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更新日期日
企业认证：
注册资本：100万
企业性质：其他有限责任公司
主营产品：研发、销售：化工产品（不含危险化学品）、
公司地址：中国（四川）自由贸易试验区成都高新区天府大道北段单元14层1409号
产品英文名称：
Acetylsalicylic acid
EINECS编号：
医药中间体
BP/EP/USP/企业标准
外观性状：
中文名称: 邻乙酰水杨酸中文同义词: 邻乙酰水杨酸;阿斯匹林;醋柳酸;邻醋酸基苯甲酸;邻乙酰基水杨酸;乙酰基柳酸;乙酰水杨酸;阿司匹林英文名称: Acetylsalicylic acid英文同义词: O-ACETYLSALICYLIC ACID;O-ACETOXYBENZOIC ACID;ACETICYL;ACETOXYBENZOIC ACID;ACETYLSALICYLIC ACID;ACETYSALICYLIC ACID;ACETYLSALICYLIC ACID IMPURITY D;ALKENYL SUCCINIC ANHYDRIDESCAS号: 50-78-2分子式: C9H8O4分子量: 180.16EINECS号: 200-064-1我们的优势我公司所有的产品都是现货出售，货源充足，高含量高纯度。关于发货日期及快递本公司所售产品，25kg以内一般默认选择韵达快递，大件货物一般走物流（如有其它要求，请提前联系客服说明），无特殊情况下16点前的订单当天及克发货。关于产品质量本公司销售的任何产品的质量及含量，均由我公司质检部门进行严格的质量控制，实行初检，复检，终检三检制。确保产品100%合格（符合质量标准）让客户放心。定购须知由于季节和市场原因，产品价格难免会有波动，实际价格欢迎来电咨询如果您对产品质量，含量等不适很清楚，我们可以提供产品的质检报告让您放心。我公司实行的是款到发货，下午两点前到账，可当天发货。发货可以根据您的要求进行随意变更，力求服务客户，让客户省心。售后说明本公司所售产品，如未拆包装，到货一周内可无条件退换货物。如已拆开包装，在产品存在质量问题的情况下，向客户提供相关证明文件，两周内同样可以退换货物。（注：请客户在操作过程中不要混入其他原料或杂质）关于其他服务如您对产品有哪些需要了解或其他不是很明白的地方，欢迎您随时与我们取得联系。您的满意就是我们最好的动力！-by AngelWing
成都迈恩凯化工有限公 司简介 成都迈恩凯化工有限公司自经办以来，务实经营，知名度不断上升，得到了市场及行业同仁的广泛好评。产业报国是企业的发展目标，不骄不躁、严谨踏实是我们的一贯工作作风，在已有成绩的基础上，不懈努力、开拓进取，在国内外市场占有了一席之地。 成都迈恩凯化工有限公司主营 : 大化工水处理等原料，对提供的产品与服务，我们一直坚持质量及品质至上的理念。目前企业现有员工 1000 人以上 , 且员工团队实力不断加强；实到注册资金 300 万以上 ( 单位万元 ) ，且在加大投入。 今后我们将本着创新发展，用户至上的原则把我们主营业务搞好。在信息时代我们还将积极利用新的经营方法如开展电子商务等。热忱各界朋友来人、 与我们洽谈业务。 我们全体员工在天府大道 1700 号这里欢迎你的光临！我们愿意用最好的产品、最好的服务、最好的信誉成为您最可信赖的长期合作伙伴。
