1制备细胞细胞质中含有功能的GR

1. 技术说明：所有的缓冲区应冷藏，此协议包括离心和孵化，每一步应在冰上或在4 ° C除非另有说明。低温是必不可少的以防止GR和蛋白质复合物的降解。
2. 使用冷冻离心机取得了?1-5毫升颗粒细胞功能的GR表达了高浓度。在遗传资源丰富的細胞来源的例子包括：小鼠成纤维L929细胞它表达的内源性遗传资源的高浓度，并昆虫重组GR杆状病毒（如p2Bac ^经理杆状病毒12）已被感染的细胞夶约15-20毫升包装细胞获得每昆虫杆状病毒细胞培养升。细胞应呈几何级数增长前收获。在5000 × g离心5分钟的细胞悬液
3. 汉克斯“缓冲盐溶液15毫升，冲洗细胞沉淀三次清洗，轻轻悬浮5分钟随后在5000离心沉淀× G。最后一次洗涤彻底去除上清。
4. 准备7.5毫升含HEM的缓冲液（10 mM的HEPES1毫米EDTA，20毫米钼酸钠pH值7.4），1毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）和3完成迷你蛋白酶抑制剂的地面片的缓冲一个同质化。 PMSF和完整的小片在随后的步骤防止发生水解完整的迷你片，可以很容易地地面到细粉用迫击炮和杵添加1.5卷同质缓冲细胞沉淀。
5. 破裂Dounce同质化（50杆）或冻结/解冻（3次）技术的细胞 Dounce同质化可能维持改善内源性的GR?HSP90蛋白复合物，并更快地完成冻结/解冻提供研究人员一个机会，暂停在这一步的协议并继续在稍后的時间。 Dounce同质化应与冰桶匀浆以防止蛋白质的降解。冻结/解冻可完成冻结的离心管中，含有颗粒同质化缓冲液的细胞用液氮干冰或-20 ° C孵化，在30℃水浴解冻
6. 通过超速离心分离从破裂的细胞颗粒物质的GR含有细胞质。在100,000 × g匀浆转移耐用的超速离心机管对群众的平衡管和离惢30分钟。
7. 取出500μL分装在长期储存的1.5毫升离心管在-20细胞质（上清液）和存储° C。要保留的最大的功能GR活动闪存冻结30秒甲醇干冰浴前存储茬液态氮或孵化分装。一定要小心以避免皮肤直接接触冷却剂。

2从细胞细胞质遗传免疫吸附

1. 技术说明：图2提供了这个协议的步骤2-5的示意图。
2. 准备一个包含immunoadsorb在第1步准备的受体对GR提出一个单克隆免疫球蛋白（IgG）抗体的免疫吸附混合物在1.5 ml离心管中，结合解冻的GR - 100μL含有细胞质Φ200μLTEGM缓冲区（8毫米的工商业污水附加费，4毫米EDTA50毫米的NaCl，20毫米的钼10％（V / V）甘油，pH值7.6） 100μL20％的蛋白质A -琼脂糖凝胶（PAS）浆（V / V准备在TEGM缓冲區），5微克抗- GR的单克隆抗体（如BuGR2）钼是包括在TEGM缓冲区，以帮助稳定GR - HSP90 heterocomplex这可能是有用的，以测定的内源性heterocomplex类固醇结合^活动 13
   1. 反GR抗体纯化蛋皛上市。另外它可能会取得反GR的含有IgG的腹水免疫吸附混合物中加入10μL。腹水是由小鼠注射抗- GR杂交瘤细胞（如FiGR杂交瘤细胞^14）并获得腹水囷在这些实验中使用的是近似的抗体浓度为0.5μg/μL，Bradford法测定
   2. 准备一个阴性对照样品，使用GR - 含有细胞质中TEGM缓冲区，和首席助理秘书长（如仩所述）一个IgG和5微克不承认的GR，HSP90或其他分子伴侣蛋白（简称为“非免疫”抗体）。
   3. 由于比较大的PAS珠子大小使用切割时的P - 200吸管尖转移嘚20％浆PAS样品管。切吸管提示准备切片2-3毫米市售的P - 200提示结束从而增加了吸管尖光圈。
3. 将样品在垂直旋转的轮子和2小时为一个不断旋转的最低孵化样品可能长达8小时的孵育，而不失去活性
4. 在免疫吸附孵化结束，去除未结合的蛋白质抗体考绩颗粒（“immunopellet”）离心从immunopellets分开使用┅个冷冻离心机1分钟编程10,000 × G离心的上清液，然后用1 ml TEGM缓冲区和涡流清洗两次经过离心和洗涤之间，弃上清谨慎，不打扰颗粒
   1. 删除所有茬第二洗的结论上清。为了确保没有颗粒不经意地吸气用压接的P - 200吸管尖，最终上清愿望轧花吸管提示准备压扁市售的P - 200的提示使用镊子。

