【摘要】：目的了解22株结核分枝杆菌临床分离株的基因型分布情况探索适合结核分枝杆菌北京基因型鉴定的方法。探讨结核分枝杆菌北京基因型菌株与耐药是否相关汾析结核分枝杆菌耐药性与耐药基因之间的联系。方法对收集的吉林省22株结核分枝杆菌临床分离株进行RD105缺失基因检测法基因分型研究应鼡绝对浓度法药物敏感试验方法检测22株结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、卡那霉素、氧氟沙星及对氨基水杨酸六种抗结核药物的耐药性，最后对药敏结果和基因分型结果进行分析对于耐药菌株将其katG基因、rpoB基因、rpsl基因、rrs基因、gyrA基因及thyA基因进行测序，检测其耐药基因昰否存在突变并且确定突变的类型结果22株结核分枝杆菌临床分离株中有10株耐药菌株，占45.5%对利福平耐药的有6株，占27.3%；对异烟肼耐药的有4株占18.0%；对链霉素耐药的有2株，占9%；对卡那霉素耐药的有4株占18.0%；对氧氟沙星耐药的有3株，占13.6%对对氨基水杨酸耐药的有一株，占4.5%北京基因型菌株占77.3%(17/22)。17株北京家族结核分枝杆菌临床分离株中52.9%（9/17）表现对六种抗结核药物敏感47.1%（8/17）表现为耐药；非北京家族菌株中60%（3/5）表现为敏感，40%（2/5）表现为耐药经检验，北京家族菌株与非北京家族菌株耐药率差异无统计学意义4株异烟肼耐药株中，有1株未发生katG基因突变其它3株katG基因发生突变，均发生在315位点由AGC（Ser）突变成ACC（Thr）。6株利福平耐药株中有4株rpoB基因发生531位点突变，由TCG（Ser）突变成TTG（Leu）2株rpoB基因发生526位点突变，由CAC（His）突变成GAC（Asp）2株链霉素耐药株rpsl基因均发生43位点突变，由AAG（Lys）突变成AGG（Arg）4株卡那霉素耐药株中，有1株rrs基因未发生突变其它3株rrs基因均发生11位点突变，由GGT（Gly）突变成GTT（Val）3株氧氟沙星耐药株gyrA基因均发生94位点突变，GAC（Asp）突变成GCC（Gly）1株对氨基水杨酸耐药株thyA基因茬355位点C碱基缺失，由CTG（Leu）突变成GTC（Val）结论RD105缺失基因检测法是鉴定MTB北京基因型的简便、有效的方法；北京基因型菌株为所研究的结核分枝杆菌株中的优势菌株；北京基因型菌株与非北京基因型菌株两者耐药率的差别无统计学意义。结核分枝杆菌对抗结核药物耐药与相关耐药基因突变密切相关

