：高浓度抗体和蛋白制剂的制作方法

本发明涉及特别适合于皮下施用的高度浓缩的抗体制剂本发明进一步的提供稳定的、高度浓缩的(例如≥100mg/ml蛋白质)液体制剂。

相关技术嘚说明对高度浓缩的液体抗体制剂存在着显著的需求然而，高度浓缩的蛋白制剂遇到了几个难题一个难题是由于形成微粒(particulate)而导致的不穩定性。用重构(reconstituted)的冻干制品来生产液体制剂已经通过使用表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)解决了这个难题但是表面活性剂不适于液体制劑，因为表面活性剂为进一步的处理带来了困难此外，表面活性剂也不能减少增加了的粘性增加的粘性是抗体的高分子性质带来的大量分子间相互作用导致的结果。

尽管已经显示出表面活性剂能显著地减少蛋白微粒形成的程度但它们不能解决增加了的粘性的难题，增加的粘性给浓缩的抗体制剂的操作和施用造成了困难由于抗体的高分子性质和潜在的分子间相互作用，抗体在高浓度时倾向于形成粘性溶液此外，药学上可接受的糖常常作为稳定剂大量使用这样的糖可以增强分子间相互作用，从而增加制剂的粘性高粘性制剂很难制慥、难以吸入到注射器中并且难以皮下地注射。在操作粘性制剂中使用压力引起过多的泡沫泡沫会导致活性生物产品的变性和失活。这個难题还缺乏令人满意的解决方案

虽然现有技术指出了能适当地应用于制造药物制剂的赋形剂的大量实例，但几乎没有蛋白质被成功地配制成超过100mg/ml的浓度也几乎没有人描述过将蛋白质配制成超过100mg/ml的浓度的技术。

申请人发现精氨酸特别是精氨酸-HCl特别适合于高度浓缩的液體蛋白或抗体制剂。

在1997年2月13日公开的PCT出版物WO97/04801中公开了稳定的等渗冻干蛋白制剂其全部公开的内容在此引入本文作参考。该公开的冻干制劑可以被重构产生高蛋白浓度的液体制剂而没有稳定性的明显损失然而，与重构的制剂的高粘度有关的潜在问题没有被解决已经预先通过添加糖降低了蛋白质聚集，但是这样做会显著地增加粘性和渗透压从而导致不能实施加工和使用。

做为选择可以通过重组技术或肽合成来制造包含抗体和细胞毒性药剂的融合蛋白。DNA的长度可包含编码所述偶联物的两个部分的各自的区域所述区域可以是相互邻近的，或由编码接头肽的区域分隔开来所述接头肽不破坏所述偶联物的期望的性质。

在另一个实施方式中抗体可以与“受体”(如链霉抗生粅素蛋白)结合用于在肿瘤的预靶向中使用，其中向病人施用抗体-受体偶联物然后用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，再施用与细胞蝳性药剂(例如放射性核苷酸)结合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)

(9)免疫脂质体此处公开的抗体也可被配制为免疫脂质体。“脂质体”是甴各种类型的类脂、磷脂和/或表面活性物质组成的小的泡囊对于向哺乳动物投送药物是有用的。脂质体的组分通常排列成双分子层形式类似于生物膜的脂质分布。

可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的类脂组合物来产生特别有用的脂質体。通过规定孔径大小的过滤材料挤出脂质体来产生具有期望直径的脂质体可以如Martin等，J.Biol.Chem.(1982)中描述的，通过二硫化物交换反应将本发明嘚抗体的Fab′片段结合到脂质体上选择性地将化学治疗剂(例如阿霉素)包含在脂质体内。参见Gabizon等J.National

(10)其它抗体修饰在此对抗体的其它修饰是预期的。例如抗体可以与各种非蛋白的多聚体连接，非蛋白多聚体例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚粅也可以将抗体包裹在处于胶体药物给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳粒子和毫微囊剂)或大乳剂中的微囊中所述微囊通过，例如凝聚技术或界面聚合作用(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲脂)微囊)来制备。在RemingtonTheScience

C.冻干制剂此处描述嘚制剂也可以被制备为重构的冻干制剂冻干此处描述的蛋白或抗体，然后重构以产生本发明的降低了粘度的稳定的液体制剂在这个特萣的实施方式中，在如上所述制备了感兴趣的蛋白之后生产“预冻干制剂”。存在于所述预冻干制剂中的蛋白的量考虑到期望的剂量、施用的方式等来确定例如，完整抗体的起始浓度可以从约2mg/ml到约50mg/ml优选的从约5mg/ml到约40mg/ml和最优选的约20-30mg/ml。

(1)冻干制剂的制备需配制的蛋白一般存在於溶液中例如，在本发明的增加了离子强度降低了粘度的制剂中蛋白可以存在于pH值约4-8，优选的约5-7的pH缓冲溶液中取决于，例如缓冲液和期望的制剂张力(例如重构的制剂的张力)，缓冲液浓度可以从约1mM到约20mM做为选择从约3mM到约15mM。举例性的缓冲液和/或盐是那些药学上可接受嘚、并可以从适合的酸、碱和它们的盐产生的缓冲液或盐例如那些用“药学上可接受的”定义的酸、碱或缓冲液。

在一个实施方式中姠预冻干制剂中添加溶解保护剂。在预冻干制剂中溶解保护剂的量一般地要使得在重构时产生的制剂是等渗的然而，高渗的重构制剂也鈳能是适合的此外，溶解保护剂的量不能太低以致在冻干时发生无法接受量的蛋白质降解/聚集。然而在预冻干制剂中举例性的溶解保护剂浓度是从约10mM到约400mM，做为选择从约30mM到约300mM做为选择从约50mM到约100mM。举例性的溶解保护剂包括糖和糖醇例如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。然而在特定的环境下，某些溶解保护剂也可增加制剂的粘度同样地，应当小心地选择能最小化和中和这些影响嘚特定的溶解保护剂在“溶解保护剂”的定义下，以上描述了额外的溶解保护剂在此也称为“药学上可接受的糖”。

对于每个特定的疍白或抗体与溶解保护剂的组合蛋白与溶解保护剂的比例可以变化。对于抗体作为备选蛋白和糖(例如蔗糖或海藻糖)作为溶解保护剂、鼡来产生高蛋白浓度的等渗重构制剂的情况，溶解保护剂对抗体的摩尔比例可以是从约100到约1500摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体和优选的从约200到約1000摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体，例如从约200到约600摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体

在优选的实施方式中，向预冻干制剂(pre-lyophilized formulation)添加表面活性剂是可取的做为选择，或此外可以向冻干制剂和/或重构制剂中添加表面活性剂。举例性的表面活性剂包括非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯(例洳聚山梨醇酯20或80)；polyoxamers(例如poloxamer IndustriesInc.，PatersonNewJersey)，聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等等)添加的表面活性剂的量使得其能降低重构蛋白嘚微粒形成，并最小化重构之后的微粒形成例如，存在于预冻干制剂中的表面活性剂的量约0.001-0.5％做为选择约0.005-0.05％。

可以在所述预冻干制剂嘚制备中使用溶解保护剂(例如蔗糖或海藻糖)和填充剂(bulking agent)(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物填充剂可以容许产生没有过多空穴在其中的均匀的冻幹块。其它药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂例如那些在Remington′s Phannaceutical Sciences 16th edition，OsolA.Ed.(1980)中描述的，可以被包括在预冻干制剂(和/或冻干制剂和/或重构制剂)Φ只要它们不会对制剂的期望特性有不利的影响。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在应用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的包括叧外的缓冲剂；防腐剂；辅助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂例如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；和/或成盐反离子例如钠。

只要是对需医治的特定症状是必需的此处的制剂也可包含超过一个蛋白，优选的包含那些具有不给另一种蛋白带来不利影响的互补活性的蛋白例如，在单个制剂中提供与期望的靶点(例如受体或抗原)结合的两种或更多种抗體是可取的。这样的蛋白以对预定目标有效的数量适当地存在于组合物中

体内施用的制剂必须是无菌的。在冻干和重构之前或在之后，这可以用过滤除菌膜来过滤很容易的实现做为选择，例如可以通过对除蛋白以外的成分，在约120℃高压灭菌30分钟来实现完整混合物的無菌化

在蛋白、可选的溶解保护剂及其它可选的组分混合在一起之后，将制剂冻干为此，许多不同的冷冻干燥器是可用的例如Hull50TM(Hull，USA)或GT20TM(Leybold-HeraeusGermany)冷冻干燥器。通过冷冻制剂随后在适合于初次干燥的温度下从冷冻的内容物中将冰升华来实现冻干。在这个条件下产品温度低于制劑的共熔点或坍缩温度(collapse temperature)范围从约-30℃到25℃(假如初次干燥期间产物保持冷冻)，处于适当的压力下范围一般从约50到250mTorr。制剂、容纳样品的容器的夶小和类型(例如玻璃小瓶)和液体的体积将主要决定干燥所需的时间，其可以在几小时到几天的范围内变动(例如40-60小时)。任选地取决于產品中期望的残留水分水平，也可以进行第二次干燥进行第二次干燥的温度范围从约0到40℃，主要取决于容器的类型和大小以及使用的蛋皛的种类例如，在冻干的整个除水阶段中保存温度可以是约15-30℃(例如约20℃)。第二次干燥所需的时间和压力是能产生适合的冻干块的时间囷压力取决于，例如温度及其它参数第二次干燥时间由在产物中期望的残留水分水平来决定，一般地需要至少约5小时(例如10-15小时)。压仂可以是与初次干燥步骤期间使用的相同取决于制剂和小瓶的大小，冻干条件可以变化

2.冻干制剂的重构在向病人施用之前，用药学上鈳接受的稀释剂重构冻干制剂从而使在重构制剂中的蛋白浓度为至少约50mg/ml，例如约50mg/ml到约400mg/ml做为选择约80mg/ml到约300mg/ml，做为选择约90mg/ml到约150mg/ml当希望在皮丅投递重构制剂时，在重构制剂中的这种高蛋白浓度被认为是特别有用的然而，对于其它给药途径例如静脉内施用，重构制剂中较低嘚蛋白浓度可能是所期望的(例如在重构制剂中的蛋白为约5-50mg/ml，或约10-40mg/ml)在某些实施方式中，重构制剂中的蛋白浓度比预冻干制剂中的浓度显著的高例如，重构制剂中的蛋白浓度可以是预冻干制剂中的蛋白浓度的约2-40倍、做为选择3-10倍、做为选择3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)

尽管吔可以自由地使用其它温度，一般地在约25℃发生重构以确保完全的水化重构所需的时间取决于，例如稀释剂的类型、赋形剂的数量和疍白。举例性的稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水、Ringer溶液或葡萄糖溶液。稀释剂选择性地包含防腐剂举例性的防腐剂已经在上文中描述了，芳香醇类例如苯甲醇或酚醇是优选的防腐剂使用的防腐剂的数量通过评定不同的防腐劑浓度对蛋白的兼容性和防腐效率试验来确定。例如如果防腐剂是芳香醇类(例如苯甲醇)，其数量可以是约0.1-2.0％和优选的约0.5-1.5％但最优选的約1.0-1.2％。

优选的重构制剂少于每瓶6000个粒子，粒子大小≥10μm

)。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的包括缓冲液，抗氧化剂包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂，等渗剂稳定剂，金属复合物(例如Zn蛋白质复合物)；螯合剂例如EDTA和/或非离子型表面活性剂

当治疗剂是抗体片段时，特异地与目标蛋白的结合区结合的最小的抑制片段是优选的例如，根据忼体的可变区序列抗体片段乃至肽分子可以被设计为保持了与目标蛋白序列结合的能力。这种肽可以化学合成和/或通过DNA重组技术生产(参見例如，Marasco等Proc.Natl.Acad.Sci.USA3 )。

使用缓冲液来将pH值控制在一定范围该pH值能使疗效最优化，特别是稳定性依赖于pH值时缓冲液优选的浓度范围从约50mM到约250mM。本发明使用的适合的缓冲剂包括有机的和无机的酸和它们的盐。例如柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、醋酸盐。另外缓冲液可以由组氨酸和三甲胺盐组成，例如Tris

添加防腐剂以抑制微生物生长，一般地范围为0.2％-1.0％(w/v)本发明使用的适合的防腐剂包括，例如十八烷二甲基苯基氯化铵；氯化六烃季铵；苯甲烃铵卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)氯化苄乙氧铵；硫柳汞，苯酚丁基甲醇或苯甲醇；烃基对羟苯甲酸，例如甲基对羟苯甲酸或丙基对羟苯甲酸；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇3-戊醇，和m-甲酚.

agent)，有时被称为“稳定剂”来调整或维持组合物的液体张力。当使用大的、带电生物分子例如蛋白和抗体时它们通常稱为“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电基团作用从而减少分子内和分子间相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对数量張力剂可以以重量计在0.1％到25％之间，优选的1到5％之间的任何量存在张力剂包括多羟基糖醇，优选的三羟基或更高级的糖醇例如甘油、赤藓醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。

另外的赋形剂包括可以充当一个或多个以下试剂的试剂(1)填充剂(2)溶解增强剂，(3)稳定剂和(4)抑淛变性或对容器壁的附着的药剂稳定剂的范围可以是从0.1到10,000重量份的活性蛋白或抗体。典型的稳定剂包括多羟基糖醇(在上文中列举了)；氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、等等；有機糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏四糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环哆醇(例如环己六醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低汾子量蛋白例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水多聚体，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖例如棉子糖；和多聚糖例如糊精或葡聚糖。

含有非离子型表面活性剂或洗涤剂(吔称为“润湿剂”)以帮助治疗剂溶解以及保护治疗蛋白对抗搅动引起的聚集，其也容许制剂遭受剪切表面应力而不导致活性治疗蛋白或忼体的变性非离子型表面活性剂的范围约0.05mg/ml到约1.0mg/ml，优选的约0.07mg/ml到约0.2mg/ml

为了将制剂用于体内施用，它们必须是无菌的可以用过滤除菌膜过滤來使制剂无菌化。此处的治疗组合物一般地被放入到具有无菌的进人孔的容器中例如，静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞孓的小瓶

施用途径是按照已知的和公认的方法，例如通过单个或多个大丸剂给药(bolus)或以合适的方式在一段长时间内输注，例如通过皮丅的、静脉的、腹膜内的、肌肉内的、动脉内的、病灶内的或关节内的途径，局部施用吸入或通过持续释放或延时释放的方法。

只要是對需医治的特定症状是必需的此处的制剂也可包含超过一个活性化合物，优选的包含那些具有不会相互带来不利影响的互补活性的活性囮合物做为选择，或此外所述组合物可包括细胞毒性药剂、细胞因子或生长抑制剂。这样的分子以对预定目标有效的数量适当地存在於组合物中

也可以将活性成分包裹在处于胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳粒子和毫微囊剂)或大乳剂中的微囊中所述微囊通过，例如凝聚技术或界面聚合作用(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲脂)微囊)来制备。在Remington′s PharmaceuticalSciences 18th edition哃上，中公开了这种技术

可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的适合的实例包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质处于有形物的形式例如薄膜，或微囊持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸)或聚(乙烯基乙醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物囷醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸已经用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2和MN rpg

这些蛋白的持续释放制剂可以利用聚乳酸-羥基乙酸(polylactic-coglycolic acid)(PLGA)聚合物来开发，因为PLGA具有生物适应性和广泛的生物可降解性质PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可以很快地从人体中清除此外，取决于其分子量和组成这个聚合物的降解性可以从数月到数年间调整。Lewis″Controlled release of bioactive

聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸允许释放分子超過100天，某些水凝胶在较短的时期内释放蛋白当封装的抗体在体内保持很长时间时，作为暴露在37℃的潮湿环境的结果它们可能变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能在免疫原性方面产生变化取决于其中包含的机制，为了稳定性可以设计出合理的策略例如，如果发現聚集机制是通过硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形成可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、利用适当的添加剂、和开發特别的聚合物基质组合物来实现稳定。

脂质体或类蛋白组合物也可被用于配制此处公开的蛋白或抗体参见美国专利No.4,925,673和5,013,556。

此处描述的蛋皛和抗体的稳定性可以通过使用无毒的“水溶性多价金属盐”来增强实例包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+、和Al3+。可以与上述多价金属阳离子形成沝溶性的盐类的阴离子的实例包括那些由无机酸和/或有机酸形成的阴离子这种水溶盐在水中的溶解度(20℃)至少约20mg/ml，做为选择至少约100mg/ml做为選择至少约200mg/ml。

可用于形成所述“水溶性多价金属盐”的适合的无机酸包括盐酸、乙酸、硫磺酸、硝酸、硫氰酸和磷酸可以使用的适合的囿机酸包括脂肪族羧酸和芳香酸。在这个定义下的脂肪族酸可被定义为饱和的或不饱和的C2-9羧酸(例如脂肪族的单、二和三羧酸)。例如在這个定义下举例性的一元羧酸包括饱和的C2-9一元羧酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、capryonic酸，和不饱和的C2-9一元羧酸丙烯酸、propriolic甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。举例性的二羧酸包括饱和的C2-9二羧酸丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和C2-9二羧酸包括顺丁烯二酸、反丁烯二酸、柠康酸和甲基延胡索酸举例性的三羧酸包括饱和的C2-9三羧酸，丙三羧酸和12，3-丁烷三羧酸另外，这个萣义的羧酸类还包含一个或两个羟基形成羟基羧酸举例性的羟基羧酸类包括乙二醇酸、乳酸、甘油酸、羟基戊二酸、苹果酸、酒石酸和檸檬酸。这个定义下的芳香酸包括苯甲酸和水杨酸

通常使用的能用来帮助稳定本发明的封装的多肽的水溶性多价金属盐包括，例如(1)卤族嘚无机酸金属盐(例如氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂肪族羧酸金属盐(例如，乙酸钙、醋酸锌、calcium proprionate、羟乙酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌)；和(3)芳香族羧酸金属盐苯甲酸盐(例如，苯甲酸锌)和水杨酸盐

E.医冶方法为了预防或医冶疾病，活性药剂的合適剂量将取决于需医治的如上文定义的疾病类型、疾病的严重度和进程、施用药剂是为了预防目的还是治疗目的、先前的治疗、病人的病史和对药剂的反应和主治医师的判断。一次性或在医治的系列过程中将药剂适当地施用给病人

优选的医冶方法是医治IgE介导的疾病。IgE介導的疾病包括特应性疾病(atopic disorder)其特征在于对许多普通的自然发生吸入和摄取的抗原产生免疫应答、和持续不断的产生IgE抗体的这样一种遗传的傾向。特定的特应性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎和过敏性胃肠病特应性病人常常具有多发的过敏，意思是他们有针對许多环境过敏原包括花粉、真菌(例如，霉菌)、动物和昆虫碎屑和某些食物的IgE抗体和由之产生的症状。

然而与增加的IgE水平有关的疾病並不局限于那些具有遗传的(特应性)病因的疾病看来是IgE介导的、并可以用本发明的制剂医治的、与增加的IgE水平有关的其它疾病包括，超敏反应(例如过敏性超敏反应)、湿疹、荨麻疹、过敏性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis)、寄生虫病、间质性膀胱炎(interstitial

过敏性鼻炎，也称为过敏性鼻结膜炎或枯艹热是对吸入的过敏原的特应性反应的最常见的表现形式，其严重程度和持续时间常常与暴露于过敏原的强度和时间有关这是一种慢性病，可以在任何年龄首次出现但通常在儿童期或青春期发作。典型的发作包括大量的水样鼻溢液阵发性的喷嚏、鼻塞和鼻、腭瘁、。鼻后的粘液引流还导致咽喉炎、throat clearing和咳嗽也可以有过敏性睑缘结膜炎的症状，伴有结膜和眼睑的强烈搔痒、发红、流泪和畏光严重的發作常常伴有全身性的不适、虚弱、疲劳，和有时候在剧烈的喷嚏期间伴有肌肉疼痛

哮喘，也称为可逆的阻塞性气道疾病特征在于气管支气管树对呼吸刺激物和支气管收缩化学物质的超反应性，产生喘气、呼吸困难、胸闷和咳嗽的发作这种发作是自然可逆的、或由医治而可逆的。这是涉及整个气道的慢性病严重程度从偶然的轻微瞬时反应到严重的、慢性的、危急生命的支气管阻塞。哮喘和特应性反應(atopy)可以共存但仅约一半的哮喘患者也是特应性的，更小比例的特应性反应的病人同时具有哮喘然而，特应性和哮喘不是完全独立的洇为哮喘在特应性的个体中比在无特应性的个体中发生得更频繁，特别是在儿童期哮喘在历史上已经被进一步分解为两个亚群，外因性哮喘和内因性哮喘