成立时间：
企业经济性质：
其他有限责任公司
年营业额：
100万-250万
注册资金：
经营模式：
生产商,贸易商,
员工人数：
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致：成都迈恩凯化工有限公司
联&系&人：柯凡
公司名称：成都迈恩凯化工有限公司
电话咨询请告知是在盖德化工网上看到的，谢谢！
关注微信公众号中山大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定 　　　　　　　　　　　　　　　　中山大学皮肤病和性病学专业 博士生： 刘红芳导 师： 席丽艳教授中文摘要马尔 青霉（ ｉ ｌｍ　ｎ ｊ，　 ， 　　　　 Ｐｎｉｕ ｍ ｒｆｉＰ ） 属真菌界， 尼菲 ｅｃ ｉ ａ ｅｅ Ｍ ｌ 半知菌亚门 丝 ， 抱菌纲， 丝抱目 青霉属， ， 双轮青霉亚属。 马尔尼菲青霉感染人体后引起的 一种严重的 深部真菌 ― 马 病 尔尼菲青霉病 （ｅｃｌｓ ｍ ｍ ｆｉＰＭ）．自Ｄ ａｏ Ｐｎｉｏｓ　 ｅｅ Ｓ ｉｌ ｉ ａ ｆ，　 ｉ ｉｌ Ｓｖ首例报道之后， 此真菌感染导致的疾病开始逐渐引 起人们的重视。 该病的发生 有一定地域性，在艾滋病流行以前，较为罕见，主要在东南亚地区如泰国、 越南、柬埔寨、 老挝、 香港和我国 广西等地。 ０ 近２ 年来随着免疫抑制剂的 广泛应用、 器宫移植、 ＩＳ ＡＤ 等所导致的免疫缺陷 宿主不断增多 马尔尼菲青霉病的 ， 报道也日渐增多，而且发病区域有扩大趋势。仅广州已发现马尔尼菲青霉病例近百余例，其中 ０ 上与ＡＤ 相关， 成为继广西省之后我国 约５％以 ＩＳ 已 第二大马尔尼菲青霉病 的重要流行区域。 于该病发病隐匿， 由 病死率高达８％以 并与Ａ Ｓ 度相 ０ 上， Ｄ Ｉ 高 关， 危害极大， 所以己引 起国内 外真菌专家的重视。 马尔尼菲青霉是青霉属３０多种青霉中唯一的 　　　　 ０ 双相型真菌，５ ２℃生长为菌丝相，以无性抱子的方式繁殖； ７ ３℃则呈酵母相，以分裂的方式繁殖， 至今未发现它的 有性生殖期。 马尔尼菲青霉的自 然宿主为竹鼠 及其洞穴周围的土壤， 但它如 何从自 然界传播给人类尚 未清楚． 前认为马尔尼菲青霉感染人体的可能的 目 途径 为抱子经呼吸道进入宿主， 然后在人体３℃的环境下发生双相型转变产生 ７ 致病性的酵母细胞， 在免疫缺陷患者中侵范单核一巨嗜细胞系统并引起播散。 在马尔尼菲青霉双相型转换中 有以 下两点是值得关注的， 其一， 在温度的诱导下， 其酵母相与菌丝相之间可以 两种形态相互转换， 既可以从菌丝向酵母转换， 也可以 从酵中山 大学博七学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定母向菌丝转换。 