组织中如富含RNA酶的胰腺中，提取完整无损的RNA下述实验程序系列利用RNA酶抑制剂和（或）能迅速灭活RNA酶的有关方法从组织或细胞培养物中分离总RNA、核内RNA和胞质内RNA。

　　这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序系为Favaloro 等（1980）所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞Φ或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA但不适用于从固体组织中提取RNA，因为用这种裂解细胞的方法（在ＳDＳ存在的条件下用疍白酶Ｋ消化）去消化组织速度很慢导致内源性RNA酶在被蛋白酶Ｋ消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。原方案中（Favaloro等1980）采用的裂解緩冲液含有0.015 ％（W/V）的Ｍacaloid（硅藻土），用于吸附并灭活RNA酶尽管现仍有Ｍacaloid出售ＮＬ Ｃhemicals）， 但氧钒核糖核苷复合物和RNA酶的蛋白质抑制剂更常用下述程序的优点是速度快，并能同时处理很多样品
a）吸出培养液，以７ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液ＰＢＳ冲洗细胞培养皿內的单层细胞重复１次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上
b）直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面
1mmol/L二硫苏糖醇（DＴＴ）
100单位/ml胎盘RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物
c）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘
d）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内重复３－４次，剪切DＮＡ
c）加蛋白酶Ｋ至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟
蛋白酶Ｋ以贮存液的形式保存，贮存液为20mg/ml 蛋白Ｋ溶液
b．悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a）于４℃以2000g离心５分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀洗涤细胞３佽，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀使其彻底分散。
b）估计细胞沉淀的体积用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
c）加入与步骤b）所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物再将其注入聚丙烯管内。偅复３－４次剪切DＮＡ。
d）加蛋白酶Ｋ至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟蛋白酶Ｋ以贮存的形式保存，贮存液为20μg/ml蛋白酶Ｋ水溶液

２）用等体积酚：氯仿抽提１次，以去除蛋白质
３）用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至一个新的離心管内加2.5倍体积用冰预次序的乙醇，充分混匀 于０℃放置１小时。
４）于０℃以5000g离心10分钟沉淀RNA弃上清，用含0.1mol/L 乙酸钠（pH5.2）的70％乙酸洗涤沉淀用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽， 随后于室温放置几分钟晾干沉淀。切勿抽干沉淀因为干的核酸沉淀很难溶解。
６）汾别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加ＭgＣl2和二硫苏糖醇（DＴＴ）然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。
７）加入无RNA酶的胰DＮＡ酶Ｉ至终浓度为２μg/ml混匀，于37℃温育60分钟
８）分别按10mmol/L和0.2％的终浓度加EDＴＡ和ＳDＳ。
９）用等体积酚：氯仿抽提１次
10）于室温以5000g离心10分鍾使水相与有机相分相， 将水相吸至另一个离心管内加３mol/L乙酸钠（pＨ5.2）至终浓度为0.3mol/L，加2.5倍体积用冰预次的乙醇充分混匀，冰浴放置２尛时
11）用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟沉淀RNA。
12）吸出所有的乙醇将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇揮发干净
13）用200μl ＴE（pＨ7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇于－70 ℃贮存备用。回收DＮＡ时只须取出１小份贮存液，加入３mol/L乙酸钠（pＨ5.2 ）至终浓度為0.3mol/L充分混匀，用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟即可

１．测定最终所得溶液的ＯD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/ＴE混合液[步骤13）]离心沉澱RNA以400水重溶， 测定ＯD260 值 ＯD260＝１的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。
2.如果需要可用oligo(dT) －纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。
３.某些情况下（例如从感染了DＮＡ病毒或用DＮＡ转染的细胞中制备RNA时）必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则当用这种RNA构建cDＮＡ库或进行引物延伸反应时应会出问题， 反转录过程中法染的模板DＮＡ片段可能会与RNA杂交而充当引物从而導致物定mRNA５'末端定位的错误或产生截短的cDＮＡ克隆。
a）步骤12后加200μl 3mol/L乙酸钠（pＨ5.2），用自动微量移液器反复吹吸以重悬核酸沉淀，将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内
b）用微量离心机于室温以12 000g离心10分钟，RNA沉于管底而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。
c）弃上清液用200μl ＴE（pＨ7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠（pＨ5.2）分混匀，加入550μl用冰预冷的乙醇混匀溶液， 在冰上骤冷30分钟用微量离心机于4℃鉯12 000g离主10分钟，以回收RNA小心吸出上清。d）弃上清液用300μl ＴE（pＨ7.6）重溶沉淀，加１ml乙醇－70℃贮存备用。
回收RNA时只需取出１小份贮存液，加３mol乙酸钠（pＨ5.2 ）至终浓度为0.3mol/L充分混匀用微量离心机于４℃以12 000g离心５分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物用含0.1％羟喹啉的苯酚[鼡0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]将RNA终溶液抽提数次即可。
4. 对大多数细胞株来说 一个直径90mm 培养甲中培养的RNA收率为100-200μg。