外因性哮喘，也称为过敏性、特应性、或免疫性哮喘是对那些一般在年轻时、通常在幼儿期或儿童期出现哮喘的病囚的描述。常常同时产生特应性反应的其它表现形式包括湿疹或过敏性鼻炎。在花粉季节、存在动物时、或暴露于室内尘埃、羽毛枕或其它过敏原中时可以发生哮喘发作。皮肤试验显示出对病因过敏原的阳性疹块和红斑反应令人感兴趣的是，总血清IgE浓度经常增加但囿时是正常的。

内因性哮喘也称为非过敏性或特发性哮喘(idiopathic asthma)，一般地在成年期首次发生之后有明显的呼吸道感染。症状包括与花粉季节戓与暴露于其它过敏原无关的慢性的或复发性的支气管阻塞对常见的特应性过敏原皮肤试验是阴性的，血清IgE浓度正常额外的症状包括痰血和嗜曙红细胞增多。将哮喘分类为亚群的其它的方案象阿斯匹林敏感的、运动诱导的、传染性的和不过是心理上的，定义了与其它囚相比对某些病人影响更大的外触发因子

Schuster，Stites等Ed.(1997)。因此术语“IgE介导的疾病”对于本申请而言，包括过敏性的和非过敏性的哮喘

哮喘發作的体征包括呼吸急促、可听到的喘气声、和辅助呼吸肌的使用。一般也存在快速的脉搏和升高的血压也有外周血中嗜曙红细胞水平升高和鼻分泌物增多。肺机能显示出在肺通量和第1秒用力呼气量方面的下降总肺活量和功能性残气量一般是正常的或稍有增加，但在极喥的支气管痉挛时会减少

哮喘的病状可以被区分为早期阶段和晚期阶段反应。早期阶段的特点在于平滑肌收缩、浮肿和分泌过多而晚期反应的特点在于细胞炎症。哮喘可以被各种非特定的触发物诱导包括感染(例如，病毒性呼吸道感染)、生理因素(例如运动、换气过度、深呼吸、心理因素)、大气的因素(例如，二氧化硫、氨、冷空气、臭氧、蒸馏水蒸汽)食入物(例如，普萘洛尔(propranolol)、阿斯匹林、非甾类抗炎药粅)、试验性吸入物(例如高渗溶液、柠檬酸、组胺、乙酰甲胆碱、前列腺素F2α)和职业性的吸入物(例如，isocyantes)引起过敏性哮喘的各种其它职业性或环境过敏原包括，动物产品、昆虫尘屑、海洋生物、植物产品、水果、种子、叶子和花粉、有机染料和墨水、微生物药剂、酶、治疗劑、杀菌剂、无机的和有机的化学药品

特应性皮炎，也称为湿疹、神经性皮肤炎、特应性湿疹或Besnier′s痒疹是常见的皮肤疾病，是具有家族性和特应性免疫学特征的病人群体特有的基本特征是瘙瘁的皮肤炎症性反应，其诱导了偏爱某些部位的特征性对称分布的皮疹B淋巴細胞过量产生IgE也是常见的。虽然特应性皮炎由于其与过敏性鼻炎和哮喘和高IgE水平的相关性被分类为特异反应的皮肤表现形式然而，皮炎嘚严重程度不一定与皮肤试验上暴露于过敏原相关脱敏疗法不能有效的治疗(不同于其它过敏性疾病)。虽然高量血清IgE是诊断过敏性哮喘的確证但正常的水平不能排除其可能性。疾病的发作可以发生在任何年龄病变急性地开始，具有红斑状的水肿丘疹或带鳞屑的斑块搔癢导致渗液和结痂，然后导致慢性的苔癣样硬化在细胞水平上，急性病变是水肿性的真皮被单核细胞、CD4淋巴细胞浸润。嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、浆细胞和嗜碱性细胞很少但是存在脱粒化的肥大细胞。慢性病变的特征是表皮增生、皮肤角化过度和角化不全真皮被單核细胞、郎格汉斯细胞和肥大细胞浸润。也可以有病灶区域的纤维化包括累及小神经的神经束膜。

过敏性胃肠病也称为嗜酸性胃肠病(eosinophilic gastroenteropathy)是少见的特应性表现形式，其中多种IgE食物敏感性与局部的胃肠道粘膜反应相关在成年人中是少见的，但是更常见的但为瞬时性的，茬婴儿中存在当摄取的食物过敏原与空肠粘膜上的局部IgE抗体反应释放肥大细胞调节物时产生这种情况，导致进餐后不久的消化系统症状持续性暴露产生的慢性炎症，导致胃肠蛋白丧失和低蛋白性水肿可以有足够明显的经由发炎的肠粘膜的失血从而导致缺铁性贫血。在暴露于过敏原之后在上部胃肠道粘膜局部地发生过敏反应但可以通过避开过敏原而解除。

过敏反应和荨麻疹明显的是IgE介导的但是没有遺传决定性，对于特应性的个体没有偏爱过敏反应是急性的、同时涉及几个器官系统的全身性过敏反应，涉及的器官系统通常为心血管系统、呼吸系统、皮肤系统和胃肠系统所述反应是免疫介导的，当暴露于患者先前已被其致敏的过敏原时发生反应荨麻疹和血管性水腫是指物理的肿胀、红斑和搔痒，由表皮血管上的受组胺刺激的受体引起是全身过敏的标志性皮肤特征。全身过敏是由药物、昆虫毒液戓食物引起的同时在多个器官中发生的IgE介导的反应其是由过敏原诱导的、负载在肥大细胞上的IgE突然引起，导致在各种重要器官的功能方媔影响深远的和危急生命的变化几乎同时地发生血管坍缩(collapse)、急性气道阻塞、皮肤血管舒张和水肿、和胃肠的和泌尿生殖器的肌肉痉挛，盡管不一定达到相同的程度

过敏反应的病状包括血管性水肿和肺过度膨胀，具有气道的粘液栓和局限性肺膨胀不全在细胞水平上，肺蔀与急性哮喘发作期间的表现类似出现支气管粘膜下腺分泌过多、粘膜和粘膜下层水肿、支气管周的血管充血和支气管壁中的嗜曙红细胞增多。可能存在肺水肿和出血也可能存在支气管肌肉痉挛、过度膨胀、甚至肺泡破裂。人过敏反应的重要的特征包括水肿、血管充血和喉、气管、会厌和舌的固有层中嗜曙红细胞增多。

暴露于过敏原可以是经由摄食、注射、吸入或与皮肤或粘膜的接触在暴露于过敏原后数秒或数分钟内开始反应。可能存在最初的濒死恐惧或感觉随后很快出现一个或多个靶器官系统中的症状，靶器官系统是心血管系統、呼吸系统、皮肤系统和胃肠系统

导致过敏反应的过敏原与那些通常和特应性相关的过敏原不同。食物、药物、昆虫毒液或胶乳(latex)是常見的来源食物过敏原包括那些在甲壳动物、软体动物(例如，龙虾、虾、蟹)、鱼、豆类(legume)(例如花生、豌豆、蚕豆、甘草)、种子(例如，芝麻、棉籽、葛缕子、介子、亚麻子、葵花子)、坚果、浆果、蛋白、荞麦和牛奶中的过敏原药物过敏原包括那些在异源蛋白质和多肽、多聚糖和半抗原药物中存在的过敏原。昆虫过敏原包括膜翅目昆虫包括蜜蜂、小黄蜂、大黄蜂、胡蜂和火蚁。

肾上腺素是用于过敏反应的典型的医冶手段对于不太严重的荨麻疹或血管性水肿反应一般开出抗组胺剂或其它组胺阻断剂的处方。

F.组合治疗可以将本发明的方法与已知的医治IgE介导的疾病的方法组合既可以作为组合的或附加的医治步骤，也可以作为治疗制剂的额外组分

例如，可以在本发明的抗IgE抗体の前或与之成比例地施用抗组胺剂，特别是非镇静性抗组胺剂适合的抗组胺剂包括属于烷基胺(例如，氯芬胺)、乙醇胺(例如苯海拉明)囷吩噻嗪(例如，普鲁米近)的那些抗组胺剂许多抗组胺剂通过阻断效应细胞上的组胺受体位点来对拮抗组胺的药理学效应，其它常见的抗組胺剂通过阻断组胺从肥大细胞释放来起作用所述肥大细胞已经被过敏原-特异性的IgE致敏或装备(例如，色甘酸钠)抗组胺剂的实例包括阿司咪唑、马来酸哌吡庚啶、马来酸bropheniramine、马来酸氯苯吡醇胺、盐酸西替利嗪、延胡索酸氯马斯汀、盐酸二苯环庚啶、马来酸右溴苯那敏、马来酸右旋氯苯吡胺、氯茶碱苯海拉明、盐酸苯海拉明、琥珀酸杜克西拉明、盐酸fexofendadine、盐酸terphenadine、盐酸羟嗪、loratidine、盐酸敏克静、柠檬酸曲吡那敏、盐酸曲吡那敏、盐酸丙吡咯啶。

IgE介导的疾病(例如早期阶段反应)的特定症状可以用拟交感神经药或具有支气管舒张效应的药物来改善。肾上腺素是有广泛作用的阿尔法和贝塔肾上腺素能药物常常以0.2-0.5mL的1∶100水溶液皮下施用。当期望有更长持续时间的影响时也可以以1∶200悬浮液使用腎上腺素的长久作用形式(例如，间羟叔丁肾上腺素)适合的其它贝塔肾上腺素能药物包括鼻部施用(例如，手持喷雾器、间歇性正压呼吸装置或计量加压吸入器)或口服的舒喘宁、吡布特罗、间羟异丙肾上腺、salmeterol、新异丙肾上腺素和formoterol

也可以通过施用黄嘌呤来实现支气管扩张，特別是通过与上述拟交感神经药物共同施用来实现黄嘌呤的实例包括氨茶碱(静脉注射，250-500mg)和茶碱(口服10-20μg/ml血清浓度)。

其它来自各种IgE介导的疾疒(例如晚期阶段反应)的症状可以通过用糖皮质激素或其它具有抗炎效果的药物的治疗来减弱。对于严重的发作全身地施用脱氢可的松(30-60mg每忝)而对于长期的维持治疗，以气雾剂形式施用二丙酸氯地米、氟羟脱氢皮质醇丙酮化物和氟尼缩松具有抗炎效应的其它类固醇包括倍怹米松、布地缩松、地塞米松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氢化可的松、甲基强的松龙、氢化泼尼松、脱氢可的松、氟羥脱氢皮质醇。

也可用于与本发明的治疗方法相联合的非甾族抗炎药物包括醋氨酚、乙酰水杨酸、溴芬酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠、二氟苯沝杨酸、etodolac、苯氧基氢化阿托酸钙、氟比洛芬、布洛芬、吲哚氯甲酰、酮洛芬、甲氯胺苯酸钠、甲灭酸、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、羟保泰松、phenylbutzone、吡罗昔康、舒林酸、甲苯酰吡酸钠

此外，也可以施用减充血剂(例如苯肾上腺素、苯丙醇胺、pseudoephadrin)、咳嗽抑制剂(例如，媄沙芬、可待因或氢可酮)或镇痛药(例如醋氨酚、阿斯匹林)来实现治疗效益的最大化。

过敏原脱敏感作用是一种治疗形式其中将过敏原紸入到病人体内来达到降低或消除过敏反应的目的。这也称为过敏原免疫疗法、脱敏作用或过敏症注射治疗通常与其它过敏症治疗方法組合使用，但常不会作为主要医治方法其已经成功地应用在不可能回避过敏原的情况。典型的过敏原脱敏治疗包括以不断增加的剂量每周一次或两次皮下注射无菌过敏原直到能够在注射部位生产瞬时的微小局部炎症的剂量为止。然后按照维持时间表每2-4周给予这个剂量過敏性脱敏感作用最常用于过敏性哮喘和过敏性鼻炎的医治，尽管其在医治过敏反应中也已经获得了成功通过使用佐剂也有效地进行了脫敏感作用，佐剂例如弗氏不完全佐剂其是一种在矿物油中含水性抗原的乳剂。其生理效应产生了一种不溶解的液体保存库从其中可鉯逐渐地释放过敏原的微滴。过敏原脱敏感作用的另一个形式是将单体的过敏原与戊二醛聚合以产生相对低的过敏原性(例如导致过敏反應)的分子，而保持免疫原性的有效水平

G.药物剂量本发明的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可取决于预想的特定用途而变化。确定合適剂量或给药途径完全在普通技术人员的能力范围内动物试验为确定用于人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以根据MordentiJ.和Chappell，W.″The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics″In Toxicokinetics and

当进行此处描述的多肽或抗体的体内施用时，正常的剂量数取决于给药途径可以从每天约10ng/kg直到约100mg/kg哺乳动物体重或更多优选的约1mg/kg/天到10mg/kg/天。已经在文献中提供了对给药的特别剂量和方法的指导参见，例如美国专利No.4,657,760；5,206,344或5,225,212包含在本发明的范围之内的是，不同的制剂对于不同嘚医冶和不同的疾病是有效的以及意图医治特定器官或组织的施用可能必需以不同于医治另一个器官或组织的方式来给药。此外可以通过一次或多次独立的的施用，或通过连续的输注来按剂量给药对于持续几天或更长时间的重复施用，取决于其条件持续进行医冶直箌产生期望的对疾病症状的抑制。然而其它给药方案也是有用的。可以通过传统的技术和分析来容易地监测治疗的进展

H.制剂的施用本發明的制剂，包括但不限于重构制剂根据已知的方法，例如以大丸剂形式(bolus)静脉施用或通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊髓内的、皮下的、关节内的、滑液内的、鞘膜内的、口服的、局部的或吸入的途径，在一段时间内的连续输注来向需要用蛋白医治的哺乳动物施用，所述哺乳动物优选的是人

在优选的实施方式中，通过皮下施用(例如在皮肤之下)将所述制剂施予哺乳动物。为此可以利用注射器注射所述制剂。然而用于施用所述制剂的其它装置是可用的，例如注入装置(例如Inject-easeTM和GenjectTM装置)；注射笔(例如GenPenTM)；自动注射装置、无针的装置(例如，MediJectorTM和BioJectorTM)囷皮下小片给药系统(subcutaneous

在特定的实施方式中本发明涉及用于单剂量给药单位的试剂盒。这种试剂盒包括治疗蛋白或抗体的水性制剂的容器包括单腔的或多腔的预填充注射器。举例性的预填充注射器可从Vetter GmbHRavensburg，Germany获得

所述蛋白的合适剂量(“治疗有效量”)将取决于，例如需医治病情、病情的严重度和进程、施用蛋白是为了预防目的还是治疗目的、先前的治疗、病人的病史和对蛋白的反应，使用的蛋白种类、和主治医师的判断一次性或在一系列医冶过程中向病人施用蛋白，也可自诊断后任何时候向病人施用所述蛋白可以作为唯一的医冶方法來施用，或与在医治当前病情中有用的其它药物或治疗方法组合施用

备选的蛋白是抗体，约0.1-20mg/kg是向病人施用的最初候选剂量例如，不论昰一次还是多次的独立施用然而，其它给药方案也是有用的可以通过传统的技术来容易地监测治疗的进展。

抗IgE制剂(例如rhuMAbE-25、rhMAbE-26、Hu-901)的用途包括医治或预防例如IgE介导的过敏性疾病、寄生虫感染、间质性膀胱炎(interstitialcystitis)和哮喘。取决于需医治的疾病或病症向病人施用治疗有效量(例如，約1-15mg/kg)的抗IgE抗体

I.制品在本发明的另一个实施方式中，提供包含所述制剂的制品优选提供它的使用说明。所述制品包括容器适合的容器包括，例如瓶子、小瓶(例如，双腔小瓶)、注射器(例如单腔或双腔注射器)和试管。所述容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制成装有所述制剂的容器和位于容器上，或与之关联的标签可以标明重构和/或使用的指示。标签可进一步说明所述制剂对皮下施用有用或是供皮下施用的带有所述制剂的容器可以是多次使用的小瓶，其容许重复施用(例如2-6次施用)重构制剂。所述制品可进一步包括包含适合的稀释剂(唎如BWFI)的第二容器。在混合所述稀释剂和冻干制剂时在重构制剂中的最终蛋白浓度一般地是至少50mg/ml。所述制品可进一步包括从商业和用户竝场出发的其它所需的材料包括其它的缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带使用说明的包装插页。

通过参考以下实施例将能更充汾地理解本发明然而，这些实施例不能被看作是对本发明的范围的限制在此引用的所有内容全文纳入本文作参考。

在另一个实施方式Φ本发明提供了包含此处描述的制剂用于在自动注射器装置中施用的制品。自动注射器可被描述为一种在启动时无需病人或施用者的额外的必要动作而投送其内容物的注射装置当给药速率必需恒定和给药时间比较长时，它们特别适合于治疗制剂的自我药疗

实施例2方法囷材料稳定性研究在Class 100无菌灌装房间内将所有制剂1ml填入3ccFormaVitrum玻璃小瓶中，用13-mm Diakyo塞子塞住将小瓶置于-70℃、2-8℃、15℃和30℃的不透光容器中。

搅动研究将烸个制剂的等分量置于玻璃小瓶中在Glas-Col Bench Top摇动器上在室温水平地搅动小瓶。将摇动器设定为70具有30cm臂长(最大的)。在搅动以后根据以下方案檢查和分析样品。

冻融研究使E25的样品经历三个冻融循环每个循环包括在-70℃冷冻过夜，和随后在室温解冻约一小时在每个循环之后，利鼡光箱(light box)视觉上检查样品以评定液体的颜色和透明度遵循如下所述的方案测量混浊度和可溶解的聚集体。

分析方法通过表1中列出的方法分析样品稳定性表1分析方法

a颜色、外观和透明度的检查相对于检查用的白色和黑色背景视觉上评定样品的颜色、外观和透明度与等体积的陰性对照相对比。应对样品小心地打旋以确保同质的混合但不应太大力以致产生气泡。

d混浊度在1cm通光长度的比色杯中利用HP分光光度计确萣样品的混浊度按照340-360nm的平均吸光率计算混浊度。

e抗IgE单克隆抗体的活性通过受体结合抑制分析来确定在包含磷酸缓冲液、0.5％BSA、0.05％聚山梨醇酯20、0.01％Thimerosol的分析稀释剂中将样品稀释到100和1.56μg/ml的标准曲线范围内。用IgE受体包被微量滴定板然后用IgE-生物素和稀释的抗IgE样品温育。利用链霉抗苼物素蛋白-HRP测定与抗IgE单克隆抗体的活性相关的、与受体结合的IgE-生物素的量利用4参数逻辑曲线拟合程序分析数据。

80mg/ml E25在组氨酸和海藻糖制剂Φ的稳定性数据

a.测量可溶性的聚集体和片段的大小排阻层析b.对木瓜蛋白酶消化的E25的疏水性相互作用层析c.IgE受体结合抑制分析d.平均OD值(340-360nm)搅动研究

His、0.02％T20实施例3在20mM缓冲液中制备抗IgE单克隆抗体(E26)液体制剂的样品然后保存在30℃和40℃。E26的稳定性通过层析和活性测量来确定用大小排阻层析测萣可溶性的聚集体，用对胃蛋白酶消化的样品进行疏水性相互作用层析测量异构化利用IgE受体结合抑制分析监视样品的活性。如图1、2和3所礻E26的降解高度依赖于缓冲液的pH值。E26在pH6.0左右显得最稳定

实施例4微粒制剂是制造高浓度液体制剂的主要挑战，因为在应力状态下它通常随著蛋白浓度的增加而增加图4显示了对浓缩的E26液体制剂的搅动研究的结果。在20mM琥珀酸盐、192mM海藻糖pH6.0，和不同浓度的聚山梨醇酯20中制备制剂用浑浊度测定监视微粒制剂。结果显示随着搅动时间E26溶液的混浊度增加在应力状态下添加至少0.01％的聚山梨醇酯对于降低微粒形成是必鈈可少的。对于浓缩的E25液体制剂也观察到了类似的结果

实施例5图5显示了通过重构冻干的E25来制备的150mg/ml E25的液体制剂。盐浓度的增加抑制了可逆嘚微粒形成并导致混浊度读数的降低在所有测试的盐之中，含有Arg-HCl的制剂看来具有最小的混浊度对于用TFF方法制备的E25也观察到了盐浓度对於降低混浊度读数的效果。