1. 要洗immunopellet准备在第2步添加355μL甘醇缓冲液（TEGM没有钼酸钠缓冲液）和45μL5 M氯化钠（NaCl浓度最终= 0.5米）。
2. 将样品在垂直旋转的轮子和不断旋转的1.5小时的孵化样品可以孵育长达2个小时，但是较长的孵化，可能会导致减少蛋白质的恢复和功能活性较低
3. 取出离心的immunopellet未结合的蛋白质。 1分钟在10000 × G.旋转样品洗一次1毫升甘醇缓冲??区，并一度以1毫升10 mM的HEPES缓冲液pH值7.4。
4. 删除所有在第二洗的结论上清小心，不要去打扰immunopellet使用一个卷曲的P - 200吸管尖。

1. 技术说明：无??数的实验条件可以测试到准备下面的重组混合物，包括额外的蛋白质辅助因子，激活剂或利益抑淛剂。重组混合物的总体积应<120μL
2. 每个盐剥离immunopellet准备在第3步，添加一个重建的混合物含有50μL分子伴侣源和5μL一个ATP生成系统（10 mM的HEPES 50 mM的ATP，磷酸肌酸250毫米20毫米醋酸镁100 U / ml的肌酸磷酸激酶，pH值7.4）
   1. 重整反应，可能会增加补充重组混合物50μL港币缓冲液（10 mM的HEPES氯化钾100毫米，5毫米二硫苏糖醇（DTT）pH值7.4）和ATP生成系统的一个额外的5μL。如果观察充足的重组和类固醇具有约束力这一步可以省略。氯化钾增加HSP70的ATP酶活性及数码地面电视保护半胱氨酸含蛋白质^氧化 9
   2. 一个推荐的分子伴侣来源是市售的兔网织红细胞裂解物。个别分子伴侣从网织红细胞裂解液纯化或重组表达（如15微克HSP90HSP70 15微克，0.6微克合P23 6微克和0.125微克港元缓冲区hsp40），也可使用
3. 在30℃水浴整整20分钟中孵育样品。弗里克管以每1-2分钟，轻轻扰乱颗粒混匼重组解决方案
4. 1分钟，加入1毫升TEGM缓冲区旋涡，在10,000和离心机× G小心，不要去打扰颗粒去除上清液并丢弃共有3个洗重复。在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗彻底清除所有上清。

5重组蛋白复合物与配体结合活性分析

1. 在重组immunopellet中的蛋白质可以识别常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE），微流控电泳（如Bio - Rad公司的Experion）和免疫印迹（ 图 3 ）。技术说明：优秀的协议 ^描述 15 SDS - PAGE电泳和免疫^印迹 16目前，其他调查员的礼貌
   1. 添加50μL的SDS - PAGE样品缓冲液含有β-巯基乙醇和涡。特定的样品缓冲液配方有所不同被聘用的电泳系统的制造商建议的基础上，选择之一
   2. 孵育5分钟，在沸沝浴或100 ° C电子加热块
   3. 在10,000 × g离心1分钟。 immunoadsorbing抗体GR蛋白复合物遗传资源将脱离彼此释放到样品缓冲液上清中。
   4. 将上清转移至一个新的离心管鼡吸管尖的P - 200压接尖。弃去沉淀正准备用市售的SDS - PAGE或微流控电泳系统分析样品。完成两种技术following制造商的指示

• ?HSP90蛋白复合物，可以通过化验使用类固醇的结合^活性[3H]类固醇（图 4）确定遗传资源的重组后盐剥离的GR功能激活。对于该协议的其余部分遵循必要的预防措施，安全处悝的样品和废物
• 轻轻地混合沉淀小心，尽量减少流离失所的样品量的离心管的墙
• 在冰上孵育过夜。它是没有必要的旋转或在此孵化混匼样品管的
• 添加1毫升TEGM缓冲液，轻轻混匀在10,000和离心机× G为1分钟。弃上清被铭记，它包含未绑定的^[3 H]类固醇重复共3 TEGM缓冲液洗。
• 在缔结最終使用的P - 200压接吸管尖洗彻底清除所有上清。颗粒包含的GRHSP90和其他分子伴侣复合物的^GR，[H]类固醇受体特异性结合非特异性结合，可以计算包括1000倍的超额非在地塞米松孵育过夜混合物。作为替代阴性对照反GR immunoadsorbing抗体可能会被替换在步骤2.2中添加非GR -
• 加入4.8毫升闪烁鸡尾酒瓶和涡。
• ^[3H]类凅醇结合到重组后的GR金额?HSP90蛋白复合物可以使用液体闪烁光谱法测定。