其二， 分生抱子从呼吸道侵入宿主， 肺泡巨噬细胞将之吞噬， 分 生抱子直接转变为酵母细胞， 并没有经历从分生抱子出芽形成菌丝的过程． 这些说明 马尔尼菲青霉双相型转换受一系列温度变化开启的基因调控， 其在体内 致 的病形式为酵母细胞，但具体的调控机制和毒力基因尚不明确。已 　　　　 马尔尼菲青霉的 有研究表明 致病性与其双相型转变密切相关。 这两种生长 形态的改变可以 使一些基因的表达水平发生改变， 调节马尔尼菲青霉细胞的 以 分 化及形态的 转变。 一些有可能在双相型转变中 起关键作用基因 被详细的 研究， 如ａ Ａ ，１ （Ｄ ４ｈ ｏ ｇ 基因 和 Ｔ Ａ 等， 些 对其 态 ｂ 基因 ｃ Ｃ Ｃ２　 ｌ ） ａ ｆ Ａ　 ｏ ｏ ｍ ｕ 基因 这 研究 形 形 ｐ成的分子机制具有一定的提示作用， 但尚未发现对双相型转换起直接调控作用的 基因。 所以全面而细致的寻找马尔尼菲青霉双相间的差异性表达基因有可能为揭 开马尔尼菲青霉形态转变的秘密及进一步寻找其致病相关基因提供一些帮助。抑制 减杂 技 ｓ ｐ ｓ ｎ　ｒｔ ｈ ｒｉｔ ＳＨ 主 通 　　　　交 术 （ ｐ ｅｉ ｓ ｔｃ ｅ　ｉ ａ ｎ， Ｓ ） 要 过 消 ｕ ｒｓ ｕ ａｉ ｙ ｄ ｉ ｏ ｂ ｖ ｂ ｚｏ消减杂交将待比 较双方共同的ｃＮ 进行消减，再通过抑制性Ｐ Ｒ ＤＡ Ｃ 技术扩增在 Ｔｓｒ ｅｅ ｔ中特异表达的ｃ Ｎ 片段， ＤＡ 使其得到大量富集。 抑制性消减杂交技术是当今研究基因差异表达最为有效的工具之一。 迄今为止，己经广泛的应用于肿瘤、 植 物及致病真菌等的研究中。本课题以 　　　　 马尔尼菲青霉的 双相性转换为切入点， 介绍马尔尼菲青霉的生 除了 物学特性及分子生物学鉴定方法外， 还将ＳＨ Ｓ 技术应用于寻找马尔尼菲青霉菌丝相与酵母相的差异表达基因的研究中， 为进一步寻找其致病相关基因、 探讨致病性作一些基础研究，也希望为马尔尼菲青霉病的致病机制深入研究提供一些资料。第一部分 马尔尼菲青霉生物学特性研究及分子生物学鉴定方法１ ． １马尔尼菲青霉生物学特性研究马尔尼菲青霉在五种培养基上的生长情况： 　　　　 将马尔尼菲青霉菌株Ｓ ＭＳ １２ Ｓ 　　 ０５，　 ＭＳ００ Ｓ ＭＳ２５ Ｓ ＭＳ２２ Ｕ Ｕ ０５ ，　 ０１，　 Ｕ Ｕ ０２接种于Ｓ Ａ Ｐ Ａ Ｂ 、 Ｄ ，　 ，　 Ｄ Ｉ ＨＣＡ Ｃ 　　，　 五种不同的培养基上，然后分别放置在２℃和３℃培养两周。 Ｄ ＭＡ ５ ７ 在２＇， 　　 四株马尔尼菲青霉在五种培养基上均生长良 但在不同培养基上生长 ５　 Ｃ 好，中山大学博十学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定速度， 色素产生 情况， 菌落形态及显微镜下形态有所不同。 ７ ，马尔尼菲 在３０ Ｃ青霉均生长为酵母状菌落， 无色素产生， 但在不同的培养基上转化为酵母细胞的能力不同。