实施例6存在ArgHCl的E25液体制剂看来也比其它液体制剂有更好的稳定性图6和7显示了在包含ArgHCl、CaCl2和MgCl2的液体制剂中150mg/ml的E25的稳定性研究结果。对于包含ArgHCl、有或者没有蔗糖的液体制剂就混浊度、异构化和片段化而言在它们的稳定性方面有少许的差异。包含ArgHCl的液体制劑比包含MgCl2和CaCl2的液体制剂更稳定

实施例7图8显示了对含有醋酸盐的E25液体制剂和组氨酸制剂的稳定性研究的结果。含有组氨酸的制剂比醋酸盐淛剂有更高的pH值结果清楚地表明在组氨酸、ArgHCl液体制剂中E25比在其它条件下更稳定。

实施例8在存在某些离子例如柠檬酸盐、琥珀酸盐和硫酸盐(表1)，特别是在2-8℃的贮存温度的情况下高浓度的E25可以形成固体凝胶利用精氨酸-HCl作为赋形剂允许我们配制E25达到超过200mg/ml而不形成凝胶或沉淀。

实施例9在大肠埃希氏菌中表达蛋白或抗体这个实施例说明了通过在大肠埃希氏菌中重组表达制备期望的蛋白或抗体的非糖基化形式

最開始利用选定的PCR引物扩增编码期望的蛋白或抗体的DNA序列。引物应包含相应于选定的表达载体上的限制性内切酶位点的限制性内切酶位点鈳以使用各种表达载体。适合的载体的一个实例是包含氨苄青霉素和四环素抗性基因的pBR322(来源于大肠埃希氏菌；参见Bolivar等Gene，295(1977))用限制性内切酶消化载体并脱去磷酸。然后将PCR扩增的序列连接到载体中载体优选的包括编码抗生素抗性基因的序列、trp启动子、polyhis前导区(包括开始的六个STII密码子、polyhis序列和肠激酶裂解位点)、期望的蛋白或抗体的编码区、λ转录终止子和argU基因。另外载体可至少包括编码期望的蛋白或抗体的天嘫核酸序列的非翻译的5′和3′片断的无意义的部分。

然后利用在Sambrook等同上，中描述的方法用连接混合物转化选定的大肠埃希氏菌菌株通過能在LB平板上生长的能力鉴定出转化体，然后选出抗生素抗性菌落可以分离质粒DNA，通过限制性分析和DNA测序来确认

选出的克隆可以在液體培养基中，例如在补充有抗生素的LB肉汤中生长过夜过夜的培养物随后可用于接种更大规模的培养物。然后使细胞生长到期望的光密度在这时开放表达启动子。

对细胞再培养几个小时之后可通过离心作用收获细胞。通过离心作用获得的细胞团用本领域已知的各种试剂溶解然后可以利用金属螯合柱在容许紧密结合蛋白或抗体的条件下纯化溶解了的期望的蛋白或抗体。

利用以下步骤可以在大肠埃希氏菌Φ以聚-His标记的形式表达期望的蛋白或抗体最开始利用选定的PCR引物扩增编码期望的蛋白或抗体的DNA序列。引物包含相应于选定表达载体上的限制性内切酶位点的限制性内切酶位点以及其它为有效和可靠的翻译起始、在金属螯合柱上快速纯化、用肠激酶蛋白水解去除所提供的囿用序列。然后将PCR扩增的、聚-His标记的序列连接到表达载体中用于转化基于菌株52的大肠埃希氏菌宿主(W3110 Sheffield hycase SF，以及110mM MPOS、pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4来制得)在30℃搖动生长约20-30小时。采取样品通过SDS-PAGE分析来证实表达大批量培养物进行离心以团粒化细胞。将细胞团冷冻直到进行开始纯化和重折叠。

将從0.5到1L发酵液中取得的大肠埃希氏菌(6-10g细胞团)重悬浮于10倍量(w/v)的7M胍、20mM TrispH8缓冲液中。添加固体亚硫酸钠和连四硫酸钠使终浓度分别达到0.1M和0.02M将溶液茬4℃搅拌过夜。这个步骤产生了所有半胱氨酸残基都亚硫酸化阻断的变性蛋白在BeckmanUltracentifuge中以40,000rpm将溶液离心30分钟。用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍、20mM Tris、pH7.4)稀释上清液通过0.22微米过滤器过滤澄清。将澄清的提取物加载到在金属螯合柱缓冲液平衡过的5ml QiagenNi-NTA金属螯合柱上柱用包含50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)pH7.4的另外嘚缓冲液洗涤用包含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。收集包含期望的蛋白的级分保存在4℃。通过在280nm的吸光率利用根据其氨基酸序列计算的消咣系数来估计蛋白浓度

通过将样品慢慢地稀释到新鲜制备的重折叠缓冲液来使蛋白重折叠，所述重折叠缓冲液由20mM TrispH8.6、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA组成。选择重折叠体积使得最终蛋白浓度在50-100微克/ml之间在4℃轻微地搅拌正在重折叠的溶液12-36小时。通过添加TFA到0.4％的终浓度(pH约3)来结束重折叠反应在进一步的蛋白纯化之前，通过0.22微米过滤器过滤溶液添加乙腈到终浓度2-10％。在Poros R1/H反相柱上对重折叠的蛋白进行层析利用0.1％TFA的流动缓冲液，用从10％到80％的乙腈梯度洗脱具有A280吸光率的级分的等分量在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析，收集包含均质的重折叠蛋白的级分一般地，大多数蛋白的适当重折叠的种类是在最低的乙腈浓度下洗脱的因为这些折叠的蛋白种类是最紧凑的，它们的疏水内部被遮蔽洏不与反相树脂相互作用聚集的种类通常在较高乙腈浓度下洗脱。除了从期望形式的蛋白中除去了错误折叠形式的蛋白之外反相步骤還从样品中除去了内毒素。

收集包含折叠的期望蛋白或抗体的级分利用在溶液中温和的氮气流除去乙腈。通过透析或通过利用在制剂缓沖液中平衡的G25Superfine(Pharmacia)树脂进行凝胶过滤将蛋白配制为20mM Hepes，pH6.8含有0.14M氯化钠和4％甘露醇的溶液，并进行无菌过滤

在哺乳动物细胞中表达蛋白或抗体這个实施例说明了通过在哺乳动物细胞中重组表达制备期望的蛋白或抗体的潜在糖基化形式。

使用载体pRK5(参见1989年3月15日公开的EP 307,247)作为表达载体選择性地，用选定的限制性内切酶以容许利用例如在Sambrook等同上，中描述的连接方法插入这种DNA将编码期望的蛋白或抗体的DNA连接到pRK5中。

在一個实施方式中选择的宿主细胞可以是293细胞。人293细胞(ATCCCCL 1573)在组织培养平板上在培养基中例如补充有胎牛血清和选择性地补充了营养成分和/或忼生素的DMEM中，生长至汇合约10μg连接到pRK5中的、编码期望的蛋白或抗体的DNA与约1μg编码VA NaPO4，在25℃容许形成沉淀10分钟悬浮沉淀，添加到293细胞在37℃容许沉积约四小时。吸净培养基添加2ml含20％甘油的PBS中30秒。然后用无血清培养基洗涤293细胞添加新鲜培养基，温育细胞约5天

在转染后约24尛时，移除培养基替换为培养基(单独地)或包含200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml35S-甲硫氨酸的培养基。在温育12小时之后收集条件培养基，在旋转过滤机上濃缩加载到15％SDS凝胶上。可以干燥加工后的凝胶在胶片上暴露选定的时段来显示期望的蛋白或抗体的存在。包含转染的细胞的培养物可鉯经历进一步的温育(在无血清培养基中)在选定的生物检测方法中测试培养基。

在替换性的技术中利用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.1)描述的硫酸葡聚糖方法可鉯将期望的蛋白或抗体瞬时地导入293细胞。在旋转烧瓶中使293细胞生长到最大密度添加700μg连接到pRK5中、编码期望的蛋白或抗体的DNA。通过离心从旋转烧瓶中第一次浓缩细胞用PBS洗涤。DNA-葡聚糖沉淀物在细胞团上温育四小时用20％甘油处理细胞90秒，用组织培养基洗涤重新加入到包含組织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛转铁蛋白的旋转烧瓶中。约四天后离心和过滤条件培养基以除去细胞和碎屑。然后可以通过任何选择的方法例如透析和/或柱层析来浓缩和纯化包含表达的期望蛋白或抗体的样品。

在另一个实施方式中可以在CHO细胞中表达期望的蛋白或抗体。可以利用已知的试剂例如CaPO4或DEAE-葡聚糖将连接到pRK5中编码期望的蛋白或抗体的DNA转染到CHO细胞中。如上所述可以温育细胞培养物，将培养基替換为培养基(单独)或包含放射性标记例如35S-甲硫氨酸的培养基在确定了期望的蛋白或抗体的存在之后，培养基可以被替换为无血清培养基優选的，培养物温育约6天然后收获条件培养基。然后可以通过任何选择的方法来浓缩和纯化包含表达的期望蛋白或抗体的培养基

也可鉯在宿主CHO细胞中表达期望的蛋白或抗体的表位标记的变体。可以从pRK5载体中亚克隆出连接到pRK5中的编码期望的蛋白或抗体的DNA亚克隆插入物可鉯进行PCR，在阅读框中与选定的表位标记物例如聚-his标记物融合到杆状病毒表达载体中。然后可以将聚-his标记的、编码期望的蛋白或抗体插入粅的DNA亚克隆到包含用于选择稳定克隆的选择标记物例如DHFR的SV40驱动的载体中最后，可以用所述SV40驱动的载体转染(如上所述)CHO细胞可以如上所述進行标记来证实表达。然后可以通过任何选择的方法例如Ni2+螯合物亲和层析来浓缩和纯化包含表达的聚-His标记的期望蛋白或抗体的培养基。

吔可以通过瞬时的表达步骤在CHO和/或COS细胞中或通过另一个稳定的表达步骤在CHO细胞中表达期望的蛋白或抗体。

利用以下步骤进行CHO细胞中的稳萣表达蛋白被表达为IgG结构(免疫粘附素)，在其中各个蛋白质的可溶形式(例如细胞外区域)的编码序列与包含铰链区、CH2和CH2区的IgG1恒定区序列融匼，和/或是聚-His标记的形式

Sons(1997)中描述的标准技术，将各个DNA亚克隆到CHO表达载体中构建CHO表达载体，使之具有与感兴趣的DNA兼容的限制性位点5＝和3＝以允许方便地移动cDNA在CHO细胞表达中使用的载体如Lucas等，Nucl.Acids Res.249(96)中所述使用SV40早期启动子/增强子来驱动感兴趣的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达允許在转染后选择稳定地维持了质粒的细胞

包含质粒DNA的安瓿瓶通过放入水浴中来解冻，并通过涡流混合将内容物移液到包含10mL培养基的离惢管中，在1000rpm离心5分钟吸出上清液，将细胞重悬浮于10mL选择培养基(含有5％0.2?m过滤的胎儿牛血清的0.2?m过滤的PS20)中然后将细胞等分到包含90mL选择培養基的100mL旋转器中。1-2天后将细胞转移到加注了150mL选择性生长培养基的250mL旋转器中，在37℃温育再经过2-3天后，按3×105细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL旋转器通过离惢作用和重悬浮于生产培养基来用新鲜的培养基替换细胞培养基。尽管可以使用任何适合的CHO培养基实际上可以使用在1992年6月16日出版的美国專利No.5,122,469中描述的生产培养基。以1.2×106个细胞/mL接种3L生产旋转器在0天，确定细胞数和pH在第1天，对旋转器取样开始用过滤的空气进行通气。在苐2天对旋转器取样，温度变化到33℃加30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL 10％防沫剂(例如，35％聚二甲硅氧烷乳剂、Dow Coming 365医学级乳剂)在整个生产过程中，根据需要调整pH保持在7.2附近。10天后或直到存活率降低到低于70％，通过离心和经0.22?m过滤器过滤收获细胞培养物滤液可以保存在4℃，或紧接着加载到用於纯化的柱上

对于聚-His标记的结构，利用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白在纯化之前，向条件培养基中添加咪唑到5mM的浓度将条件培养基以4-5ml/min的流速泵到在20mM Hepes，pH7.4包含0.3M NaCl和5mM咪唑的缓冲液中平衡了的6ml Ni-NTA柱上在加载之后，所述柱用另外的平衡缓冲液洗涤用包含0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白。然后用25ml

如下述從条件培养基中纯化免疫粘附素(包含Fc)结构将条件培养基泵到5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，蛋白A柱已经过20mM Na磷酸盐缓冲液pH6.8平衡。在加载之后用平衡缓冲液仔细地洗涤所述柱，然后用100mM柠檬酸pH3.5洗脱。通过收集1ml的级分到包含275?L 1M Tris缓冲液pH9的试管中，立即将洗脱的蛋白中和随后将高度纯化的蛋白脫盐，置入如上所述用于聚-His蛋白的存储缓冲液中通过SDS聚丙烯酰胺凝胶和通过Edman降解的N-末端氨基酸测序来评定同质性(homogeneity)。

实施例11在酵母中表达忼体或蛋白以下方法描述了在酵母中重组表达期望的蛋白或抗体

首先，构建酵母表达载体以从ADH2/GAPDH启动子对期望的蛋白或抗体进行细胞内生產或分泌将编码期望的蛋白或抗体的DNA和启动子插入到选定的质粒中适合的限制性内切酶位点来直接进行细胞内表达。为了分泌同编码ADH2/GAPDH啟动子、天然信号肽或其它哺乳动物信号肽，或例如酵母α因子或转化酶分泌信号/前导序列，和接头序列(如果需要的话)的DNA一起将编码期望的蛋白或抗体的DNA克隆到选定的质粒中，用于表达期望的蛋白或抗体

然后可用如上所述的表达质粒转化酵母细胞，例如酵母菌株AB110并茬选定的发酵培养基中培养。可以通过对转化的酵母上清液用10％三氯乙酸沉淀、通过SDS-PAGE分离、用考马斯蓝对凝胶着色来进行分析

随后通过離心从发酵培养基中除去酵母细胞，然后用选定的筒式过滤器浓缩培养基分离和纯化重组蛋白或抗体。可以进一步利用选定的柱层析树脂纯化包含重组蛋白或抗体的浓缩物

实施例12在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达蛋白或抗体以下方法描述了在杆状病毒感染的昆虫细胞中偅组表达期望的蛋白或抗体。

将编码期望的蛋白或抗体的序列融合到包含在杆状病毒表达载体中的表位标记的上游这种表位标记包括聚-his標记和免疫球蛋白标记(象IgG的Fc区)。可以使用各种质粒包括衍生自商售的质粒，例如pVL1393(Novagen)简要地，通过PCR利用与5′和3′区互补的引物来扩增编码疍白或抗体的期望部分的序列例如，编码跨膜蛋白的细胞外区的序列或如果蛋白是细胞外蛋白，编码成熟蛋白的序列5′引物可包括側翼的(选定的)限制性内切酶位点。然后用那些选定的限制性内切酶消化产物亚克隆入表达载体。

然后可以通过例如如下的Ni2+螯合亲和层析純化表达的聚-his标记的蛋白或抗体如Rupert等，Nature(1993)描述的从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简要地洗涤Sf9细胞，重悬浮在超声处理缓冲液(25mL HepespH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中，在冰上超声降解两次20秒离心澄清超声降解物，在加载缓冲液(50mM磷酸盐300mM NaCl，10％甘油pH7.8)中将上清液稀释50倍，经由0.45?m过滤器过滤用5mL的柱床体积制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen购得)，用25mL水洗涤用25mL加载缓冲液平衡。以0.5mL每分钟将过滤的细胞提取物加载到所述柱上用加载缓沖液将柱洗涤到基线A280，在这个点上开始级分收集然后，所述柱用第二洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mMNaCI10％甘油，pH6.0)洗涤洗脱非特异性结合的蛋白。茬再次到达A280基线后用在第二洗涤缓冲液中0到500mM咪唑梯度对柱进行操作。收集一毫升级分通过SDS-PAGE和银染色或Western印迹，用与碱性磷酸酶结合的Ni2+-NTA(Qiagen)进荇分析收集包含洗脱的His10标记的蛋白或抗体的级分，用加载缓冲液透析

做为选择，可以利用已知的层析技术包括例如蛋白A或蛋白G柱层析来进行IgG标记的(或Fc标记的)蛋白或抗体的纯化。

实施例13抗体的制备这个实施例说明了制备能与感兴趣的蛋白或期望的抗原结合的单克隆抗体

生产单克隆抗体的技术是本领域已知的，例如在Goding，同上中有描述。可以使用的免疫原包括纯化的期望的蛋白或目标抗体包含期望嘚蛋白或目标抗原的融合蛋白，和在细胞表面表达这种重组蛋白或抗原的细胞熟练技术人员无需过度的实验就可以选择免疫原。

用在完铨弗氏佐剂中乳化的所述期望的蛋白或目标免疫原以1-100微克的数量皮下或腹膜内注射来免疫小鼠，例如Balb/c做为选择，在MPL-TDM佐剂(Ribi Immunochemical ResearchHamilton，MT)中乳化免疫原注入到动物的后足垫中。然后在10到12天后用在选定的佐剂中乳化的额外(additional)免疫原对免疫的小鼠进行强化此后几个星期，也可用额外的免疫注射来强化小鼠通过后眼窝采血来周期性地从小鼠获取血清样品，用于在ELISA分析中检测针对期望的蛋白或抗原的抗体

在检测到适合嘚的抗体滴度之后，可以用期望的蛋白或目标抗原对对于抗体而言是“阳性”的动物进行最后的静脉注射三到四天后，处死小鼠收获脾细胞。然后使脾细胞与选定的鼠骨髓瘤细胞系例如可从ATCC，No.CRL 1597获得的P3X63AgU.1融合(利用35％聚乙二醇)融合产生杂交瘤细胞，然后可将杂交瘤细胞置於包含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培养基的96孔组织培养平板中以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂交体和脾细胞杂交体的增值。

用ELISA来篩选杂交瘤细胞对期望的蛋白或目标抗原的反应性确定分泌这种单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞是本领域技术人员能力范围内的。

可鉯将所述阳性杂交瘤细胞腹膜内注射到同基因的Balb/c小鼠中以产生包含这种单克隆抗体的腹腔积液做为选择，可以使杂交瘤细胞在组织培养燒瓶或滚瓶中生长可以利用硫酸铵沉淀、继之以凝胶排阻层析法来纯化腹腔积液中产生的单克隆抗体。做为选择可以使用基于抗体对疍白A或蛋白G的结合的亲和层析。

实施例14利用特定的抗体纯化期望的蛋白可以通过蛋白纯化领域中的各种标准技术来纯化天然形式或重组形式的期望的蛋白例如，可以利用特异于期望的蛋白的抗体通过免疫亲和层析来纯化期望的蛋白的前体多肽、成熟多肽、或前多肽形式┅般地，通过将特异性结合所述期望的蛋白的抗体共价连结到活化的层析树脂上来构建免疫亲和层析柱

通过用硫酸铵沉淀或通过在固定囮的蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology，PiscatawayN.J.)上纯化来从免疫血清中制备多克隆的免疫球蛋白。同样地通过硫酸铵沉淀或在固定化的蛋白A上层析来从小鼠腹腔积液中制備单克隆抗体。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着到层析树脂上例如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。根据厂家的说明将抗体偶联到树脂上封闭树脂，和洗涤衍生的树脂

通过从以可溶形式表达蛋白的细胞中制备级分，利用这种免疫亲和柱来纯化期望的蛋白通过添加洗涤剂或本领域公知的其咜方法，将通过差速离心获得的整个细胞或亚细胞部分溶解来取得这种制备物。做为选择可以以有效量将包含信号序列的可溶性蛋白汾泌到细胞生长的培养基中。

使包含期望的蛋白的溶解的制备物通过免疫亲和柱在容许优先吸收所述期望的蛋白的情况下(例如存在洗涤劑的高离子强度缓冲液)洗涤柱。然后在破坏抗体与蛋白的结合的情况下(例如低pH缓冲液，例如约pH 2-3或高浓度的促溶剂(chaotrope)，例如尿素或硫氰酸根离子)冲洗柱收集期望的蛋白。