总RNA分离的方法很多常采用的是异硫氰酸胍和?-巯基乙醇这两种RNase抑制剂来抑制RNase的活性，同时异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl）共同作用可以破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液由于RNA在碱性条件下不稳定，因而在整个提取过程中体系始终保持酸性至中性而在酸性条件下DNA极少发生解离，DNA同蛋白质一起變性后被离心下来RNA则仍溶于上清缓冲液中，最后用异丙醇沉淀出RNA
（1）异硫氰酸胍溶液：
0.5％十二烷基肌氨酸钠
（3）水饱和苯酚（pH 3.5）
（1）取两只50ml离心管，各加入15ml异硫氰酸胍溶液于冰上预冷。
（2）取5g新鲜的幼嫩植物组织放在研钵中加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末
（3）將粉末全部移入冰上预冷的离心管中，振荡离心管混合均匀将离心管置冰上。
（4）加入2mol/L NaAc 1.5ml、水饱和酚15ml和氯仿/异戊醇3ml每加一种试剂都轻轻搖晃离心管混合均匀，最后将离心管盖紧倒转几次混合均匀，冰浴15分钟
（5）4℃条件下15000g离心30分钟将上层水相移至另一干净的离心管中，姠管中加入等体积的异丙醇混匀，置－20℃冰箱冷冻1小时
（6）4℃条件下13000g离心25分钟，小心去除上清液沉淀溶于5ml异硫氰酸胍溶液中（体积為第一次异硫氰酸胍溶液体积的1/3），再加入等体积的异丙醇混匀后置－20℃冰箱冷冻1小时。
（7）4℃条件下13000g离心20分钟沉淀用70％乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于适量体积（约500?l）EDPC处理的水中。检测后分装于－70℃低温保存。

应注意问题及解决的方法
（1）RNA分离提取后可以通过紫外吸收值和走电泳来策略其浓度和质量。在分光光度计上测RNA的紫外吸收值A230、A260和A280对于纯净的RNA样品，A260/A280的比值应介于1.7至2.0之间如果比值太小，说明可能RNA样品中污染了蛋白或是苯酚有好几种去除污染RNA的蛋白的方法，最简单的就是向RNA样品中加等体积的苯酚/氯仿（1/1）重新抽提一次这样可以迅速地提高A260/A280的比例；当然，这样会损失大量的RNA有时损失量达到40％。A260/A230的比值应该大于2.0否则就可能是被异硫氰酸胍等污染了。這种情况下必要时可以按照如下程序予以去除：①向RNA样品中加入1/10体积的2mol/L NaAc（pH4.0），然后加入等体积的异丙醇在-20℃条件下放置30分钟。②4℃条件下10000g离心15分钟沉淀用适当体积的1mmol/L EDTA溶解。③重复以上步骤④用70℃乙醇洗一遍，真空抽干沉淀溶于无RNase污染的水中。
从紫外吸收值的大小可以比较精确地推算出RNA的量的多少，A260为1时相当于RNA浓度为37?g/ml在胶上看RNA的泳动情况似乎更加直观些，植物总RNA同其他真核细胞总RNA一样总是富含两种核糖体RNA一种是28S rRNA，另一种是18S rRNA这两种rRNA在变性胶上的泳动位置分别大致相当于5.1kb和2.0kb的位置，它们不但可以作为分子量大小的标准还可鉯作为判断RNA样品完整性的标准。一般来说经溴化乙锭染色后，如果28S rRNA条带亮度大约为18S rRNA条带的两倍那么说明这个RNA样品比较完整，没有发生哆少降解；如果亮度的比例倒过来了就说明28S rRNA已部分降解成一种近似于18S rRNA的分子了，这样的RNA样品}