马尔尼菲青霉在Ｓ Ａ 　　　　 Ｄ 培养基上不同温度下的生长情况： 四株马尔尼菲青霉在６ ℃和１℃菌落生长减慢，产生色素减少，１℃ ８ ０ ８ 及２℃生长良 产生大量 好，红色色素。 ７ 在３℃为酵母状菌落， 生长较快， 但容易死亡， ０ 在４℃未发现生长。放线菌酮耐 试验： 株马尔尼菲青 　　　　 受 四 霉在含有放线菌酮（ 浓度０ ％０ ５ ） ． ，０ １ ．％的Ｓ Ａ培养基上２℃和３℃均未见生长， Ｄ ５ ７ 在含 ０ １ 放线菌酮的培养基上缓 ．％ ０慢生长。尿素酶产生情况：四株马尔尼菲青霉在 ３℃的尿素酶试验均为阴性。 　　　　 ７ １ 马尔尼菲青霉的ＩＳ ． ２ Ｔ 序列测定 采用来源于真菌核糖体大亚基基因保守区的通用引物ＩＳ 和 ＩＳ ，　 　　　　 Ｔ ５ Ｔ ４ Ｐ Ｒ扩 Ｃ增四 株马尔 尼菲青霉的ｒＮ ＩＳ 四 马 Ｄ Ａ　 区。 株 尔尼菲青霉的 扩增出６０ 左 Ｔ 均能 ０ｐ ｂ右的片段，将Ｐ Ｒ产物进行测序，序列在Ｇ ｎａｋ Ｃ ｅｂｎ 中应用Ｂａｎ ｌｔ进行查询，所 ｓ有菌株均与马尔尼菲青霉的 标准株具有 １ ％ ０ 同源性。Ｔ 序列分析是一种快速、 ０ ＩＳ准确的鉴定马尔尼菲青霉的分子生物学方法。 第二部分 马尔尼菲青霉抑制性消减文库的建立 １ 马尔尼菲青霉总Ｒ Ａ ． １ Ｎ 提取方法的比较利用Ｒｅ ｙ　 ｔ　ｉ 　　　　 Ｐ ｎＭｎ众 ， ｒｏ ｎｓ ｌ ｉ ａ ａ Ｔｉ ｌ ｚ ，改良 的异硫氰酸肌法， Ｎ ｅ 种方 Ｒ Ａｘ四 法提取马尔尼菲青霉双相的总Ｒ Ａ Ｎ ，以寻找一种合适的方法用于建立抑制性消 减文库。结果显示四 种方法提取的 Ｎ 均较为完整， ＲＡ 但相同重量的菌体所提取 的 Ｎ 产量、 ＲＡ 质量及所用时间和价格皆 有差异。 通过比 较，发现 Ｔｚ提 取的 ｒｏ ｉ ＲＡ Ｎ 具有完整性和纯度均较好， 产量较高， 操作相对简便， 价格适中 等优点，可用于有效的建立抑制性消减文库。１ ． ２马尔尼菲青霉抑制性消减文库的建立 利用Ｓ Ａ 技术将马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相的总Ｒ Ａ 　　　　 Ｔ ＭＲ Ｎ 合成ｃＮ 并进行 ＤＡ中山大学博十学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定Ｒａ酶切。 ｓｌ 然后应用抑制性消减杂交技术 （Ｓ ） 连接不同的接头，通过两轮 ＳＨ ，杂交 次 制 ＰＲ 将 物 ｐ Ｄ８ 载 连 转 大 杆 经 Ｃ 和两 抑 性 Ｃ 后， 产 与 Ｍ １Ｔ 体 接并 染 肠 菌。 ＰＲ －鉴定， 共得到１ ０ ２ 余条插入片段． ０ 成功构建了马尔尼菲青霉的正向 消减文库 （ 以酵母相为ｅｅ 菌丝 ｄｖ ） ｔｔ， 相为 ｒｅ 和反向 减文 （ 菌丝相为 ｅｅ 酵母相为 ｓｒ ｉｒ 消 库 以 ｔｔ， ｓｒｄ ｉｅ ） ｒ ｒ， ｖ第三部分 马尔尼菲青霉差异表达基因的筛选及初步功能研究 　　 从马尔尼菲青霉正向消减文库和反向消减文库选取５０ Ｄ Ａ 　　　　 ０个ｃＮ 片段进行ｃＮ 斑点杂交。 