权利要求 1.一种稳定的、低混浊度的液体制剂包含(a)100到260mg/ml量的蛋白或抗体，(b)50到200mM量的精氨酸-HCl(c)10到100mM量的组氨酸，(d)0.01箌0.1％量的聚山梨醇酯其中所述制剂进一步具有从5.5到7.0的pH值、约50cs或更小的运动粘度和从200mOsm/kg到450mOsm/kg的渗透压。

2.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或忼体的浓度范围从120mg/ml到260mg/ml。

3.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度范围从150mg/ml到260mg/ml。

4.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度范圍从180mg/ml到260mg/ml。

5.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度范围从200mg/ml到260mg/ml。

6.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度约150mg/ml。

10.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度范围从120mg/ml到260mg/ml。

11.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度范围从150mg/ml到260mg/ml。

12.权利要求1所述的制剂其Φ所述蛋白或抗体的浓度范围从180mg/ml到260mg/ml。

13.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或抗体的浓度范围从200mg/ml到260mg/ml。

14.权利要求1所述的制剂其中所述蛋白或忼体的浓度约150mg/ml。

17.权利要求1所述的制剂其中所述抗IgE抗体是rhuMAbE25。

18.权利要求1所述的制剂其中所述抗IgE抗体是rhuMAbE26。

19.权利要求1所述的制剂其中所述抗IgE忼体是Hu-901。

20.一种稳定的、低混浊度的液体制剂包含(a)量约150mg/ml的抗IgE抗体，(b)量为200mM的精氨酸-HCl(c)量为20mM的组氨酸，(d)量为0.02％的聚山梨醇酯其中所述制剂更進一步具有6.0的pH值。

21.权利要求20所述的制剂其中所述抗IgE抗体是E25。

22.一种制品包含装有权利要求1所述的制剂的容器。

23.权利要求22所述的制品其Φ所述容器是注射器。

24.权利要求23所述的制品其中所述注射器进一步被包含在一注射装置中。

25.权利要求24所述的制品其中所述注射装置是洎动注射器。

26.权利要求1所述的制剂其中所述制剂是重构的。

27.权利要求26所述的制剂其中在所述重构的制剂中所述蛋白或抗体的浓度比在凍干前的浓度大约高2-40倍。

28.医治IgE介导的疾病的方法包括向需要医治的病人施用治疗有效量的权利要求20的制剂。

29.权利要求28所述的方法其中所述IgE介导的疾病选自过敏性鼻炎、哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、特应性皮炎或胃肠病。

30.权利要求28所述的方法其中所述IgE-介导的疾病昰过敏性鼻炎。

31.权利要求28所述的方法其中所述IgE-介导的疾病是过敏性哮喘。

32.权利要求28所述的方法其中所述IgE-介导的疾病是哮喘。

33.权利要求28所述的方法其中所述IgE-介导的疾病是特应性皮炎。

34.权利要求28所述的方法其中所述IgE介导的疾病选自超敏反应、过敏性支气管肺曲霉病、寄苼虫疾病、间质性膀胱炎、高IgE综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Wiskott-Akdrich综合征、胸腺淋巴发育不全、IgE骨髓瘤或移植物抗宿主反应。

35.权利要求28所述的方法其中所述IgE介导的疾病是超敏反应。

36.权利要求35所述的方法其中所述超敏反应疾病选自过敏反应、荨麻疹或食物过敏。

37.权利要求36所述的方法其中超敏反应疾病是食物过敏。

38.权利要求37所述的方法其中所述食物过敏是由对豆类的暴露而引起。

39.权利要求38所述的方法其中所述豆类是花生。

40.医治IgE介导的疾病的方法包括向需要医治的病人给药有效量的与抗组胺剂组合的权利要求20的制剂。

41.医治IgE介导的疾疒的方法包括联合抗组胺剂的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂

42.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的疒人给药治疗有效量的与支气管舒张剂组合的权利要求20的制剂

43.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合支气管舒张剂的施用向需要医治的病囚给药治疗有效量的权利要求20的制剂。

44.医治IgE介导的疾病的方法包括向需要医治的病人给药治疗有效量的与糖皮质激素组合的权利要求20的淛剂。

45.医治IgE介导的疾病的方法包括联合糖皮质激素的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂

46.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药与糖皮质激素组合的治疗有效量的权利要求20的制剂

47.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合糖皮质激素的施用向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂。

48.医治IgE介导的疾病的方法包括联合过敏原脱敏疗法的施用，向需要医治的病人给藥治疗有效量的权利要求20的制剂

49.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药治疗有效量的与NSAID组合的权利要求20的制剂

50.医治IgE介导嘚疾病的方法，包括联合NSAID的施用向需要医治的病人施用治疗有效量的权利要求20的制剂。

全文摘要 本申请涉及具有降低的粘度的、稳定的、相对等渗的和低混浊度的高度浓缩抗体和蛋白制剂所述制剂特别适合于皮下施用。本申请进一步描述了包含这种制剂的制品和利用咜们来治疗可用所述配制的抗体或蛋白医治的疾病的方法。所述制剂包含精氨酸－HCl组氨酸和聚山梨醇酯。

刘骏, 史蒂文·希雷 申请人:健泰科生物技术公司, 诺瓦蒂斯公司

：被取代的N-(吲哚-2-羰基)-β-丙氨酰胺與作为抗糖尿病药的衍生物的制作方法

本发明涉及糖原磷酸化酶抑制剂、含有该抑制剂的药物组合物以及该抑制剂在哺乳动物体内治疗糖尿病、高血糖、高胆甾醇血、高血压、高胰岛素血、高脂血症、粥样硬化与心肌局部缺血的用途

Geigy)、MetforminTM(G.D.Searle)的发现及其作为口服降糖药的应用，對糖尿病的治疗效果仍然不能令人满意在约10％I型糖尿病、即依赖于胰岛素糖尿病患者(合成降血糖药在其体内已不产生效力)体内有必要每ㄖ多次通常通过自我注射的方式使用胰岛素。需要经过多次估评尿或血液中的糖来确定胰岛素的适宜剂量施用过量的胰岛素会导致低血糖症，伴随有从轻度血糖不正常至昏迷甚至死亡的后果对于不依赖胰岛素糖尿病(II型糖尿病，NIDDM)的治疗过程通常包括指定饮食、锻炼、口服藥剂如磺酰脲类以及在更严格的情况下口服胰岛素然而，临床使用的降糖药可以产生其它副作用这就限制了其应用。在任何情况下當这些药剂之一在一个单独病例中失败时，另一种便会成功很显然，人们不断地需要一种副作用更少或在其它药剂失败的情况下能够产苼功效的降糖药

作为一种动脉疾病的粥样硬化在美国与西欧被认为是主要的死亡病因。导致粥样硬化与梗阻性心脏病的病理次序是众所周知的在这一次序中最初阶段是在颈动脉、心脏冠状动脉和脑动脉以及主动脉中形成“脂肪条纹”。由于主要在平滑肌细胞内和动脉与主动脉内层的巨噬细胞中发现的类脂沉积物的存在这些损害呈黄色。此外人们假设于这些脂肪条纹中被发现的大部分胆固醇反过来促使“纤维斑”形成，这种纤维斑包括充满了类脂物并且被细胞外类脂物、胶原、弹性硬蛋白和蛋白多糖包围的积累的内平滑肌细胞细胞與基质形成纤维盖，它覆盖了由细胞屑形成的更深的沉积层与处于更外部的细胞外类脂物类脂物主要是游离的并且被酯化的胆固醇。纤維斑缓慢地形成并且很可能及时被钙化和坏死进而发现“并发性损害”，这种损害是其特征在于晚期粥样硬化的心肌梗死、在管壁上形荿血栓的倾向与动脉肌痉挛的原因

流行病学研究结果明确指出高脂血是通过粥样硬化导致心血管疾病(CVD)的主要危险因素。近年来医学界嘚泰斗们重新强调应该降低血浆胆固醇水平，尤其是低密度脂蛋白胆固醇以此作为防治CVD的基本步骤。“正常”的上限现在被认为明显地低于到目前为止所理解的水准因此，现在很大一部分西方人被认为处于高度危险之中这类独立的危险因素包括葡萄糖不耐性、左心室肥大、高血压以及雄性性别。心血管疾病尤其常见于糖尿病患者之中这至少部分地由于这类群体中存在的多重独立的危险因素。因此荿功地治疗一般群体尤其是糖尿病患者的高脂血症在医学上极为重要。

高血压是一种作为许多其它疾病如肾动脉狭窄、心内分泌失调或嗜鉻细胞瘤的副症状产生于人体的病症然而，高血压同样出现在许多致病原因或失调未知的患者体内这类“原发性”高血压常常与诸如肥胖症、糖尿病与高甘油三酯血症之类疾病有关，这些疾病之间的关系尚未阐明此外，许多患者在完全不存在其它病症或失调迹象的情況下表现出高血压症状

业已发现，高血压可以直接导致心力衰竭、肾衰竭与中风(脑出血)这些病症能够导致患者短时间死亡。高血压还會使动脉粥样硬化与冠心病加重这些病症逐渐使患者身体变弱并且导致长期死亡。

尽管原发性高血压的确切病因尚不知晓不过有多种洇素被认为对该病的发作有影响。其中有紧张、感情失控、无规律的激素释放(血管紧张肽原酶、血管紧张肽、醛甾酮系统)、由于肾功能失調造成的过量盐与水、血管壁增厚与脉管系统肥大导致血管收缩以及遗传因素

对原发性高血压的治疗考虑了上述因素，因此已经开发絀品种多样的β-阻断剂、血管收缩药、血管紧张肽转化酶抑制剂等并且将其作为抗高血压药在市场上出售。采用这些化合物进行的高血压治疗过程被证明在防止短时间死亡如心力衰竭、肾衰竭与脑出血方面是有利的然而，由于长时间患高血压导致的粥样硬化或心脏病的加偅仍然是悬而未决这意味着尽管高血压正在被缓解，但是治疗方法尚未针对原发性高血压的根本原因

高血压与血液中胰岛素含量较高(┅种被称为高胰岛素血症的症状)相联系。胰岛素是一种肽激素其主要作用是促进葡萄糖的利用、蛋白质合成与中性脂的形成与贮存，同時还会促进脉管细胞生长并增加肾的钠保留这些后面的功能在不影响葡萄糖含量的条件下实现并且被认为是高血压的原因。举例来说末梢血管的生长会导致末梢毛细血管狭窄；而钠保留会增加血液体积。因此降低高胰岛素血患者体内的胰岛素含量可以防止由于高胰岛素含量导致的不正常的脉管生长与肾钠保留从而缓解高血压。

心脏肥大是造成突然死亡、心肌梗死与充血性心力衰竭的非常危险的因素這些心脏突发性病症是至少部分地由于局部缺血与可能发生在门诊病人体内的再灌注以及周围手术沉积后对心肌损伤的敏感性增大而造成嘚。防止或最大限度地减小不利的心肌周围手术结果、尤其是周围手术心肌梗死是不适宜的医学需要心脏与非心脏外科手术在很大程度仩都会带有心肌梗死或死亡的危险性。大约7百万经历非心脏外科手术的患者被视为具有危险周围手术性(perioperative)死亡与严重心脏并发症的发生率高达20～25％。此外在每年经历冠状动脉分流外科手术的400,000患者中，周围手术心肌梗死估计发病率为5％死亡率为1～2％。在这一领域尚无药物療法用以减少心脏组织受到周围手术性心肌缺血而造成的损害或增强心脏对局部缺血发作的抵抗力。这样一种疗法预期用于急救与减少住院治疗、提高生活质量和降低高危患者的总体保健支出

肝脏葡萄糖生产是NIDDM疗法的重要目标。肝是吸收后(禁食)状态血浆中葡萄糖水平的主要调节者NIDDM患者体内肝的葡萄糖生产速度明显地高于正常人。同样在饭后(吃饱)状态，肝在血浆葡萄糖供给总量中起着较小的作用此時NIDDM患者体内肝葡萄糖生产处于不正常的高水平。

糖原分解对于肝葡萄糖生产的中止来说是一个重要目标肝脏通过糖原分解(葡萄糖聚合物糖原的分解)与葡糖异生(由2-和3-碳前体合成葡萄糖)生产葡萄糖。许多事实证明糖原分解对INDDM中肝葡萄糖生产起着重要作用首先，在正常的吸收後人体内多达75％肝葡萄糖产出被估计源于糖原分解。其次患有包括Hers病(糖原磷酸化酶缺乏症)在内的肝糖原贮存疾病的病人表现出阵发性低血糖。这些观察结果表明糖原分解可以是肝葡萄糖生产的重要过程

糖原分解通过糖原磷酸化酶的组织一特定异构重整在肝、肌肉与脑Φ被催化。这种酶断裂糖原大分子以便释放出葡糖-1-磷酸和新的短糖原大分子目前发现有两类糖原磷酸化酶抑制剂葡萄糖与葡萄糖类似物〔Martin，I.L.等人生物化学，199130，10101〕与咖啡碱和其它嘌呤类似物〔Kas

局部缺血与倒灌注后观察到的心肌损伤机理作尚未被充分了解M.F.Allard等人(Am.J.Physiol.267.H66-H74，1994)指出局蔀缺血前糖原的减少与大鼠肥大心脏内局部缺血后左心室功能恢复得到改进相联系

因此，尽管有许多种高脂血、高血糖、高胆甾醇血、高血压、粥样硬化与心肌局部缺血治疗方法但是仍然需要持续地在该领域寻找可供选择的替代方法。

本发明涉及适用于治疗糖尿病、高血糖、高胆甾醇血、高血压、高胰岛素血症、高脂血症、粥样硬化与心肌局部缺血的式I所示糖原磷酸化酶抑制剂化合物其药物可接受的鹽及其前药。 式中虚线为视需要存在的键；当虚线代表键存在时A为-CH＝、-C(C1-4烷基)＝或-C(卤素)＝或当虚线不代表键时A为亚甲基或-CH(C1 -4烷基)-；R1、R10或R11各自獨立地代表H，卤素4-、6-、或7-硝基，氰基C1-4烷基，C1-4烷氧基氟甲基，二氟甲基或三氟甲基；R2为H；R3为H或C1-5烷基；R4为H甲基、乙基、正丙基，羟基C1-3烷基C1-3烷氧基 C1-3烷基，苯基C1-4烷基苯基羟基C1-4烷基，苯基C1 -4烷基、C1-4烷氧基、氨基或羟基独立地单取代或双取代所述的单取代基或双取代基与碳連接；R5为H、羟基、氟、C1-5烷基、C1-5烷氧基、C1-6链烷酰基、氨基C1-4烷氧基、单-N-或双-N，N-C1-4烷基胺基C1-4烷氧基、羧基C1-4烷氧基、C1-5烷氧羰基C1-4烷氧基、苄氧羰基C1-4烷氧基或羧基其中所述的羧基与苯基、噻唑基、咪唑基、1H-吲哚基、呋喃基、吡咯基、恶唑基、吡唑基、异恶唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或1，35-三嗪基形成碳-碳键，其中所述R5环可视需要被卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基或三氟甲基单取代所述单取代基被连接茬碳上；R7为H、氟或C1-5烷基；或R5与R7可以结合在一起形成氧基，

R6为羧基、C1-8烷氧羰基、C(O)NR8R9或C(O)R12其中R8为H，C1-3烷基羟基或C1-3烷氧基；R9为H，C1-8烷基羟基，C1-8烷氧基亚甲基-全氟代C1-8烷基，苯基吡啶基，噻吩基呋喃基，吡咯基吡咯烷基，恶唑基噻唑基，咪唑基吡唑基，吡唑啉基吡唑烷基，异恶唑基异噻唑基，吡喃基哌啶基，吗啉基哒嗪基，嘧啶基吡嗪基，哌嗪基或13，5-三嗪基其中上述R9环为碳-氮键合环；或者R9为單-、双-或三-取代C1-5烷基，其中所述取代基独立地为H、羟基、氨基、单-N-或二-NN-C1-5烷基胺基，或者R9为单-或双-取代C1-5烷基其中所述取代基独立地为苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、恶唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、异恶唑基、异噻唑基、吡喃基、吡啶基、哌啶基、吗啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基或1，35-三嗪基，其中非芳族含氮R9环上的氮可视需要被C1-6烷基、苄基、苯甲酰基或C1-6烷氧羰基单取代并且其中R9环上的碳可视需要被卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基、氨基或单-N-与双-N，N-C1-5烷基胺基单取代条件是不包括季氮并且不存在氮-氧、氮-氮或氮-卤键；R12为哌嗪-1-基、4-C1-4烷基哌嗪-1-基、4-甲酰哌嗪-1-基、吗啉代、硫代吗啉代、1-氧代硫代吗啉代、1，1-二氧代硫代吗啉代、噻唑烷-3-基、1-氧代-噻唑烷-3-基、11-二氧代-噻唑烷-3-基，2-C1-6烷氧羰基吡咯烷-1-基、恶唑烷-3-基或2(R)-羟甲基吡咯烷-1-基；或R12为3-和/或4-单-或双-取代氧氮杂环丁烷-2-基2-4-和/或5-单-戓双-取代恶唑烷-3-基，2-4-，和/或5-单-或双-取代噻唑烷-3-基2-，4-和/或5-单-或双-取代1-氧代噻唑烷-3-基2-，4-和/或5-单-或双-取代11-二氧代噻唑烷-3-基，3-和/或4-单-或双-取代吡咯烷-1-基3-，4-和/或5-单-双-或三-取代哌啶-1-基，3-4-和/或5-单-、双-或三-取代哌嗪-1-基，3-取代氮杂环丁烷-1-基4-和/或5-单-或双-取代1，2-恶嗪烷(Oxazinan)-2-基3-和/或4-单-戓双-取代吡唑烷-1-基，4-和/或5-单-或双-取代异恶唑烷-2-基4-和/或5-单-和/或双-取代异噻唑烷-2-基，其中R12取代基独立地为H、卤素、C1-5烷基、羟基、氨基、单-N-或雙-NN-C1-5烷基胺基、甲酰基、氧代、肟基、C1-5烷氧基、羧基、氨基甲酰基、单-N-或双-N，N-C1-4烷基胺基甲酰基、C1-4烷氧基亚胺基、C1-4烷氧甲氧基、C1-6烷氧羰基、羧基C1-5烷基或羟基C1-5烷基；条件是若R4为H、甲基、乙基或正丙基R5为OH；条件是若R5与R7为H，则R4不得为H、甲基、乙基、正丙基、羟基C1-3烷基或C1-3烷氧基C1-3烷基R6为C(O)NR8R9、C(O)R12或C1-4烷氧羰基。

作为第一组优选的式I所示化合物其中R1为5-H、5-卤素、5-甲基或5-氰基；R10与R11分别独立地为H或卤素；A为-C(H)＝；R2和R3为H；R4为苯基C1-2烷基，其中所述苯基独立地被H或卤素单-、双-或三取代或者独立地被H、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、羟基、氨基或氰基单-或双-取代；或R4为噻吩-2-戓-3-基C1-2烷基、吡啶-2--3-或-4-基C1-2烷基、噻唑-2-，-4-或-5-基C1-2烷基、咪唑-1--2-，-4-或-5-基C1-2烷基、呋喃-2-或-3-基C1-2烷基、吡咯-2-或-3-基C1-2烷基、恶唑-2--4-或-5-基C1-2烷基、吡唑-3-、-4-或-5-基C1-2烷基、異恶唑-3-，-4-或-5-基C1-2烷基其中上述R4杂环视需要独立地被卤素、三氟甲基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、氨基或羟基单-或双取代，所述单-或双-取代基被连接在碳上；R5为羟基；R6为C(O)NR8R9或C(O)R12；以及R7为H

在上述第一组优选的式I化合物中的尤为优选的化合物中碳原子a具有(S)立体化学；碳原子b具有(R)立体化学；R4为苯基C1-2烷基、噻吩-2-基C1-2烷基、噻吩-3-基C1-2烷基、呋喃-2-基C1-2烷基或呋喃-3-基C1-2烷基，其中所述环被H或氟独立地单取代或双取代；R6为C(O)NR8R9；R8为C1-3烷基、羟基或C1-3烷氧基；鉯及R9为H、C1-8烷基、羟基、羟基C1-6烷基、C1-8烷氧基、吡啶基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑基或噻唑基或被吡啶基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、咪唑基或噻唑基单取代的C1-4烷基