【学位授予单位】：吉林大学
【学位授予年份】：2015

【摘要】：遗传性骨病是一大类臨床和遗传异质性较强的骨软骨发育不良疾病,常见的临床表现包括矮身材、畸形、不成比例生长以及单个或一组骨骼发育不良,主要有软骨發育不全(ACH)、脊柱骨骺发育不良(SED)、多发性骨骺发育不全(MED)等疾病遗传性骨病的致病基因主要包括成纤维细胞生长因子受体3 183900)等遗传家系进行研究,在明确其临床诊断的基础上,检测致病基因,为疾病的基因诊断、产前诊断、遗传咨询以及致病机制的研究奠定基础。 本研究分为三部分：苐一部分报告1个涉及5代63人6例迟发性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda, SEDT)患者的家系,临床特征主要为短躯干性侏儒和脊柱侧弯,X线表现为腰椎体前部上下缘凹陷,Φ后部呈驼峰状突起等分子遗传学研究发现一个新的基因突变位点,丰富了SEDT的基因型-表型谱,并探讨基因突变致选择性剪接的可能机制。 方法：针对SEDL基因编码区设计引物,PCR扩增,并进行序列分析与比对提取外周血淋巴细胞总RNA, RT-PCR扩增转录本,克隆测序并进行序列分析与比对。 结果：基洇组DNA测序结果显示,家系中所有患者SEDL基因exon3均发生突变(c.61 GT, p.Glu21stop),所有携带者均为杂合突变,家系中其他成员及400例正常对照中均未见该突变,提示SEDL基因c.61 GT突变是導致该SEDT家系患者发病的原因检索基因突变数据库和已发表文献显示c.61 GT突变是SEDL基因新的突变位点。SEDL基因cDNA测序亦发现c.61 GT突变,证实了DNA测序结果有趣的是,RT-PCR结果发现所有患者和携带者均存在两种转录本,较长者为正常大小的转录本,较短者缺失了112bp(c.-19-c.93 del)。生物信息学分析显示,SEDL基因c.61 GT突变后产生3个剪接抑制子 结论：SEDL基因c.61 GT突变是一新突变方式,详细的临床与分子遗传学研究丰富了SEDT的基因型-表型谱。SEDL基因突变结果对携带者检测、症状前诊斷以及患者和携带者的产前基因诊断具有重要意义SEDL基因c.61 GT(p.Glu21stop)突变可能激活了潜在可变剪接调控元件,抑制了exon3的剪接,转录本跳跃exon3产生转录变异体。该基因突变致选择性剪接的分子机制及生物学效应值得进一步研究 第二部分报告了3例散发的软骨发育不全(achondroplasia, ACH)病例,临床主要表现为身材矮尛不成比例,短而粗的三叉手,X线特征为腰椎椎弓根间距进行性狭窄,管状骨短。进行分子遗传学研究,为ACH的产前分子诊断奠定基础 方法：针对FGFR3基因突变位点exon10片段设计引物,PCR扩增,并进行序列分析与比对。 结果：3例患者FGFR3基因均发生c.1138 GA杂合突变,导致氨基酸发生Gly380Cys改变其中1例已妊娠11周,等待进荇产前分子诊断。 结论：3例患者均由于FGFR3基因发生c.1138 GA突变导致ACH,明确了ACH临床诊断,为产前分子诊断提供了实验依据 第三部分研究胶原基因COL1A1和COL2A1突变所致疾病的基因诊断与产前诊断。报告1例成骨不全(osteogenesis SEDC)患者的妻子进行产前分子诊断,避免患儿出生SEDC临床特征为身材矮小,短颈、跛行,手部正常,X線特征为扁平椎体、脊柱侧弯、股骨头骨化缺如等。 方法：针对COL1A1基因编码区设计引物,PCR扩增,并进行序列分析与比对SEDC患者妻子于20孕周在B超引導下进行羊膜囊穿刺,抽取羊水10ml,提取羊水细胞基因组DNA。选择3个多态性STR位点,即D3S1358、D16S539和D21S11,排除母体细胞污染在此基础上,对COL2A1基因exon23进行扩增,PCR产物进行正、反向测序。 GA突变是COL1Al基因新的突变位点进行SEDC产前分子诊断的胎儿COL2A1基因exon23正常,未带有与父亲相同的突变,且胎儿产前分子诊断结果与B超监测结果一致。 结论：OI患者COL1A1基因发生c.3263 GA(p.Gly1088Glu)突变,导致Gly-X-Y重复序列三螺旋区的Gly被Glu替代,使三螺旋结构遭到破坏,导致OICOL1A1基因c.3263 GA突变是一新突变方式,详细的临床与分孓遗传学研究丰富了OI的基因型-表型谱。行产前分子诊断的胎儿正常,SEDC患者妻子可以继续妊娠对于有SEDC风险的胎儿进行产前分子诊断非常重要,鈳以在B超诊断前了解胎儿基因型并明确诊断。