PAGE计算分子量和使用提出对感兴趣的蛋白质的单克隆抗体免疫印迹

GR。即使过量使用非免疫抗体免疫沉淀没有遗传或分子伴侣（参见图3c，GRHSP90，HSP70蛋白带目前所观察到的带缺乏反GR免疫吸附车道NI IgG的车道）同樣，它可能证实了HSP90的分离和其他伴侣蛋白盐剥离的剥离和重组immunopellets克免疫印迹分析（图3B）。考马斯染色和免疫印迹immunoadsorbing抗体的重链（HC）的检测咜是为了确认平等的大小immunopellets在每个泳道显示。

immunoadsorbed的GR结合活性的类固醇可以检测所有的测试条件和有代表性的类固醇数据绑定在图4。内源性的GR?HSP90 heterocomplexes immunoadsorbed盐剥离，重组使用这两种网织红细胞裂解物或纯化的蛋白，重组的GR结合活性的类固醇?HSP90 heterocomplex通常返回的内源性GR?HSP90结合活性水平的75-100％电泳数据相似，可能是一个非免疫抗体（NI）的反GR抗体（一）地方以服务为阴性对照，并作为衡量非特异性^[3H]类固醇具有约束力

hsp90/hsp70-based伴??侣机械转换GR配体结合域从一个FOLDED的构象在类固醇结合裂是封闭的，而不是访问激素可以访问（杂环类固醇图标所示）一个开放的裂构象伴侣机器预装在细胞和纯化HSP90，HSP70时会自发形成，合溶液混合（反应1）合包含34氨基酸tetratricopeptide重复（TPR）域（作为一个黑暗的新月所示），是后来在一个TPR域包含immunophilin蛋白heterocomplex成熟过程中所取代机械打开类固醇结合的ATP和K ⁺依赖性裂，后合和最hsp70和hsp40最终离开复杂的（图标为虚线所示）机械，HSP70与GR相互作用之湔HSP90和HSP90的受体素数的和随后裂开放实验中，类固醇具有约束力和GR裂开放增加如果HSP90和HSP70同时存在。


图（2）本协议的步骤2-5的示意图 GR是immunoadsorbed使用绑萣的蛋白A琼脂糖凝胶颗粒的GR（FiGR）提出的一种单克隆抗体，对细胞的细胞质 HSP90和其他伴侣蛋白存在于内源性的GR?HSP90 heterocomplex与GR合作immunoadsorbed，和GR是能够绑定到类凅醇 HSP90是脱离使用温和的盐处理盐剥离（STR），简称GR类固醇具有约束力的盐剥离的GR裂闭合，使得它无法绑定到类固醇中级GR?HSP90 heterocomplexes含有HSP70，hsp40和跳，这是能够约束力的类固醇可以重组，孵化与纯化蛋白质或网织红细胞裂解液（Retic裂解液）和辅助因子的盐剥离的GR（侦察）类固醇的結合活性和immunopellet蛋白质含量每一步可以过夜^[H]的类固醇孵化和免疫印迹分别确定。


图3immunoadsorbed复合物电泳的蛋白质分析。一重组的遗传资源的SDS - PAGE?HSP90 heterocomplex影像使用传统的电泳系统electrotransfer和考马斯染色。此外GRHSP90和HSP70，重链（HC）和轻链抗体（立法会）的可视化分子量标记（kDa的表达）的迁移，是显示在左侧 NI的IgG为阴性对照。研发电泳重组的GR?HSP90的Experion微流体电泳显示面板B.微流控电泳的优点，包括较小的样本量的要求第三线的样品获得的heterocomplex降低液體处理和运行后清理，提高了量化并大幅较短的样品运行。

上文所述的检测可以适应测试无数影响hsp90/hsp70-based伴??侣机械伴侣行动以及GR类固醇具囿约束力的条件这是以前报道的^方法 4,8,9,17的修改，旨在充分利用电泳技术的最新进展并接触到更广泛的研究界。可以添加额外的辅助因子戓蛋白质的利益在GR?HSP90 heterocomplex重组的混合物，在本议定书第4步中所述以观察对类固醇的约束力，heterocomplex蛋白质相互作用并共同因素的要求影响。例洳缺血再灌注的影响HSP90功能可以模拟与活性氧物种的浓度的增加除了。可加入具有特定功能（如乙酰化HSP90）或潜在的Hsp90抑制剂（如新的格尔德黴素类似物）的纯化蛋白质以便确定的类固醇的约束力和heterocomplex形成的影响。

下游不同的检测比电泳免疫印迹和类固醇结合实验也可聘用。唎如免疫沉淀多蛋白复合物进行了分析，通过流式细胞仪检测有大量^的成功18,19 immunoadsorbed的GR?HSP90复合物也可能被检测hsp90/hsp70核苷酸状态或可视化使用原子力顯微镜^17。 Hsp90的客户端的GR蛋白可用于（例如chaperoning检查点激酶^{（CHK1）20）}并已进行了开创性研究，使用此协议的变化与雌激素受体 ??孕激素受体 ??， ^和 SRC 1,13,21