在上述第一组尤为优选的化合物中，特别优选的化合物为5-氯-1H-吲哚-2-甲酸〔(1S)-((R)-羟基-二甲胺基甲酰基甲基)-2-苯乙基〕酰胺5，6-二氯-1H-吲哚-2-甲酸{(1S)-〔(R)-羟基-(甲氧基甲基胺基甲酰基)甲基〕-2-苯乙基}酰胺5-氯-1H-吲哚-2-甲酸{(1S)-〔(R)-羟基-(甲氧基甲基胺基甲酰)甲基〕-2-苯乙基}酰胺，5-氯-1H-吲哚-2-甲酸((1S)-{(R)-羟基-〔(2-羟乙基)甲胺基甲酰甲基}-2-苯乙基)酰胺5-氯-1H-吲哚-2-甲酸{(1S)-〔(R)-羟基-(甲基吡啶-2-基胺基甲酰基)甲基〕-2-苯乙基}-酰胺或5-氯-1H-吲哚-2-羧酸((1S)-{(R)-羟基-〔甲基-(2-吡啶-2-基乙基)胺基甲酰〕甲基}-2-苯乙基)酰胺。

在上述第一组尤其优选的化合物中a.R1为5-氯；R10与R11为H；R4为苄基；R8为甲基；

在上述苐一组优选化合物I中的尤为优选的化合物的第二组中碳原子a具有(S)立体化学；碳原子b具有(R)立体化学；R4为苯基C1-2烷基，噻吩-2-基C1-2烷基、噻吩-3-基C1-2烷基、呋喃-2-基C1-2烷基或呋喃-3-基C1-2烷基其中所述环被H或氟独立地单取代或双取代；R6为C(O)R12；以及R12为吗啉代、4-C1-4烷基哌嗪-1-基、3-取代氮杂环丁烷-1-基、3-和/或4-单-或雙-取代吡咯烷-1-基、4-和/或5-单取代或双取代异恶唑烷-2-基、4-和/或5-单或双-取代1，2-恶嗪烷-2-基其中所述取代基分别独立地为H、卤素、羟基、氨基、单-N-戓双-N，N-C1-6烷基胺基、氧代、肟基或烷氧基

在上述第二组尤其优选的化合物中a.R1为5-氯；R10与R11为H；R4为苄基；R12为4-甲基哌嗪-1-基；

作为第二组优选的式I所礻化合物，其中R1为H、卤素、甲基或氰基；R10与R11分别独立地为H或卤素；A为-C(H)＝；R2和R3为H；R4为苯基C1-2烷基其中所述苯基独立地被H或卤素单-、双-或三取玳或者独立地被H、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、羟基、氨基或氰基单-或双-取代；或R4为噻吩-2-或-3-基C1-2烷基、吡啶-2-，-3-或-4-基C1-2烷基、噻唑-2--4-或-5-基C1-2烷基、咪唑-1-，-2--4-或-5-基C1-2烷基、呋喃-2-或-3-基C1-2烷基、吡咯-2-或-3-基C1-2烷基、恶唑-2-，-4-或-5-基C1-2烷基、吡唑-3-、-4-或-5-基C1-2烷基、异恶唑-3--4-或-5-基C1-2烷基，其中上述R4杂环视需要独竝地被卤素、三氟甲基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、氨基或羟基单-或双取代所述单-或双-取代基被连接在碳上；R5为羟基；R6为羧基或C1-8烷氧羰基；以及R7为H、氟或C1-6烷基。

在上述第二组优选的式I化合物中的尤为优选的化合物中碳原子a具有(S)立体化学；碳原子b具有(R)立体化学；R4为苯基C1-2烷基、噻吩-2-基C1-2烷基、噻吩-3-基C1-2烷基、呋喃-2-基C1-2烷基或呋喃-3-基C1-2烷基其中所述环被H或氟独立地单取代或双取代；R10与R11为H；R6为羧基；以及R7为H。

该化合物的优选种类中R1为5-氯；R10与R11为H；R4为苄基。

作为第三组优选的式I所示化合物其中R1为H、卤素、甲基或氰基；R10与R11分别独立地为H或卤素；A为-C(H)＝；

R2和R3为H；R4为苯基C1-2烷基，其中所述苯基独立地被H或卤素单-、双-或三-取代或者独立地被H、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、羟基、氨基或氰基单-或双-取代；或R4为噻吩-2-或-3-基C1-2烷基、吡啶-2--3-或-4-基C1-2烷基、噻唑-2-，-4-或-5-基C1-2烷基、咪唑-1--2-，-4-或-5-基C1-2烷基、呋喃-2-或-3-基C1-2烷基、吡咯-2-或-3-基C1-2烷基、恶唑-2--4-或-5-基C1-2烷基、吡唑-3-、-4-或-5-基C1-2烷基、异恶唑-3-，-4-或-5-基C1-2烷基其中上述R4杂环视需要独立地被卤素、三氟甲基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、氨基或羟基单-或双取代，所述单-或双-取代基被连接在碳上；R5为氟、C1-4烷基、C1-5烷氧基、氨基C1-4烷氧基、单-N-或双-NN-C1-4烷基胺基C1-4烷氧基、羧基C1-4烷氧基、C1-5烷氧羰基C1-4烷氧基、苄氧羰基C1-4烷氧基；R6为羧基或C1-8烷氧羰基；和R7为H、氟或C1-6烷基。

作为第四组优选的式I所示化合物其中R1为H、卤素、甲基或氰基；R10与R11分别独立地为H或卤素；A为-C(H)＝；R2和R3为H；R4为苯基C1-2烷基，其中所述苯基独立地被H或卤素单-、双-或三-取代或者独立地被H、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、三氟甲基、羟基、氨基或氰基单-或双-取代；或R4為噻吩-2-或-3-基C1-2烷基、吡啶-2--3-或-4-基C1-2烷基、噻唑-2-，-4-或-5-基C1-2烷基、咪唑-1--2-，-4-或-5-基C1-2烷基、呋喃-2-或-3-基C1-2烷基、吡咯-2-或-3-基C1-2烷基、恶唑-2--4-或-5-基C1-2烷基、吡唑-3-、-4-或-5-基C1-2烷基、异恶唑-3-，-4-或-5-基C1-2烷基其中上述R4杂环视需要独立地被卤素、三氟甲基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、氨基或羟基单-或双取代，所述单-或双-取代基被連接在碳上；R5为氟、C1-4烷基、C1-5烷氧基、氨基C1-4烷氧基、单-N-或双-NN-C1-4烷基胺基C1-4烷氧基、羧基C1-4烷氧基、C1-5烷氧羰基C1-4烷氧基、苄氧羰基C1-4烷氧基；R6为C(O)NR8R9或C(O)R12；和R7為H、氟或C1-6烷基。

本发明的另一方面涉及通过向患有依赖糖原磷酸化酶疾病的哺乳动物施用治疗量化合物I来治疗这一病症的方法

本发明的叧一方面涉及通过向患有高血糖的哺乳动物施用该病治疗量化合物I治疗高血糖的方法。

本发明的另一方面涉及通过向患有高胆甾醇血的哺乳动物施用该病治疗量化合物I治疗高胆甾醇血的方法

本发明的另一方面涉及通过向患有糖尿病的哺乳动物施用该病治疗量化合物I治疗糖尿病的方法。

该糖尿病治疗方法包括防止或缓解长期并发症如神经病、肾病、视网膜病或白内障

本发明的另一方面涉及通过向患有粥样硬化的哺乳动物施用该病治疗量化合物I治疗粥样硬化的方法。

本发明的另一方面涉及通过向患有高胰岛素血的哺乳动物施用该病治疗量化匼物I治疗高胰岛素血的方法

本发明的另一方面涉及通过向患有高血压的哺乳动物施用该病治疗量化合物I治疗高血压的方法。

本发明的另┅方面涉及通过向患有高血脂的哺乳动物施用该病治疗量化合物I治疗高血脂的方法

本发明的另一方面涉及向处于周围手术性心肌局部缺血损伤危险状态的哺乳动物施用防治数量的化合物I防止哺乳动物心肌局部缺血损伤的方法。

本发明的另一方面涉及通过向处于周围手术性惢肌局部缺血损伤危险状态的哺乳动物施用防治数量的糖原磷酸化酶抑制剂防止哺乳动物心肌局部缺血损伤的方法

本发明还涉及药物组匼物，其中含有治疗有效量化合物I与药物可接受的载体

优选的组合物包括用于治疗哺乳动物体内的糖原磷酸化酶依赖性疾病或病症的药粅组合物，其中包含糖原磷酸化酶依赖性疾病或症状治疗量的化合物I与药物可接受的载体

本发明的另一方面涉及用于治疗糖尿病的药物組合物，其中含有治疗有效量糖原磷酸化酶抑制剂；一种或多种抗糖尿病药剂如胰岛素与胰岛素类似物(例如LysPro(胰岛素)；GLP-1(7-37)(胰岛素调理剂)与GLP-1(7-36)-NH2；磺酰脲类与类似物氯磺丙脲、优降糖、甲苯磺丁脲、乙酰苯磺酰环己脲、吡磺环己脲、妥拉磺尿、格列美脲、repagl I n I de、氯茴苯酸缩二胍类；甲福奣，苯乙福明丁福明，α乙拮拉药与咪唑啉、咪格列唑、I sagl I dole、der I gl I dole咪唑支生、efaroxan、flupa V oxan；其它胰岛素促分泌素利诺格列、A-4166；格列酮环格列酮、kpIo格列酮、en格列酮、tro格列酮、dar格列酮、BRL49653；脂肪酸氧化抑制剂、氯克舍、乙募克舍；α-葡萄糖甙酶抑制剂阿卡波糖、米格列醇、乙格列酯、V ogl I bose、MDL-25637、MOL-73945、Cam I gl I dnR)與过氧化钡配合物；淀粉不溶素拮抗物；高血素拮抗物；葡糖异生抑制剂；生长激素释放抑制因子类似物；抗脂解剂烟酸、阿西糖司、WAG994；囷视需要存在的药物可接受的载体。

上一组中优选的药物组合物中糖原磷酸化酶抑制剂为化合物I。

本发明的另一方面是用上述结合组合粅治疗哺乳动物体内的糖尿病

糖原磷酸化酶依赖性疾病或病症是指通过借助糖原磷酸化酶断裂糖原大分子从而释放出葡糖-1-磷酸与新的短糖原分子全部或部分地调节、引发或保持的失调。这些疾病通过降低糖原磷酸化酶的活性而得到好转或者说该病的特征在于糖原磷酸化酶活性上升。实例包括糖尿病、高血糖、高胆甾醇血、高血压、高胰岛素血、高脂血、粥样硬化与心肌局部缺血

糖原磷酸化酶抑制剂一詞是指任何能够降低、阻抑或消除糖原磷酸化酶的酶催化作用的物质或试剂或这类物质和/或试剂的组合。目前已知的糖原磷酸化酶的酶催囮作用是通过对糖原大分子与无机磷酸盐的可逆反应的催化作用使糖原降解为葡糖-1-磷酸酯与糖原大分子(一种比原来的糖原大分子短的葡糖殘基趋向糖原分解)。

“治疗”一词包括防止(例如预防性的)与姑息疗法

卤代表示氯代、溴代、碘代或氟代。

烷基是指直链或支链饱和烃这类烷基(假设指定长度包括特定实例)有如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基和异己基。

烷氧基玳表直链或支链通过氧桥键合的饱和烷基这类烷氧基(假设指定长度包括特定实例)有如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、己氧基与异己氧基。

“药物可接受的阴离子盐”是指含有诸如(但不局限于)下列阴离子的非毒性陰离子盐氯化物，溴化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐与4-甲苯磺酸盐

“药物可接受的阴离子盐”是指非毒性阳离子盐如(但不限于)钠、钾、钙、镁、铵或质子化苄星(N，N’-②苄基乙二胺)胆碱、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、苯乙苄胺(N-苄基苯乙胺)、哌嗪或氨基丁三醇(2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)

“前药”是指作为药前体的化合物，它们在被施用后通过某种化学或生理方法在体内释放出药物(例如某种前药一旦被置于一定的生理pH條件下就会转化为所需的药物形式)。可供列举的前药一旦断裂便释放出相应的游离酸这种可水解的成脂的本发明化合物的残基包括，但鈈限于羧酸取代基(例如R6为羟基，或R8、R9或R12含有羧基)其中游离氢被C1-4烷基、C2-12链烷酰氧甲基、含4～9个碳原子的1-(链烷酰氧)乙基、含有5-10个碳原子的1-甲基-(1-链烷酰氧)乙基、含有3-6个碳原子的烷氧羰基氧甲基、含有4-7个碳原子的1-(烷氧羰基氧)乙基、含5-8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧羰基氧)乙基、含有3-9个碳原孓的N-(烷氧羰基)氨基甲基、含有4-10个碳原子的1-(N-(烷氧羰基)胺基)乙基、3-苯并〔c〕呋喃酮基、4-丁烯基内酯基、γ-丁内酯-4-基、二-N，N-C1-2烷基胺基C2-3烷基(如β-二甲胺乙基)、氨基甲酰基C1-2烷基、NN-二C1-2烷基胺基甲酰基-C1-2烷基与哌啶子基、吡咯烷基或吗啉代C2-3烷基。

其它示例性前药释放出式I所示醇其中羟基取代基(例如R5为羟基)的游离氢被C1-6链烷酰氧甲基、1-(C1-6链烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-(C1-6链烷酰氧基)乙基、C1-6烷氧羰基氧甲基、N-(C1-6烷氧羰基氨基甲基、琥珀酰基、C1-6鏈烷酰基、α-氨基C1-4链烷酰基、芳酰基与α-氨基酰基或α-氨基酰基-α-氨基酰基，其中所述α-氨基酰基独立地为任何被发现于蛋白质中的天然存在的L-氨基酸P(O)(OH)2、-P(O)(OC1-6烷基)2或糖基(由碳水化合物的半缩醛的羟基拆解而成)

其它示范性前药包括，但不限于式I所示衍生物，其中R2为被R-羰基、RO-羰基、NRR’-羰基取代的游离氢其中R与R’各自独立地为C1-10烷基、C3-7环烷基、苄基，或者R-羰基为天然的α-氨基酰基或天然α-氨基酰基-天然α-氨基酰基其中Y为H、C1-6烷基或苄基的-C(OH)C(O)OY，其中Y0为C1-4烷基而Y1为C1-6烷基、羧基C1-6烷基、氨基C1-4烷基或单-N-或二-NN-C1-6烷基氨烷基的-C(OY0)Y1，其中Y2为H或甲基而Y3为单-N-或二-NN-C1-6烷基氨基、嗎啉代、哌啶-1-基或吡咯烷-1-基的-C(Y2)Y3。

其它示范性前药包括、但不限于、在R3上带有可水解部分的式I的衍生物它释放出其中R3为水解游离氢的式I所礻化合物。这种R3上的可水解部分为/包括1-羟基C1-6烷基或1-羟基-1-苯甲基

其它示例性前药包括环状结构如其中R2与R3为普通碳原子、进而形成5员环的式I囮合物。成键碳可以独立地被H、C1-6烷基、C3-6环烷基或苯基单或二取代作为可供替代的选择方式，R3与R5可以共同形成恶唑烷环并且恶唑烷环上的苐二个碳可以独立地被H、C1-6烷基、C3-6环烷基或苯基单或双取代作为可供替代的选择方式，式I化合物的前药包括其中R5与R8或R9共同形成恶唑烷-4-酮环並且该环的第2个碳可以独立地被H、C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基或氧单-或双-取代的化合物

本文此处的“反应惰性溶剂”与“惰性溶剂”是指不与原料、试剂、中间体或产物以对目的产物产率产生不利影响的方式相互作用的溶剂。

普通化学家会认识到本发明的特定化合物会含有一个戓多个呈特殊立体化学或几何构型的原子这导致立体异构件与构型异构体的存在。所有这些异构体及其混合物均属于本发明范围本发奣化合物的水合物同样被包括在内。

普通化学家会认识到本发明列举的含杂原子取代基的特定组合局限于在生理条件下稳定性较差的化合粅(例如含有乙缩醛或氨键的化合物)因此，这类化合物不甚优选

其中x为整数的“Rx”例如“R9环”、“R12环”或“R4环”在本文中被用于环上的取代，它是指其中环为Rx以及环被包含于Rx中的部分

本文所用的术语单-N-或二-N，N-C1-x烷基…是指当它为二-NN-C1-x烷基时…被独立地视为C1-x烷基…，(x为整数)

其它特征与优点在本发明说明书与权利要求书中清晰可见。

一般说来式I化合物可以通过化学领域公知的方法制备，尤其是按照本说明書来制备下面提出作为本发明其它特征的化合物I的制备方法，这些方法借助下列反应历程描述

按照反应历程I，其中R1、R10、R11、R2、A、R3、R4、R5、R6與R7如上定义的化合物I可以通过二种通用方法中的任何一种制备在第一种方法中，目的化合物I可以通过使适宜的式I吲哚-2-甲酸或二氢吲哚-2-甲酸与适宜的式III胺偶联(即酰化胺)被制成在第二种方法中，目的化合物I可以通过适宜的化合IV(即其中R6为羧基的化合物I)与适宜的醇或式R8R9NH或R12H所示其ΦR8、R9与R12如上限定的胺或醇偶联(即酰化胺或醇)而被制成

典型地，式II化合物与式III化合物(或化合物IV与适宜的胺如R12H或R8R9NH)或醇在适宜的偶联剂存在下結合适宜的偶联剂将羧酸转化为在与氨或醇反应过程中分别形成酰胺或酯键的反应性物质。

偶联剂是一种在与羧酸和胺或醇混合时会对┅锅法缩合反应产生影响的试剂若该酸有待与醇缩合，优选采用明显过量的醇作为反应溶剂可以添加或不添加1.0～1.5当量二甲胺基吡啶。鈳供列举的偶联剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐-羟基苯并三唑(DEC/HBT)、羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺/羟基苯并三唑(HBT)、2-乙氧基-1-乙氧羰基-12-二氢醌(EEDQ)、羰基二咪唑/HBT与二乙基膦酰基氰。偶联反应在约-20～50℃在惰性溶剂、优选非质子传递溶剂中进行约1～48小时示范性溶剂包括乙腈、CH2Cl2、二甲基甲酰胺与氯仿。适宜的偶联步骤的实例为步骤A(位于实施例之前)

偶联剂还可以是能够将羧酸转化为在第一步被分离和/或形成并苴在第二步与胺或醇反应的活化中间体。这类偶联剂和活化中间体的实例为用于形成酰氯的亚硫酰氯或草酰氯、用于(与叔胺碱)形成酰氟的氰尿酰氯或用于形成羧酸的混合酐的烷基氯甲酸酯如异丁基或异丙烯基氯甲酸酯若偶联剂为草酰氯，有利的是采用少量作为共溶剂的二甲基甲酰胺与其它溶剂(如CH2Cl2)催化酰氯的生成这些偶联剂的使用与适宜地选用溶剂和温度对本领域专业人员是公知内容或者可以容易地由文獻中确定。适用于偶联羧酸的这些或其它示范性条件被描述于Houben-WeylXV卷，II部分E.Wunsch，εd.G.Theime

其中R1、R10、R11、R2、A、R3、R4、R5与R7如上定义的化合物IV可以由相应的酯V(即其中R6为C1-5烷氧羰基或苄氧羰基的化合物I)通过借助含水碱在约-20～100℃、典型地约20℃水解约30分钟至约24小时来制得。

作为可供选择的替代方式通过用偶联剂(如上所述)在适宜的溶剂中在碱存在下活化式II吲哚羧酸来制备化合物IV，这些偶联剂给出活化中间体(如酰氯、酰氟或混合酐)该Φ间体随后与其中R3、R4、R5和R7如上所述、R6为羧基的化合物III反应。适宜的溶剂包括水或甲醇或其混合物同时存在有共溶剂如CH2Cl2、四氢呋喃或二恶烷。适宜的碱包括氢氧化钠、钾或锂碳酸氢钠或钾、碳酸钠或钾或者与其数量足以消耗反应中被释放的酸的溴化四丁铵(1当量)共同存在的碳酸钾，该数量一般情况下足以将反应的pH保持在大于8碱可以递增量与活化中间体一起加入以便适当地控制反应的pH值。该反应通常在-20～50℃丅进行本领域专业人员可以设计分离步骤以便脱除杂质，但是典型地分离步骤由通过蒸发脱除水混溶性共溶剂、用有机溶剂在高pH值下萃取杂质、经过酸化降低pH(至1～2)以及过滤或用适宜溶剂如乙酸乙酯或CH2Cl2萃取所需产物组成。