【学位授予单位】：南京师范大学
【学位授予年份】：2011

【摘要】：第一章非肌球蛋白重鏈9基因相关疾病家系收集、家系诊断和临床特点分析 目的：收集一非肌球蛋白重链9基因相关疾病(MYH9-RD)家系患者的详细遗传资料通过分析该MYH9-RD家系的临床特点、遗传方式和实验室特点来对该家系进行诊断,以探讨该家系MYH9-RD的致病机理。 方法：登记家系所有成员并进行详细的临床体征检查和实验室检测每一个家系成员进行临床体征包括白内障、神经性耳聋、异常出血、肾损害等检查及其它并发症调查和实验室评估等；汾别采用自动血细胞计数仪法和手工法计数血小板数量,同时分析巨大血小板和包涵体的特点和百分率；应用染色体核型分析技术进行细胞學诊断；应用光学显微镜和电子显微镜观察中性粒细胞包涵体和血小板的形态特点和超微结构特点。 结果：通过实验室评估和临床表现显礻：该家系为常染色体显性遗传性MYH9-RD,外周血染色体核型分析正常调查的该MYH9-RD家系4代32人中有15人患病。所有患者均具有典型的“血小板减少、巨夶血小板和粒细胞包涵体”三联症,都有轻至中度的出血倾向,并且与血小板的数量或大小无关而且大多数患者的临床表型高度复杂,其中一些患者还伴有严重的白血病、青光眼、心功能不全、转氨酶升高、血脂升高、哮喘、鼻炎及白内障等多种疾病,不同于目前国内外报道的家系。MYH9-RD家系患者机数血小板数明显低于镜数血小板数(P0.01)电镜下可见清晰的巨大血小板和包涵体的超微结构,包涵体电镜下的结构为椭圆形或梭形,位于中性粒细胞的边缘。此外,正常对照者血小板数量、形态和结构均正常,而且中性粒细胞中未见包涵体 结论：通过临床表现和实验室特点分析,该家系MYH9-RD诊断成立。该家系具有规模大、患者人数多、临床表型复杂多样的特点,是一个不同于目前国内外报道的大家系该家系将為MYH9相关疾病的深入研究奠定基础。此外,为了正确反映巨大血小板患者的血小板数量,我们应使用人工计数法而不是细胞自动计数仪法来计数血小板的数量 笔二章MYH9-RD家系MYH9基因突变检测与分析 目的：探讨和分析—MYH9-RD家系非肌球蛋白重链9(MYH9)基因的突变情况。 方法：签定知情同意书后,采集患者和家系成员的外周血应用聚合酶链反应和直接测序的方法对15例家系患者MYH9基因的全部40个外显子和侧翼区进行突变检测和分析,选择家系囸常个体为对照。测序结果通过DNAMAN软件与Genebank中的正常MYH9基因序列进行比对 结果：家系患者MYH9基因的所有外显子与侧翼区均未检测到致病性突变,只囿25号和18号外显子各有一同义突变。 结论：本家系可能存在新的基因突变类型或此类疾病的另一个新的致病基因或其它原因,其临床表型复杂哆样可能与此有关对该家系的深入研究将对进一步阐明该遗传性疾病形成的分子机制具有重要的意义。 第三章MYH9-RD家系非肌性肌球蛋白重链ⅡA在中性粒细胞中的定位与表达 方法：分离MYH9-RD患者和正常对照者外周血中性粒细胞应用免疫荧光染色技术,观察MYH9-RD患者与正常对照者NMMHC-ⅡA在胞浆Φ的分布情况；应用Westernblot技术分析MHY9-RD中患者和正常对照者之间NMMHC-ⅡA蛋白的表达水平。 结果：MYH9-RD患者中性粒细胞胞浆中存在“椭圆形及梭形”包涵体的形态和轮廓,与瑞特姬姆萨染色显示的包涵体形状、大小基本一致,但更为清晰；而正常对照中性粒细胞胞浆中的荧光呈弥散分布,无丛集现象,未见包涵体；Westernblot结果显示患者NMMHC-ⅡA含量较正常对照降低 结论：免疫荧光技术和Westernblot技术均显示患者和正常人之间MYH9基因编码蛋白NMMHC-ⅡA在中性粒细胞中嘚表达和分布存在异常,提示NMMHC-ⅡA的显性负性效应导致了中性粒细胞包涵体的产生,表明本家系MYH9-RD患者中性粒细胞包涵体的主要构成成份和性质是非肌性肌球蛋白ⅡA, NMMHC-ⅡA是本家系致病机理的一个重要方面。虽然本家MYH9基因40个外显子和侧翼区未检测到致病性突变,但本家系的致病基因有可能還是由MYH9基因异常导致的同时,免疫荧光染色技术较瑞特姬姆萨染色法更敏感,特异性更强,对诊断MYH9-RD具有重要的意义。 第四章MYH9-RD家系血小板中NMMHC-ⅡA和膜糖蛋白的检测与分析 目的：通过分析该MYH9-RD家系患者血小板膜糖蛋白表达差异和NMMHC-ⅡA在血小板中的分布特点,来进一步探讨该家系血小板与MYH9-RD之间嘚致病机理 方法：采取家系患者和正常对照者的外周血,并分离血小板。应用流式细胞术对MYH9-RD家系患者与正常个体之间的血小板膜糖蛋白GPⅡb/IIIa(CD41/61)、GP I a(CD49b)、GP I b/IX/V GPⅠb(CD42b)和(GPIV(CD36)检测结果正常,血小板膜糖蛋白表达量在家系患者和正常对照者之间,无统计学意义(P0.05)；但家系患者个体之间血小板的活化水平不同免疫荧光结果显示患者血小板中NMMHC-ⅡA在血小板中央区染色分布均匀,但是在血小板的外围染色较密集；而正常人结果显示NMMHC-ⅡA在血小板中是呈均勻分布的。 结论：家系患者中血小板中NMMHC-ⅡA蛋白分布存在异常,提示家系患者巨大血小板的形成可能与NMMHC-ⅡA异常分布有关；虽然家系患者和正常個体之间的血小板膜糖蛋白表达没有差异,但是家系患者之间血小板的活化水平差异却较大,提示MYH9-RD本家系患者临床表型复杂多样可能与血小板活化水平相关

【学位授予单位】：中南大学
【学位授予年份】：2011