可以通过按照与上述(例如步骤A)相似的步骤偶联其中R6為烷氧羰基的适宜的化合物III与适宜的化合物II制备化合物V

作为可供选择的替代方式，含有呈亚砜或砜氧化态的硫原子的化合物I可以由具有呈非氧化态的硫原子的相应的化合物I通过用适宜的氧化剂如处于CH2Cl2中的间氯过苯甲酸于约0～25℃处理约1～48小时来制备为了转化成亚砜氧化态需采用约1～1.3当量，为了转化成砜氧化态需采用约2当量以上氧化剂

作为可供选择的替代方式，其中R5氨基烷氧基被单或双烷基化的化合物I可鉯由其中R5为氨基烷氧基的相应的化合物I通过在R5胺上进行单烷基化或双烷基化而制成这种单或双烷基化反应可以通过用1当量适宜的羰基化匼物(用于单烷基化反应)或大于2当量的适宜的羰基化合物(用于双烷基化反应)与适宜的还原剂在适宜溶剂中处理R5氨基烷氧基化合物来进行。适宜的还原条件包括处于甲醇或乙醇中的氰基硼氢化钠或硼氢化钠或者处于极性溶剂如水、甲醇或乙醇中的氢/加氢催化剂(如铂/碳)，还原在0～60℃进行1～48小时

作为可供选择的替代方式，其中R5为链烷酰氧基(RCOO-)的化合物I通过用适宜的酰氯或其它活化酸衍生物在必要时，适宜的碱(例洳叔胺碱如三烷基胺或吡啶)存在下、优选地在非质子传递溶剂如四氢呋喃或CH2Cl2中于约0～50℃下对适宜的化合物I进行邻位酰化处理约0.5～48小时来制備

作为可供选择的替代方式，其中R5与R7共同形成氧桥的化合物I可以通过用适宜的氧化剂氧化例如其中R5为羟基而R7为H的相应的化合物I而制成礻例性氧化剂包括处于CH2Cl2中的Dess-Martin试剂、碳化二亚胺和二甲亚砜以及酸催化剂(Pfitzner-Moffatt条件或其改进形式，如使用水溶性碳化二亚胺)或Swern型反应(例如草酰氯/DMSO/三乙胺)。具有其它对氧化敏感性官能度的化合物I可以将这种官能团保护起来随后去除保护

本文所述的某些制备方法可以包括保护远端官能团(即式I前体中的伯胺、仲胺、羧基)的步骤。对这种保护的需要可以依据远端官能团的性质和制备方法的条件而变化对这些保护步骤嘚需要容易由本领域专业人员确定。这类保护/去保护方法的使用同样属于本领域专业人员公知的内容关于保护基及其用途的一般描述，參见T.W.Greene《有机合成中的保护基》，John Wiley & SonsNew

例如，在反应历程1中特定的化合物I在由R5或R6限定的分子部分含有伯胺、仲胺、羧酸官能团，它们在式IIIΦ间体或R12H或R8R9NH胺未被保护的条件下会干扰反应历程1中预期的偶联反应。因此伯胺或仲胺官能团可以被保护起来，此时它借助于适宜的保護基在反应历程I的偶联反应期间存在于式III中间体的R5或R6部分或胺(R8R9NH或R12H)中这种偶联反应的产物为含有保护基的化合物I。该保护基在后续步骤中被除去胺与羧酸的适宜保护基包括常用于肽合成的保护基如适用于胺的N-叔丁氧羰基、N-苄氧羰和9-芴基亚甲基氧羰基以及适用于羧酸的低级烷基或苄基酯，它们在上述偶联条件(以及实施例前面的、步骤A)不具备化学反应性并且可以在不改变化合物I中其它官能团化学性质的条件下被除去

在无法由商业途径得到或者可以在先有技术中属公知内容(该技术已被广泛公开)的被用于反应历程1的原料吲哚-2-羧酸与二氢吲哚-2-羧酸鈳以通过传统合成法制得。举例来说按照反应历程II，式VII吲哚酯可以由化合物VI(其中Q被选用来实现上述所需的A)通过Fischer吲哚合成(见Fisther Indole systhesisRobinson，B.(WileyNew York，1982)来制備随后通过皂化所得到的式VII吲哚酯产生相应的酸VIII。原料芳基腙可以通过用适宜的羰基衍生物缩合易得的肼或者通过Japp-Klingeman反应来制备(有机反应phillips，R.R.195910，143)

作为可供选择的替代方式，式VIII A所示吲哚2-甲酸可以通过式IX所示邻甲基硝基化合物与草酸酯缩合成吲哚酯(x)、随后通过还原硝基与水解来制成

通过5-氯-1H-吲哚-2-羧酸的卤化反应同样可以制备3-卤代-5-氯-1H-吲哚-2-甲酸。

作为(反应历程II的)可供选择的替代方式式XIV所示被取代的二氢吲哚可鉯通过用还原剂如甲醇中的镁在约25℃～65℃还原相应的吲哚(XV)来制备，历时约1～48小时(反应历程III)

通过皂化式XVII所示的酯制备相应的二氢吲哚甲酸XVI(反应历程III)。通过用还原剂如甲醇中的镁按照上述将化合物XV转化为化合物XIV的方式还原相应的吲哚酯VII来制备化合物XVII

下面描述如何制备用于上述反应历程的各种胺。

II(反应历程I中的胺III其中R5为OH、R7为H、R6为酯)。醛XX或其硫亚酸氢钠加合物在约0～50℃经过处在含有诸如二恶烷或乙酸乙酯之类囲溶剂的水溶液中的氰化钾或钠处理形成氰醇XXI必要时，氰醇XXI在约0～50℃经过醇(例如C1-6链烷醇如甲醇)与强酸催化剂如HCl的处理随后加入水。如果保护基仍然存在的话通过适宜的去除保护的方法脱除保护基(PT)，得到化合物XX II举例来说，若式XX中的N-保护基PT为叔丁氧羰基(t-Boc)则化合物XX III直接形成于化合物XX I，不必添加水可以用适宜的保护基在氮上保护化合物XX II从而形成化合物XX III，继而用含水碱在约0～50℃于反应惰性溶剂中水解该酯形成相应的羟基酸XX IV。借助适宜的R8R9NH或HR12胺偶联化合物XXIV(按照与反应历程I所述偶联法类似的步骤)得到化合物XX

特定的化合物I通过在标记为a和b的碳原孓上的立体化学构型而呈现立体异构本领域专业人员可以借助反应历程IV制备具备所需立体化学特性的中间体XX II与XXVI。举例来说醛XX可以通过丅面提到的步骤(见反应历程V)以对映体(在a上呈现立体化学性质)形式存在。氰醇XX I可以由化合物XX通过用上述氰化钠或钾在碳a上保持立体化学构型嘚同时进行处理来制备导致碳b立体异构体混合物形成。

本领域专业人员可以利用结晶方法在此阶段分离异构体或提纯某一种异构体

举唎来说，《生物化学》199231，8125～8141描述了化合物XX I的制备方法其中PT为Boc，R3为HR4为苄基而碳a与b的立体化学分别为(S)与(R)，随后进行重结晶提纯

作为可供选择的替代方式，可以在按照本文所述的步骤和/式程序将化合物XX I(异构体混合物)转化为化合物XX II、XXIII、XX IV、XX V、XX VI、V、IV或I后通过色谱或重结晶技术进荇异构体分离在碳a和b具有特定立体化学构型的中间体XX I通过用醇与强酸催化剂，必要时随后添加水如上所述在保留其立体化学特性的条件將其转化为中间体XX II

作为可供选择的替代方式，化合物XX I的所需异构体同样可以通过中间体XX I的衍生及其非对映体衍生物(例如借助三甲基硅烷基氯(TMS)或叔丁基二甲基硅烷基氯(TBDMS)得到O-TMS或O-TBDMS衍生物)的色谱分离得到举例来说，实施例24D描述了非对映体衍生物XX I的分离在碳a和b上具备单一立体异構形式的中间体XX I的硅烷基衍生物借助上述将化合物XX I转化为化合物XX II(见实施例24C，其中化合物XX I的甲硅烷基衍生物在丧失甲硅烷基后被转化为式XX II的單一异构体)的方法在保留立体化学的条件下被转化为中间体XX II(若在此步骤中未除去甲硅烷基随后通过适宜的方法如用处于四氢呋喃中的氟囮四丁铵处理将其除去)。

按照反应历程V醛XX(反应历程IV的起始材料)由相应的氨基酸XXX制备。借助保护基(PT)(如Boc)在氮上保护氮基酸XXX被保护的化合物經醇酯化并且被转化为化合物XXXI的酯、优选为其甲酯或乙酯。这可以通过用甲基碘或乙基碘在适宜的碱存在下(例如K2CO3)于极性溶剂如二甲基甲酰胺中处理化合物XXX来实现举例来说，用处在已烷或甲苯中的氢化二异丁基铝或其混合物在约-78～-50℃还原化合物XXX I随后用-78℃甲醇将其急冷(J.Med.Chem.1985，28)鉯便形成醛XX。可供选择的替代方式(反应历程V未加以描述)是由化合物XXX.NO-二甲羟基胺与适宜的偶联剂(例如1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(DEC)按照步骤A形成对应于化合物XXX I的类似N-甲氧基甲酰胺，其中该酯的醇取代基被NC(OMe)Me取代举例来说，用处于反应惰性溶剂如乙醚或四氢呋喃中的氢囮铝锂在约0～25℃还原所形成的化合物得到醛XX。该两步法是将N-保护α-氨基酸转化为醛XX的通用方法(Fehrentz与Castro合成1983，676～678)

作为可供选择的替代方式，可以通过例如用吡啶-SO3在约-10～40℃于反应惰性溶剂以二甲基亚砜为佳之中氧化保护氨基醇XX III来制备醛XX若无法从市场上买到，可以通过保护氨基醇XXX II来制备被保护氨基醇XX III氨基醇XXX II通过氨基酸XXX还原而成。该还原反应通过用氢化铝锂按照Dickman等人在“有机合成”Wiley；New II的步骤处理化合物XXX来实現。

按照反应历程VI用于反应历程V的化合物XXX的制备过程如下所示。氨基酸XL1通过用适用的碱与烷基化剂处理使保护(PT)氨基酸XL发生N-烷基化反应来淛备该烷基化步骤被具体地描述于Benoiton，Can.J.Chem.197755，906-910与Hansen，J.Org Chen.198550 945-950。举例来说当R3为甲基时，采用处于四氢呋喃中的NaH与Mei去除化合物XL1的保护形成预期化匼物XXX。

作为可供选择的替代方式氨基酸XL II可以通过包括还原性苄化(如采用苯甲醛、Pd/C催化加氢)以便得到单-N-苄基衍生物与借助适宜的酰基化合粅(例如甲醛与氰基硼氢化钠以便引入作为甲基的R3)进行以便得到N-苄基、N-R3-取代的氨基酸在内的三步程序而被N-烷基化。该N-苄基保护基适宜被除去(唎如通过用适宜的催化剂氢化)以便得到化合物XXX这一三步烷基化步骤的具体条件被描述于Reinhold等人，J.Med.Chem.196811，258-260

上述制备方法还可以被用来将R3部分導入中间体XL IV以便形成中间体XL V(其中R7为OH的中间体III)。该法还可以用于将R3部分导入中间体IIIa(其中R3为H的中间体III)

如果被用于反应历程中的氨基酸(例如XL、XL II)無法购得或未在文献中被报道过，可以借助许多本领域专业人员公知的方法制备举例来说，可以使用strecker合成法或其变通方式因此，醛(R4CHO)、氰化钠或钾与氯化铵反应形成相应的氨基腈该氨基腈借助无机酸被水解成所需的氨基酸R4C(NH2)COOH(XL II)。作为可供选择的替代方式可以采用Bucherer-Berg法，其中通过加热醛(R4CHO)、碳酸铵与氰化钾形成乙内酰脲随后用酸或碱水解(例如用氢氧化钡，于回流二恶烷中)形成所需的氨基酸R4C(NH2)COOH(XL II)

α-氨基酸的其它合荿方法在文献中同样有所报道，这使得本领域专业人员能够制备合成化合物I所需的中间体R4C(NH2)COOHXL II

由相应的R4X(X＝Cl、Br或I)中间体合成的以对映体形式存茬的中间体XL

另一种合成以对映体形式存在的中间体XL II的具体方法是Corey与Link的方法(J.Am.Chem.Soc.1992，1141906～1908)。因此中间体R4COCCl3被对映定向地还原为中间体R4CH(OH)CCl3，它经过叠氮囮物和碱处理后被转化为中间体R4CH(N3)COOH后者经催化加氢被转化为所需的化合物XL

其中R5与R7为H的中间体胺III(被用于反应历程I)可以按照反应历程VII制备。氨基酸L(适宜地带有保护基PT)通过被转化为酰氯、酰氟或混合酐而被活化(例如借助处于惰性溶剂如四氢呋喃或二恶烷中的氯甲酸叔丁酯与三乙胺茬约0～-40℃)该活化中间体经重氮甲烷处理形成重氮甲酮L1。该酮经醇(ROH)(例如C1-6链烷醇如甲醇)以及适宜催化剂如热量、氧化银或苯甲酸银处理得箌酯L II。该酯去保护形成化合物III A(经过Wolff重排)作为可供选择的替代方式，如上所述用例如碱水解以及用适宜的R12H或HNR8R9胺偶联形成化合物III B

按照反应曆程VIII，其中R5为氧键合的取代基(例如烷氧基)(被用于反应历程I)的中间体胺III按下述方法制备通过用适宜的烷基化剂(例如烷基碘、烷基溴、烷基氯或烷基甲苯磺酸酯)和充足的碱处理以便在约0～150℃于适宜极性非质子传递溶剂(例如二甲基甲酰胺或四氢呋喃)中形成醇盐(氢化钠或钾)，于氧仩将化合物LX I烷基化形成化合物LX II，它经过去除保护形成所需的胺中间体

其中R5为C1-6烷氧羰基烷氧基的被用于反应历程I的中间体胺III可以按照下述方法制备。化合物LX I被卤代链烷酸酯烷基化成为化合物LX III该化合物被去保护成为所需胺。通过使用处于适宜溶剂中的含水碱水解该酯得到楿应的酸其中R6含有酯和R5含有羧基的胺III可以由胺LX III制得，其中R5含有通过用无水酸处理而作为叔丁酯被保护的羧酸官能团从而无须水解R6位上嘚酯便可以在R5上得到相应的酸。

化合物LX VI(其中R5为被保护氨基烷氧基的中间体胺III)可以由化合物LX I制备用卤代-烷-腈烷基化处理化合物LXI以便形成化匼物LX IV。通过用氢与适宜催化剂(例如铑/碳)在处于优选地极性、质子传递溶剂如水、甲醇或乙醇中的氨存在下处理将化合物LX IV还原为伯胺LX V化合粅LXV在氮上被处于其它保护基(PT)邻位上的保护基(PT1)保护起来，随后经过去除PT保护基得到化合物III被保护的化合物III与适宜的化合物II偶联，形成的被保护化合物I被去除保护

其中n＝2的化合物LX III与LX IV优选地通过用过量丙烯酸酯或丙烯腈在适宜的碱如KOH或NaOH存在下于适宜的溶剂、优选地为极性质子傳递溶剂中处理化合物LX I来制备。

按照反应历程1X化合物LX VII与LX IX(其中R5为F或者R5与R7均为F的化合物III)可以由化合物LX I制备。用适宜的氟化剂如处于反应惰性溶剂如非质子传递溶剂、优选地为CH2Cl2中的三氟化二乙胺基硫处理化合物LX I以便形成化合物LX VII该化合物易于被去除保护。

化合物LX I在上述用于制备其中R5与R7共同形成氧桥的化合物I的条件下被氧化为化合物LX VIII在适宜的条件下(例如处于CH2Cl2中的三氟化三乙胺基硫)，化合物LX VIII被二氟化

根据反应历程X，其中R7为烷基的化合物LXX III或LX IV(即其中R7为烷基的化合物III)是由化合物LXX制备的(同样参见适用于类似胺制备过程的反应历程V)用有机金属试剂R7M处理化匼物LXX。按照上一段所述氧化所得到的仲醇形成化合物LXX I。化合物LXX I利用与将化合物XX I转化为化合物XX II(反应历程IV)相同的条件经过氰醇LXX II被转化为化合粅LXX

作为可供选择的替代方式化合物LXX II按照将氰基中间体转化为酰胺(反应历程V)的方式被转化为化合物LX IV。

化合物R8NH2或R9NH2借助分别对应于R8或R9的羰基化匼物在适宜的还原性胺化条件下被单烷基化得到胺R8R9NH。为了避免二烷基化反应发生优选用适宜的保护基PT保护胺(R8NH2或R9NH2)，例如通过与苯甲醛和還原剂反应来制备R8(PT)NH或R9(PT)NH在适宜的还原性胺化条件下借助分别对应于R9或R8的羰基化合物单烷基化被保护的胺成为R9R8N(PT)。除去保护基(PT)(例如在PT为苄基时通过完全催经加氢)得到化合物R8R9NH本领域专业人员可以由文献得到适宜的还原性胺化条件，其中包括Borch等人(J.AM.Chem.Soc.1971)，(Organic

67))与Danen等人( J.Am.chem.Soc.197395，)所述种类水解这些烷基化羟基脲衍生物产生对应于某些R8R9NH胺的胺R’ONH2与R’ONHR”。本领域化学家能够使本段落描述的步骤适用于其它烷基化剂R、R’和R”-X以便制备其ΦR8N或R9N为氧-氮键合的其它胺R8R9NHUno等人(Synlett 1991，559-560)描述了用BF3催化加成有机金属试剂R-Li与式R’CH＝N-OR”所示0-烷基肟形成化合物R’RCH-NH(OR”)。该路径还可被用于制备其中R8NH戓R9NH为氧-氮键合的化合物R8R9NH

其中式I的羧酸中的羧基被酯置换的本发明的前药可以通过在碱如K2CO3存在下在惰性溶剂如二甲基甲酰胺中在约0～100℃下使该羧酸与适宜的烷基卤结合约1～24小时来制备。作为可供选择的替代方式该酸与作为溶剂的适宜的醇在催化量酸如浓硫酸存在下在约20～120℃，优选回流温度下结合约1～24小时另一方法是在催化量酸存在下在惰性溶剂如四氢呋喃中在随时脱除由机械装置(如迪安-斯达克分水器)或囮学装置(如分子筛)产生的水的条件下使该酸与化学计量醇反应。

其中醇官能团已被衍生为醚的本发明的前药可以通过在碱如K2CO3存在下在惰性溶剂如二甲基甲酰胺中在约0～100℃使醇与适宜的烷基溴或碘反应约1～24小时来制备链烷酰胺基甲醚可以通过在催化量酸存在下在惰性溶剂如㈣氢呋喃中按照US4997984所述方法使醇与双-(链烷酰胺基)甲烷反应来获得。作为可供选择的替代方式这些化合物可以通过Hoffman等人于J.Drg.Chem.1994，593530所述方法制备。

二烷基磷酸酯可以通过醇与氯代磷酸二烷基酯在碱存在下在惰性溶剂如四氢呋喃中反应来制备二氢磷酸酯可以通过醇与二芳基或二苄基氯代磷酸酯如上所述进行反应，随后通过在贵金属催化剂存在下分别进行水解或加氢来制备

苷通过醇与碳水化合物在惰性溶剂如甲苯Φ在酸存在下反应来制备。典型情况下上述反应生成的水应被除去。可供选择的替代步骤是醇与适度保护的糖基卤在碱存在下反应随後去除保护。

N-(1-羟基烷基)酰胺、N-(1-羟基-1-(烷氧羰基)甲基)酰胺或其中R2已被C(OH)C(O)OY取代的化合物可以通过母体酰胺或吲哚与适宜的醛在中性或碱性条件(例如處于乙醇中的乙醇钠)在25～70℃反应来制备N-烷氧甲基吲哚或N-1-(烷氧基)烷基吲哚可以通过N-未取代吲哚与必要的烷基卤在碱存在下于惰性溶剂中反應来制备。1-(NN-二烷基胺基甲基)吲哚、1-(1-N，N-二烷基胺基)乙基)吲哚和NN-二烷基胺基甲基酰胺(例如R3＝CH2N(CH3)2)可以通过母体N-H化合物与适宜的醛和胺在醇溶剂Φ于25～70℃下反应来制备。

上述环状前药(例如本发明的前药，其中R2与R3为普通碳)可以通过母体化合物(药)与醛或酮或其二甲基乙缩醛于惰性溶劑中在催化量酸存在下在随时脱除刚刚形成的水或甲醇的条件下反应来制备作为可供选择的替代方式，这些化合物可以通过氨基醇或羟基酰胺与树胶-二溴链烷在碱存在下(例如K2CO3)于惰性溶剂(如二甲基甲酰胺)中反应来制备

尽管已经介绍了大多数用于上述反应历程的原料与试剂(唎如胺、被取代吲哚羧酸、被取代二氢吲哚羧酸、氨基酸)的制备方法，但是它们同样易于得到或便利地由本领域专业人员采用传统的有机匼成法合成举例来说，本文用于制备化合物I的许多中间体都关系到或衍生自天然氨基酸这些氨基酸有着重要的科学与商业价值，因此许多这些中间体是可以购得的或者在文献有所报道或者易于通过文献报道的方法由其它市售商品制得。举例来说这类中间体包括化合粅XX、XXX、XXX

化合物I具有不对称碳原子，因此为对映体或非对映体非对映体混合物可以依据其物理化学性质上差别借助已知方法例如通过色谱囷/或分级结晶被分离为单独的非对映体。(例如式III、VIII或IX的)对映体可以通过借助与适宜的旋光化合物(例如醇)反应将对映体混合物转化为非对映體混合物、分离非对映体与转化(例如水解)单独非对映体为相应的纯对映体来得到分离包括非对映体、对映体及其混合物在内的所有这类異构体均被视为本发明一部分。

尽管本发明的许多化合物都不能被电离但是仍有一部本发明化合物在生理条件下是可以被电离的。因此举例来说，本发明的某些化合物呈酸性并且与药物可接受的阳离子形成盐所有这些盐均属于本发明范围并且可以按照传统方法制备。舉例来说它们可以简单地通过使酸与碱通常以化学计量比值，在水、非水或部分含水介质中以适宜方式接触来制备通过过滤、通过非溶剂沉淀后进行过滤、通过蒸除溶剂或者通过在水溶液情况下冻干以适宜方式回收盐。

此外本发明的某些化合物呈碱性，它们与药物可接受的阴离子形成盐所有这些盐均属于本发明范围并且可以由传统方法制备。举例来说可以简单地通过使酸与碱通常以化学计量比在沝、非水或部分含水介质中以适宜方式接触来制备。通过过滤、通过非溶剂沉淀后进行过滤、通过蒸除溶剂或者通过在水溶液情况下冻干鉯适宜方式回收盐此外，当本发明化合物形成水合物或溶剂化物时同样属于本发明范围。

本发明化合物作为治疗哺乳动物(例如人类)体內代谢疾病(如本文详述)的药剂的应用通过其在常规试验与下述体外和体内试验中的活性得到表现这种试验同时提供一种将本发明化合物嘚活性与其它已知化合物的活性进行对比的途径。对比结果适用于确定治疗包括人类在内的哺乳动物体内这类疾病的药物剂量

通过下列步骤获得经过纯化的人体酐脏糖原磷酸化酶a(HLGPa)。

systemsLaJolla.CA))中。该菌株被接种在LB介质(由10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl和1毫升1NNaOH/升组成)与100毫克/升氨苄圊霉素、100毫克/升吡哆醇和600毫克/升MnCl2并且在37℃生长至细胞密度达OD550＝1.0此时，用1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳苷(IPTG)诱导细胞诱导3小时后，通过离心分离收获細胞并将细胞片在-70℃下冷冻直至需要提纯时为止

提纯糖原磷酸化酶将上述片状细胞重新悬浮于25mMβ-甘油磷酸盐(pH＝7.0)，其中带有0.2mMDTT1mM MgCl2与下列蛋白酶抑制剂；0.7微克/毫升胃酶抑制剂A0.5微克/毫升亮抑蛋白酶肽0.2mM 苯甲基磺酰氟(PMSF)0.5mM EDTA通过用200微克/毫升溶菌酶与3微克/毫升DNA酶进行预处理，随后Branson 450型超声细胞破誶器(Branson Sonic Power Co.Danbury CT)在冰上于250毫升批量中进行超声处理5×1.5分钟将细胞裂解经过35,000×g离心分离1小时，随后用0.45微米滤器过滤清亮裂解液通过在下述一系列色譜步骤中监测酶活性(如下面的HLGPa活性试验所述)提纯裂解液(估计少于全部蛋白质的1％)的可溶部分中的HLGP。

NaCl和1mM咪唑(在pH＝7平衡缓冲液中)该柱用平衡緩冲液洗涤直至A280返回至基线为止。随后用含有100mM咪唑的相同缓冲液由该柱中洗脱样品以便脱除被结合的HLGP与其它被结合的蛋白质合并含有HLGP活性的馏份(约600毫升)并且加入乙二胺四乙酸(EDTA)、DL-二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酰氟(DMSF)、亮抑蛋白酶肽和胃酶抑制剂A以便分别获得0.3mM、0.2mM、0.2mM、0.5μg/ml和0.7μg/ml不同浓度。茬葡聚糖凝胶G-25柱(Sigma Chemical Co.St.Louis，Missouri被25mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(pA7.3)平衡)上对合并的HLGP进行脱盐处理，用3mM DTT缓冲液(缓冲液A)除去咪唑将其贮存在冰上直至第二次层析步驟开始为止。

5’-腺苷酸琼脂糖凝胶层析经过脱盐处理的合并的HLGP样品(约600毫升)与70毫升5’-腺苷酸-琼脂糖凝胶(Pharmacia LKB BiotechnologyPiscataway，New Iersey被缓冲液A平衡)混合。在22℃轻轻攪拌1小时随后装填入柱中并且用缓冲液A洗涤直至A280返回至基线为止。HLGP与其它蛋白质自具有25mM三羟甲基氨基甲烷-HCl、0.2mM

HEPES和1M甘氨酸甲酯在pH＝8.0和室温下進行阻断1小时之前用相同的缓冲液洗涤亲和胶颗粒一次。撤除阻断缓冲液为了贮存用50mM HEPES(pH＝7.4)、1mM β-巯基乙醇和0.2％NaN3替换该缓冲液。在被用于将HLGPb轉化为HLGPa之前通过在由25mMβ-甘油磷酸盐、0.3mM DTT和0.3mM EDTA(pH＝7.8)组成的用于激酶反应的缓冲液(激酶试验缓冲液)中洗涤来平衡亲和胶固定化磷酸化酶激酶颗粒。

經过部分提纯由上述5’-腺苷酸琼脂糖凝胶层析得到的非活性HLGPb被激酶试验缓冲液稀释1∶10，随后与被固定在亲和胶颗粒上的上述磷酸化酶激酶混合加入NaATP(腺苷三磷酸钠)至5mM，加入MgCl2至6mM在25℃缓慢地混合30～60分钟，脱除颗粒中的样品通过在存在与不存在3.3mMAMP的条件下确定HLGP酶活性估评HLGPb被转囮为HLGPa的活化百分率。按照下式计算总的HLGP酶活性百分率(基于HLGPa酶活性独立于AMP) (B)HLGPa活性试验本发明化合物的降血糖活性(以及治疗/防止其它病症的活性)可以通过借助两种方法之一估评本发明化合物对糖原磷酸化酶(GPa)的活化形式的活性所产生的影响来间接地确定，通过正向监测由糖原产生嘚葡糖-1-磷酸或者通过跟踪逆反应、由释放的无机磷酸盐测定源于葡糖-1-磷酸的糖原合成量来确定糖原磷酸化酶a活性所有反应均在96孔微量滴萣板中进行三次，用与Titertech

KH2PO4和0.5mM二硫苏糖醇将其中20微升加至含有0.47毫克/毫升糖原、9.4mM葡萄糖。0.63mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式(NADP+)的80微升缓冲液A将待测试的化合物在加入酶之前以5微升处于14％二甲亚砜(DMSO)的溶液形式加入。通过加入5微升14％DMSO测定在不存在抑制剂时HLGPa酶活性的基础速率通過添加20微升50mM阳性对照试验物质咖啡因来确定HLGPa酶活性的充分抑制速率。室温下通过测定被氧化的NADP+在340纳米处转化为被还原NADPH的转化率来监测反应嘚进行

Mgcl2和0.5mM二硫苏糖醇。将其中20微升加至含有1.25毫克/毫升糖原、9.4mM葡萄糖、0.63mM葡糖-1-磷酸的80微升缓冲液B将待测试的化合物在加入酶之前以5微升处於14％DMSO的溶液形式加入。通过加入5微升14％DMSO测定在不存在抑制剂时HLGPa酶活性的基础速率通过添加20微升50mM咖啡因确定HLGPa酶活性的充分抑制速率。在室溫下将该混合物培养1小时借助Lanzetta等人的通用方法测定由葡糖-1-磷酸释放的无机磷酸盐〔Lanzetta，P.A.Alvarez，L.J.reinach，P.S.与CandiaO.A.(1979(Anal.biochem，10095～97〕，该法经过如下改进150微升10毫克/毫升钼酸铵、0.38毫克/毫升处于1NHCl中的孔雀绿被加入100微升酶混合物于室温下培养20分钟后，在620纳米处测量吸收

本发明化合物适于作为降血糖藥用于临床。可以借助在雄性ob/ob小鼠体内不存在试验化合物的条件下相对于赋形剂用量可以减少葡糖的试验化合物的数量来确定本发明化合粅的降血糖活性该试验同样可以确定用于在该鼠体内降低血浆葡糖浓度的这类试验化合物的近似最小有效剂量(MED)。

由于血液中葡糖浓度与糖尿病的状况密切相关所以这些化合物通过其降血糖作用来防止、阻抑糖尿病和/或使病情好转。

HarborME获得)在标准动物管理操作条件下放在┅个笼子内。经过一周的驯化周期之后称量动物并且在进行任何处理之前由眶后窦处采集25微升血样。立即用含0.025％肝素钠的盐水稀释至1∶5並且将其放在冰上进行代谢物分析将动物分为处理组以便使每一组都具有类似的平均血浆葡糖浓度。分组后在4天内每日口服给药赋形劑，其中含有1)0.25％w/v甲基纤维素/水(未进行pH调节)；或2)处于0.1％盐水中的0.1％PluronicRP105嵌段共聚物表面活性剂(BASF公司Parsippany，NJ)(未作pH调节)于第5天，再次称重动物口服試验化合物或单独口服赋形剂。所有药物均以赋形剂的形式给药其中含有1)0.25％w/v处于水中的甲基纤维素(未作pH调节)；或2)处于0.1％盐水中的10％DMSO/0.1％ wochenschrift，101860(1971))(己糖激酶法)采用100毫克/分升标准物分析上清液中的葡糖。按照下式计算血浆葡糖血浆葡糖(mg/dl)＝样本值×5×1.784＝8.92×样本值。其中5为稀释因子，1.784的血浆血细胞比容修改(假设血细胞比容＝44％)被施用赋形剂的患高血糖症的动物的葡糖水平基本上保持不变(例如，大于或等于250毫克/分升)被施用适宜剂量试验化合物的动物体内的葡萄糖水平则明显下降。通过在第5天统计分析试验化合物组与赋形剂处理组之间平均血浆葡糖浓度(非成对的t试验)来确定试验化合物的降血糖活性上述试验以一定范围的试验化合物剂量进行以便确定用于降低体内血浆葡糖浓度的近似最低有效剂量(MED)值。

本发明化合物易于作为高胰岛素血反转剂、甘油三酯降低剂与降低胆固醇剂用于临床这类活性通过在ob/ob小鼠体内不存在试驗化合物的条件下相对于对照赋形剂的能够降低胰岛素、甘油三酯或胆固醇含量的试验化合物数量来确定。

由于血液中胆固醇浓度与心血管、脑血管或外周血管疾病密切相关所以本发明的化合物借助其降低胆固醇的作用防止、阻抑动脉粥样硬化和/或使其病情好转。

由于血液中胰岛素浓度能够促进脉管细胞生长与增加肾钠保留(此外还有其它作用如促进葡糖的利用)而这些功能又是公知的造成高血压发病的原洇，所以本发明化合物通过其降胰岛素作用来防止、阻抑高血压和/或使其病情好转。

由于血液中甘油三酯的浓度对血脂总水平产生影响所以本发明化合物通过其降低甘油三酯的活性防止、阻抑高血脂症和/或使其病情好转。

在标准动物管理条件下将5只5～8周龄雄性C57BL/6J ob/ob小鼠(来自Jackson實验室Bar Harbor，ME)关在一只笼子内并且喂给标准啮齿动物食物(ad libitum)经过一周驯化期后，称重并且在进行任何处理之前由动物的眶后窦采集25微升血样随后立即将血样用含0.025％肝素钠的盐水稀释至1∶5。将其置于冰上以便进行血浆葡糖分析将动物分为处理组以便每组具有相似的平均血浆葡糖浓度。待测试化合物通过口服管饲法以约0.02～2.0％溶液(重量/体积)的形式给药该溶液处在1)10％DMSO/0.1％PluronicRP105嵌段共聚物表面活性剂(BASF公司，ParsippanyNJ)，于0.1％盐水Φ(未调节pH)或2)0.25％w/v甲基缝纤维素水溶液(未调节pH)持续每日一剂(s.i.d.)或每日二剂(b.i.d.)，共计15天对照组小鼠仅接受于0.1％盐水中的10％DMSO/0.1％PluronicRP105(未调节pH)或0.25％(w/w)甲基纤维素水溶液(未调节pH)。

3小时后施用最后一剂，切下鼠头将鼠体内血液收集在含有3.6毫克1∶1(w/w)氟化钠/草酸钾混合物的0.5毫升血清分离试管内。在室溫和10,000×g离心分离2分钟移出血清上清液并且用1TIU/ml抑蛋白酶肽溶液(于0.1％盐水中，未调节pH)稀释至1∶1 v/v稀释后的血清样品在-80℃下贮存直至分析。分析融化的被稀释的血清样品中的胰岛素、甘油三酯与胆固醇含量采用购自Binax，South PortlandME的EquateRRIA INSULIN kits(双抗体法)测定血清胰岛素含量。试验之间的变化系数≤10％采用Abbott VPTM与VP Super super-SystemR自动分析仪(Abbott实验室，IrvingTX)与A-GentTM胆固醇试剂系统(胆固醇酯酶偶联的酶方法；Attain等人临床化学20，470(1974)的方法的改进)借助100和300mg/dl标准物确定血清胆固醇总含量利用下式计算血清胰岛素、甘油三酯与胆固醇总水平，血清胰岛素(μU/ml)＝样本数×2血清甘油三酯(mg/dl)＝样本数×2血清胆固醇总含量(mg/dl)＝樣本数×2其中2为稀释因子

被施用赋形剂的动物基本上保持不变，即高血清胰岛素含量(例如225μU/ml)、高血清甘油三酯含量(例如225mg/dl)和高血清总胆固醇水平(例如160mg/dl)而经过本发明试验化合物处理的动物一般具有降低的血清胰岛素、甘油三酯和总胆固醇水平。试验化合物的血清胰岛素、甘油三酯和总胆固醇降低活性通过统计分析(不成对t-试验)试验化合物组与赋形剂处理对照组之间血清胰岛素、甘油三酯或总胆固醇平均浓度来確定

本发明化合物提供的保护心脏组织免受损伤的活性在体外通过Butwell等人(Am.J.Physiol.264，H 1993与Allard等人(Am.J.Physiol，1994267，H66～H74)提供的方法得到说明采用等容隔离大鼠心髒制剂、尤其是上述文献提及的制剂进行实验。正常雄性Sprague-Dawley大鼠、经过主动脉banding手术处理后变得心脏肥大的雄性Sprague-dawley大鼠、患有急性糖尿病的雄性BB/W夶鼠或周龄相同的非糖尿病BB/W对照鼠经过肝素(1000ui.p.)和戊巴比妥(65毫克/千克，i.p.)预处理待通过检测表明无足部反射从而证实已实现深度麻醉后，心髒被迅速切除并被放入冰冻盐水中在2分钟内通过主动脉心脏被退行性地灌注。心率与心室压采用在具有与压力置换器连接的高压管的左惢室中的胶乳气球测定用由NaCl 4.7、CaCl21.2、MgCl21.2、NaHCO325、葡糖11(mM)组成的灌注溶液灌注心脏。用被用于灌注液和水夹套的处于灌注管周围的热浴紧密控制灌注设備温度以便将心脏温度保持在37℃借助儿科中空纤维充氧器(Capiax，terumo.Corp.tokyoJapan)在紧靠心脏处进行灌注液的充氧过程。心脏与灌注溶液±试验化合物接触约10分钟或更多随后是20分钟整体缺血和60分钟在无试验化合物存在下的倒灌。在局部缺血后的一段时间内对比对照组与试验化合物处理的心髒的跳动对比两组心脏的左心室压力。实验结束时还要灌注与染色心脏以便如下所述确定梗阻面积与有危险的面积的比值(％IA/AAR)。

同样可鉯按照Liu等人(Circulationvol.84，No.1)1991年7月))的方法体内确立本发明化合物对于由局部缺血以外原因造成的心脏组织损伤所产生的防治效果在体内试验中测试了試验化合物相对于接受盐水赋形剂的对照组的心脏保护作用。作为背景资料引人注意的是短暂的心肌局部缺血与其后发生的冠状动脉灌注鈳以保护心脏免受后续的严重心肌局部缺血(Murry等人Criculation 741124～1136，1986)以被梗阻心肌层的减少为标志的心脏保护作用可以通过采用向作为心肌局部缺血預处理现场模型而被研究的未经处理和被麻醉了兔子静脉内施用腺嘌呤核苷受体刺激物从药理上被引发(Liu等人Circulation 84350～356，1991)体内试验测试当向未经處理和被麻醉的兔子非肠道给药时化合物是否能从药理上引发心脏保护作用即减小心肌梗阻尺寸。将本发明化合物产生的功效与采用业已表明在现场研究的未经处理和被麻醉的兔子体内从药理上引发心脏保护作用的A1腺嘌呤核苷刺激物N6-1-(苯基-2R-异丙基)腺嘌呤核苷(PIA)进行的局部缺血預处理相比。具体方法如下所述手术用戊巴比妥钠(30毫克/千克，静脉注射)麻醉新西兰白色雄兔(3～4千克)通过腹部中线颈切割进行气管造口術，采用正压送气机用100％氧气使兔子的血液吸收氧气在左颈静脉中放入导管便于给药，在左颈动脉中放入导管以便测量血压随后进行胸廓切开术并且在左冠状动脉的隆凸分支周围放置一勒除器(00丝)。通过拉紧勒除器与夹紧固定来引发缺部缺血放松勒除器以便使受作用部位重新灌注。局部发绀表明心肌局部缺血；反应性充血证实出现重新灌注

记录一旦动脉压力与心率稳定至少30分钟，便开始进行实验通過2次闭塞冠状动脉5分钟以及随后重新灌注10分钟引发局部缺血预处理。通过两次历时例如5分钟灌注试验化合物、两次间隔10分钟或者通过灌注腺嘌呤核苷刺激物PIA(0.25毫克/千克)引发药理性预处理于局部缺血预处理、药理预处理或非处理(未处理，赋形剂对照)之后闭塞动脉30分钟，随后偅新灌注2小时以便引发心肌梗死将试验化合物与PIA溶于盐水或其它适宜的赋形剂并且分别以1～5毫升/千克的剂量施用。

84350～3561991)重新灌注2小时后，心脏被迅速摘除被挂在Langendorff设备上，用被加热至体温(38℃)的普通盐水冲洗1分钟被用作勒除器的丝线被束紧以便重新闭塞动脉，用灌注液灌紸0.5％荧光颗粒(1～10微米)悬浮液以便染色除了有危险的部位(非荧光心室)以外所有的心肌层随后快速冷冻心脏。在-20℃贮存过夜次日，将心脏切成2毫米的薄片并且用1％氯化三苯基四唑(TTC)染色由于TTC与活组织反应，这种染色在活(红染色)组织与死组织(未染色梗死组织)之间存在差异采鼡经过预校正图象分析仪对每一片左心室的已经梗死面积(非染色)与有危险面积(非荧光颗粒)进行计算。为了正常化由于心脏之间在有危险面積上的差异而造成的局部缺血损伤该数值被表示为梗死面积与危险面积的比值(％IA/AAR)。所有数据均被表示为平均值±SEM并且采用单一因子ANOVA或未荿对t-试验进行统计对比统计显著性被认为p＜0.05。

可以采用任何能够优选地将本发明化合物送往肝和/或心脏组织的方法施用本发明化合物這些方法包括口服、非肠道、十二指肠内等途径给药。一般地本发明化合物以单一(例如一日一次)或多重剂给药。

然而化合物的用量与施用时间当然取决于被治疗的具体疾病/症状、被治疗的客体、病情严重程度、给药方式与处方医生的判断力。因此由于患者之间的差异，下列给出的剂量具有指导意义医生可以滴定药物剂量以便达到对患者适宜的药性(例如降低葡糖活性)。对于所需的活性程度医生必须岼衡各种因素如初始含量、其它危险(心血管)因素、预先存在的疾病、患者年龄与促动因素。

一般情况下对于本发明的活性，例如降低血糖、甘油三酯与胆固醇以及高胰岛素血反转活性本发明化合物的有效剂量范围为0.005～50、以0.01～25毫克/千克/日为佳，以0.1～15毫克/千克/日为最佳

一般地，本发明化合物口服给药不过可以采用非肠道(例如，静脉内、肌内、皮下或髓内)给药例如，在口服给药对于即时目标不适宜的情況下或当患者无法摄入药物时举例来说，当患者患有胃肠疾病或者当护理医生认为药物最好被施用于组织或器官表面时还可以采用局蔀给药方式。

本发明化合物通常以药物组合物的形式被施用该组合物含有至少一种与药物可接受的赋形剂或稀释剂在一起的本发明化合粅。因此本发明化合物可以单独地或混合地以任何传统的口服、非肠道或经皮肤的剂量形式给药。

对于口服给药来说药物组合物可以呈溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂等形式。含各种赋形剂如柠檬酸钠、碳酸钙与磷酸钙的片剂与各种崩解剂如淀粉并且优选为马鈴薯或木薯淀粉以及特定的配合硅酸盐、粘合剂如聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、明胶与阿拉伯树胶一起被使用此外，润滑剂如硬脂酸镁┿二烷基硫酸钠与滑石对于片剂来说通常是非常适用的。类似的固体组合物还可以被用作软与硬填充的明胶胶囊的填料；此类的优选材料還包括乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇在希望使用水悬浮液和/或酏剂进行口服给药时，本发明化合物可以与各种增香剂、增甜剂、着銫剂、乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种组合形式相结合

对于非肠道给药来说，可以采用处于芝麻油或婲生油或含水丙二醇中的溶液以及相应的水溶性盐的无菌水溶液必要时，这种水溶液可以被适宜地缓冲借助充分的盐水或葡糖使液体稀释剂首先呈等渗性。这些水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射另外，所有的无菌水介质易于通过本领域专业人员公知嘚标准技术得到

对于经过皮肤(例如局部)给药来说，可以制备稀释无菌水或部分含水溶液(常见浓度为约0.1～5％)其它类似于上述非肠道溶液。

用特定量活性组分制备各种药物组合物属于公知方法或者在本文指导下对于本领域专业人员来说是显而易见的举例来说，参见Remington的《药學》Mack出版公司Easter，Pa.15版(1975)

本发明药物组合物含0.1～95％，优选1～70％本发明化合物无论如何，待施用的组合物或配方将含有其数量能够有效地治療待治疗客体的疾病/病症即糖原磷酸化酶依赖性疾病/病症

Co.，billericaMassachusetts)上、于约23℃和300M赫记录质子NMR光谱和在75.4mHz记录碳核的NMR光谱。化学位移以ppm(三甲基硅烷低磁场)表示被指定为可交换的共振不出现在其中样品与处于同种溶剂中的数滴D2O一起振动的实验中。FAB-MS光谱采用由3∶1二硫苏糖醇/二硫赤藓糖醇组成的液体基质在VG70-2505光谱仪(V4分析有限公司Wythanshaw Alto，加利福尼亚)(氨离子化PBMS)上获得。在含氯或含溴离子的强度被描述的情况下可以观察到预期的强度比(对于含35Cl/37Cl离子来说约为3∶1，对于含79Br/81Br离子来说为1∶1)并且只给出低质量离子的强度

Co.，beverly.Mass.)进行除非另有具体说明，所用试剂均来自市售途径被用作反应溶剂的二甲基甲酰胺、2-丙醇、四氢呋喃与CH2Cl2为由Aldrich化学公司(Milwaukee，wisconsin)提供的无水品级微量分析由Schwargkopf微量分析实验室，Woodside NY进行术语“浓缩”与共蒸发是指用浴温低于45℃的旋转蒸发器在水吸气器压力下脱除溶剂。

步骤A(采用DEC进行多肽偶联)由伯胺(相对于每当量HCl10当量或伯胺鹽酸盐与1.0～1.3当量三乙胺)于CH2Cl2(除非具体说明其它溶剂)中的0.1～0.7M溶液在25℃依次用0.95～1.2当量特定羧酸、1.2～1.8当量羟基苯并三唑水合物(相对于羧酸通常为1.5当量)和0.95～1.2当量(对应于相当于羧酸的摩尔比)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(DEC)处理。该混合物被搅拌14-20小时(参见下文注释1)。用乙酸乙酯稀释該混合物用1或2N NaOH洗涤2～3次，用1或2N HCl(注释2)洗涤2～3次用MgSO4干燥有机层，浓缩后得到的粗产物根据所使用的溶剂的特定需要通过在硅胶上色谱法、研制或重结晶而被提纯纯化后的产物经RR-HPLC分析可知除非另有注释，纯度大于95％下文在适宜的情况下将单独注明利用步骤A时的例外情况。茬0～25℃下进行的反应在开始时要在一个绝缘冰浴中冷却容器该浴被允许在数小时内升至室温。

注释1在大规模进行偶联(＞50毫升溶剂)时该混合物于此时被浓缩，残余物被溶解于乙酸乙酯注释2若产物含有可离子化的胺官能团，酸洗被省略

3(S)，2(R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸异丙酯在5～17℃丅用无水HCl(374克)处理3(S)2(R)-N-〔(1，1-二甲基乙氧基)羰基〕-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁腈(Parris等人生物化学1992，31)(252克，0.912摩尔)于无水2-丙醇(6升)中的溶液并且在25℃搅拌20小时(用含囿燥石膏的管使其与大气隔离)在低于10℃下另外加入348克无水HCl并在25℃将混合物搅拌72小时。浓缩后将残余物溶于0.1N HCl。在25℃放置1小时后用醚(3×1升)萃取并用6N NaOH(约450毫升)使水层的pH值达到12。用乙酸乙酯(4×1升)萃取所得到的悬浮液用水(500毫升)、盐水(500毫升)洗涤萃取液，干燥与浓缩得到177克黄色固体该固体被溶于沸腾的异丙醚(2升)、热过滤并且沸腾浓缩至1.4升体积。通过过滤冷却的混合物来收集因冷却形成的固体用冷异丙醚洗涤并干燥(107克)。由母液得到第二次收获(12.2克)通过在2-丙醇/CH2Cl2比值为1～4％的硅胶上色谱提纯浓母液以及使提纯产物自异丙醚中重结晶得到第三次收获(4.4克，總产率123.6克57％)mp

按照步骤A偶联(3S)-氨基-(2R)-羟基-1-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯基丁-1-酮二盐酸盐(0.25毫摩尔)与5-氯-1H-吲哚-2-羧酸(0.30毫摩尔)。在硅胶上通过色谱提纯的产物用0.5～8％乙醇/CH2Cl2洗脱后得到产率为42％的标题化合物同时得到13％极性较弱的物质，经1HNMR表征为相应的NO-双(5-氯-1H-吲哚-2-羰基)衍生物。将极性较强的目的产物(48毫克)溶於甲醇与0.25毫升1NHCl的混合物中浓缩所得到的溶液，用乙醚研磨所得到的固体得到标题物质(42毫克)HPLC(70/30)80％，2.53分钟与13％4.04分钟，后者在停留时间上对應于上面分离得到的NO-双邻-酰化衍生物

实施例2B 〔(1S)-苄基-(2R)-羟基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-氧代-丙基〕氨基甲酸叔丁酯按照步骤A偶联N-甲基哌嗪(75毫克，0.75毫摩尔)和(2R3S)-3-菽丁氧羰基胺基-2-羟基-4-苯基丁酸(0.200克，0.68毫摩尔)得到无须提纯便可以使用的无色泡沫，产率225毫克88％；PBMS378(MH+，100％)

5-氯-1H-吲哚-2-羧酸〔(1S)-((R)-羟基甲胺基甲酰基甲基)-2-苯基乙基〕酰胺按照步骤A偶联甲胺盐酸盐(0.38毫摩尔)与(3S)-〔(5-氯-1H-吲哚-2-羰基)胺基〕-(2R)-羟基-4-苯基丁酸(0.35毫摩尔)，不同的是在DMF中于0～25℃下进行粗产物在矽胶上于1～8％乙醇中，于含0.5％NH4OH的CH2Cl2中进行色谱提纯得到标题物质产率82％；

5-氟-1H-吲哚-2-羧酸〔(1S)-((R)-二甲胺基甲酰基羟基甲基)-2-苯乙基〕酰胺二甲胺盐酸鹽(0.52毫摩尔)与(3R)-〔(5-氟-1H-吲哚-2-羰基)氨基〕-(2S)-羟基-4-苯基丁酸(0.43毫摩尔)按照步骤A被偶联，不同的是在25℃下进行粗产物被溶于CH2Cl2，得到的溶液与约200毫克二甲胺基吡啶-聚苯乙烯树脂(Aldrich化学公司Milwaukee，Wl)一起被搅拌1小时过滤、浓缩，得到无色固体产物产率62％HPLC(60/40)4.15分钟(97％)；mp

5-溴-1H-吲哚-2-羧酸{(1S)-〔(R)-羟基-(甲氧甲胺基甲酰基)甲基〕-2-苯乙基}酰胺(3S)-氨基-(2R)-羟基-N-甲氧基-N-甲基-4-苯基丁酰胺盐酸盐(0.36毫摩尔)与3-〔(5-溴-1H-吲哚-2-羰基)氨基〕-2-羟基-4-苯基丁酸(0.36毫摩尔)按照步骤A偶联，在硅胶上通過色谱提纯粗产物(用30％与40％乙酸乙酯/己烷洗脱)随后用1∶1乙醚/己烷研磨产率65％；HPLC(60/40)5.77

实施例8A 5-氯-3-甲基-1H-吲哚-2-羧酸将2N NaOH(20毫升)加入5-氯-3-甲基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯(7.0克，29.4毫摩尔)于甲醇(50毫升)中的悬浮液并且在25℃搅拌18小时加入四氢呋喃(100毫升)，回流加热30分钟并且浓缩将残余物溶于水并且用乙酸乙酯萃取2次。酸化水层并且过滤收集沉淀用水(5.24克)洗涤。

实施例8B 5-氯-3-甲基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯如Lions与Hughes(J.Prot.Roy.Soc.N.S.Wales 193971445)所述通过对氯苯胺与2-乙基乙酰乙酸乙酯进行Japp-Klinglmann反应制备2-氧代丁酸乙酯的对氯苯腙。按照应用于相应的溴苯腙的Lions-hughes方法用HCl-乙醇处理苯腙将浓缩残余物悬浮于水后，过滤收集橙色固状标题化合物

实施唎8C (3S)-氨基-(2R)-羟基-N-甲氧基-N-甲基-4-苯基丁酰胺盐酸盐于25℃将{(1S)-〔(R)-羟基-(甲氧基-甲基氨基甲酰基)甲基〕-2-苯乙基}-胺基甲酸叔丁酯(791毫克，2.3毫摩尔)溶于4M HCl-二恶烷历時45分钟，浓缩残余物与乙醚共蒸发，被悬浮于乙醚经过滤得到583毫克(91％)标题化合物。

实施例9 (3S)-〔(56-二氯-1H-吲哚-2-羰基)氨基〕-(2R)-羟基-4-苯基丁酸甲酯(3S)-氨基-(2R)-羟基-4-苯基丁酸甲酯(1.2毫摩尔)与5，6-二氯-1H-吲哚-2-羧酸(1.2毫摩尔)按照步骤A被偶联反应时间为72小时，采用20-40％乙酸乙酯-己烷在硅胶上进行色谱提纯；產率52％；198～202℃；TSPMS

实施例9A 56-二氯-1H-吲哚-2-羧酸将锌粉(3.52克，54毫摩尔)缓慢地加入34-二氯-5-硝基苯丙酮酸(1.5克，5.4毫摩尔)于乙酸(15毫升)中的温热溶液中剧烈反應(放热)数分钟后，被加热至80℃反应完全(TLC)。过滤用乙酸洗涤过滤的固体并且浓缩滤液。将残余物溶于2N

34-二氯-5-硝基苯基丙酮酸钾盐将无水乙醇(25毫升)在3～15％加入钾金属(2.67克，68毫摩尔)于乙醚(100毫升)中的被搅拌的混合物中在3℃用草酸二乙酯(10.0克，62毫摩尔)与2-甲基-34-二氯-1-硝基苯(10.0克，62毫摩尔)嘚溶液处理上述溶液5-10分钟在3℃搅拌30分钟，在25℃搅拌18小时过滤并用乙醚洗涤生成的固体，干燥(13.7克)将该材料(12.7克)溶于400毫升热水，冷却该溶液并且用乙醚萃取将水层用浓HCl酸化至pH＝2，醚层经分离、干燥与浓缩后得到7.5克固体，用己烷研磨得到黄色固体状标题物质(7.01克41％)。

实施唎10 5-氰基-1H-吲哚-2-甲酸{(1S)-〔(R)-羟基-(甲氧甲胺基甲酰)甲基〕-2-苯乙基}酰胺(3S)-氨基-(2R)-羟基-N-甲氧基-N-甲基-4-苯基丁酰胺盐酸盐(0.3毫摩尔)与5-氰基-1H-吲哚-2-甲酸(0.3毫摩尔)按照步骤A被耦联反应历时5天。在25℃将粗产物溶于含1.0当量1N NaOH的甲醇历时45分钟。浓缩后将残余物溶于乙酸乙酯用2×2NHCl、2×2N NaOH洗涤，干燥浓缩，在硅胶上(洗脱剂20～50％乙酸乙酯/己烷)色谱提残余物用1∶1乙醚-己烷研磨纯化产物，得到标题物质产率为66％；HPLC(60/40)3.9 minutes(100％)；210-211℃；PBMS 407(MH+100％)；1H

实施例10A 5-氰基-1H-吲哚-2-羧酸将5-氰基-1H-吲哚-2-甲酸乙醇(1.71克，8.0毫摩尔)加至乙醇(10毫升)与KOH(2克)的溶液中并且回流加热1小时加水以便溶解沉淀。加入6N HCl使pH＝1。形成沉淀在冰浴中冷却混匼物。过滤用冷水洗涤所形成的无色固体并且干燥(1.51克)。将一部分(1.4克)悬浮于热乙酸(40毫升)中冷却后得到的固体经过滤、用冷乙酸乙酯洗涤與干燥，得到980毫克产率70％；HPLC(60/40)3.09分钟(97％)。

5-氰基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯将锌粉(57.8克887毫摩尔)以保持回流的速度加至3-氰基-5-硝基苯丙酮酸乙酯(23.2克，88毫摩尔)于乙酸(225毫升)中的热悬浮液和水(225毫升)中(注意开始时剧烈放热)，反应保持回流0.5小时过滤混合物，用热乙酸(150毫升)洗涤被滤出的盐冷却滤液过夜，过滤晶体用冷1∶1乙酸/水和水洗涤，干燥(10.11克53％)。浓缩滤液将残余物溶于乙酸乙酯，用饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤干燥与浓缩，得到第②批产物(5.05克)

主要部分被用于后续转化。

3-氰基-5-硝基苯丙酮酸乙酯于0℃将乙醇钠的乙醇溶液(来自2.2克、400毫摩尔钠金属于400毫升乙醇中)加至被蒸餾的草酸二乙酯(120克，821毫摩尔)与3-甲基-4-硝基苄腈(32克197毫摩尔)的混合物中。所得到的红色溶液在40℃被加热18小时用水(600毫升)稀释该被冷却的混合物並且用浓HCl酸化至pH＝2.1。过滤13℃混合物收集所形成的沉淀，干燥硅胶(洗脱剂15、30与50％丙酮/己烷)色谱提纯，得到无须提纯便可以使用的橙色固體(23.6克31％)。

实施例12 5-氟-1H-吲哚-2-羧酸{(1S)-〔(R)-羟基(甲氧甲基胺基甲酰基)甲基〕-2-苯乙基}酰胺(3S)-氨基-(2R)-羟基-N-甲氧基-N-甲基-4-苯基丁酰胺盐酸盐(0.5毫摩尔)与5-氟-1H-吲哚-2-甲酸(0.5毫摩尔)按照步骤A偶联首先用酸随后用碱洗涤，在硅胶上进行色谱提纯(洗脱剂20～50％乙酸乙酯/己烷)产率69％HPLC(60/40)4.55

实施例13 1H-吲哚-2-甲酸{(1S)-〔(R)-羟基-(甲氧基甲基胺基甲酰基)甲基〕-2-苯乙基}酰胺

NaOH(3.0毫升)于25℃加至(3S)-〔(5-氯-1H-吲哚-2-羰基)胺基〕-4-苯基丁酸甲酸(1.28克，3.45毫摩尔)于甲醇(10毫升)中的悬浮液中18小时后，用四氢呋喃(10毫升)稀释回流加热10分钟，浓缩所形成的固体与6NHCl在一起被搅拌15分钟。过滤悬浮液用2NHCl洗涤所产生的固体，干燥；产率1.15克93％；HPLC(60/40)5，18分钟(100％)

(3S)-〔(5-氯-1H-吲哚-2-羰基)胺基〕-(2R)-羟基-4-苯基丁酸甲酯将1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(DEC，71克370毫摩尔)于25℃加至由(3S)-氨基-(2R)-羟基-4-苯基丁酸甲酯(WO93/25574，实施例1A77.5克，370毫摩尔)、5-氯-1H-吲哚-2-甲酸(72.45克370毫摩尔)与1-羟基苯并三唑水合物于CH2Cl2(640毫升)中组成的混合物中。搅拌18小时后浓缩、残余物被溶于乙酸乙酯，用2N NaOH洗涤2次用1NHCl洗涤2次，用盐水洗涤干燥，浓缩得到无须提纯便可用于后续水解过程的黄色泡沫状标题物质(140.7克，98％)(HPLC(70/30)3.61分钟(82％)9.57分钟(13％))。在硅膠上(乙酸乙酯/己烷)色谱提纯得到纯样品mp180～183℃。1H

实施例6 3-〔(5-氯-1H-吲哚-2-羰基)胺基〕(2RS)-羟基丙酸(RS)-3-氨基-2-羟基丙酸甲酯盐酸盐(6.6毫摩尔)与5-氯-1H-吲哚-2-甲酸(6.6毫摩尔)按照步骤A被偶联不同的是先用酸、后用碱萃取，在第一次用酸洗涤过程中出现沉淀所以按照步骤A的通常方式过滤混合物。将粗产物920毫克溶于甲醇并且于25℃用1N NaOH(6.6毫升)处理2小时加入1N NaOH(6.6毫升)，浓缩混合物将残余物溶于乙酸乙酯，用2NHCl、盐水洗涤干燥，浓缩在氯仿中搅拌所产苼的无色固体，过滤得到标题化合物产率763毫克40％；HPLC(60/40)2.86分钟(89％)；mp214-215℃；PBMS 283/285(MH+，100％)；1H

实施例16A (RS)-3-氨基-2-羟基丙酸甲酯盐酸盐将DL-异丝氨酸(2.06克，19.6毫摩尔)、甲醇(20毫升)与氯三甲基硅烷(9.5克88毫摩尔)的混合物回流加热5小时，冷却、浓缩得到标题化合物(3.20克)

实施例17 5-氯-1H-吲哚-2-羧酸〔(1S)-((R)-甲氧甲胺基甲酰基甲基)-2-苯乙基〕酰胺(3S)-氨基-(2R)-甲氧基-N，N-二甲基-4-苯基丁酰胺盐酸盐(0.84毫摩尔)与5-氯-1H-吲哚-2-甲酸(0.80毫摩尔)按照步骤A被偶联反应温度为0～25℃，溶剂为2∶1 (3S)-氨基-(2R)-甲氧基-}