ＤＡ 共在正向 文库中筛选出 ６ ４个阳性克隆，反向 文库中筛选出 ５ ３个阳性克隆。经测序分析及Ｂａ 查询，这些基因按其功能可以分为细胞壁合成、 ｌＮ ｓ信号转导、 细胞循环、 物质转运、 基础代谢、 应激反应等几大类。 应用相对定量 ｅ － ｅ　 对六个代表性基因进行了 ｒ ｌｍ Ｐ Ｒ ａｔ Ｃ ｉ 进一步的 研究． 我们推测在温度改变时，马尔尼菲青霉的信号传导通路被开启， 相应的基因表达上调， 这些基因决定了马 尔尼菲青霉双相型的一些特征。关键词： 马尔尼菲青霉：双相型；致病性；抑制性消减杂交；ＰＣＲ中山大学博十学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定Ｂｏ ｇ ｃａａｔ ｉｉ ｓ ｄ ，　 ｌ ｏ ａｄ　ｎｉｃｔ ｎ　 ｉｏｉ ｈｒｃ ｒｔｓ　 ｙ ｉ ａ ｎ　 ｉｅｔｉ ｉ ｏ ｌ ｃ　 ｅ ｓｃ ｔ ｕ ｓ ｔ ｎ ｄ ｆａ ｏ ｆ ｏｉｄｆ ｒｎ ａｙ　 ｒｓ ｄ　 ｅ ｏ Ｐ ｎｃｌ ｍ　ａｎｆ ｉ ｉｅｅｔ ｌ ｅｐｅｓ ｇｎｓ　 ｅｉｌ ｍ ｒｅ ｅ ｆ ｉｌｘ ｅ ｅ ｆ　 ｉｉ ｕ ｆＤ ｒ ａ ｌ ｙ　 Ｖｎｒｌ ｙ ｅ ｔｏ ａｄ　 ｅ ｏ ｍ ｏｇ ｎ ｅ ｏ ｇＰ Ｄ　ｎｉ ｔ Ｌ Ｈ ｎｆ ｇ ｈ Ｃ ｄ ａ ：　 ｏｇ ｎ ａ ｄｅ ｉ ｕ　 ａＳｐｒｉ ｒＰｏ．　 ｉ ｎ ｕｅ ｓ ：　 Ｘ Ｌｙ ｖ ｏ ｒｆ ｉ　ａＡＢＳ ＴＲＡＣＴＰｎ ｌ ｍ　ｎ ｆ （ ） ｕ ｒ ｔ Ｆｎ ；　ｏ ｙｏ ；　ｚｍ ｃｔａ 　　 ｉｕ ｍ ｒｆ ｉ Ｍ ：　ａ ｏ ；　 ｉ ｓ ｍ ｃｔ Ｐｚ ｏ ｙｏｎ； ｅｉ ｌ ａ ｅｅＰ Ｅｋｙ ａ ｕｇ Ａｃ ｃｉ ａ ｅｉ ｉＥｒｔｍ ｃｔ ；　ｏａ ｓ Ｔｉ ｏｏ ａｅｅ ｍｔ ｐｒ Ｔｉ ｏｏ ａｅｅ Ｉ ｏ ｅ ｕ ｉ ｙｅ ｓ Ｅｒ ｉｅ；　 ｈｃｍ ｃａ；　ｏ ｏｃ　 ｃ ｃｍ ｃａ．　 ｆｎ ｏｏ ｅ ｕ ｔｌ ｒ ｃ ｉｓ ｉ ｒｈ ｔ　 ｔｉｅ ｓ　 ｕｏｏ ｐ ｍｓ ｉ ｉｄａ ａ ｃｕ ｓ　ａ ｐｎ ｉｏｉ ｍ ｒ ｆｉ ｎ ｃ ｉｍ ｎｃｍ ｒ ｉｄ　 ｖ ｕｌ ｎ ａｓ ｆ ｌ　 ｉｌ ｓ ａｎ ｅ ｆｔ ｍ ｏ ｅ ｎ ｉ ｓ　 ｄ ｄ　 ｅ ａ ｅ ｃｌ ｓ　 ｅ ｔ ｉ （Ｓ 　　 ＰＭ）．ｈ ｆｓｃ ｅ　 ｕ ａ ＰＭ　 ｓ　 ｒｄ　９３　 ｉｌ ．　ｒ　 ｅ Ｔｅ　ｔ　 ｏｈｍ ｎ　 ｗ ｒ ｏｔ ｉ１７ ｂ Ｄｓｖ Ｐｉ ｔｔ ｉ ａ ｆ　 ｒ ｓ Ｓ ａ ｅ ｅ ｎ　 ｙ　ａ ｏ ｒ ｏ　 ｐ ｏ ｈ ＡＤ ｅ ｅ ｉ ＰＭ　 ａ ｌ ｉｄ　 ｓ ｔｒ ｃ ｅ　 ｏ ｓ　 Ｓｕ ｅ ｔ　ｉ ＩＳ　ｄｍｃ Ｓ ｗ ｓ　 ｔ ｔ ｃ ｅ ｄ　 ｒ ｒ ｉ ｏｔ ａ Ａ ａ ｎ ，　 ｉ ｅ ｏ　 ｅ ａ ｅ ｔ ｎ　 ｈ ｓ ｓ ｍ ａ ｓ ｐ ｐｒｃｌｌＴａａｄＶｅ ａ ，　 ｂｄ ，　ｇ　 ｇ　 Ｓｕ ｅ Ｃ ｉ ．　 ｅｅ ａｉ ａｙ　 ｉｎ，　ｎｍ Ｃｍ ｏｉ Ｈ ｎ Ｋ ｎ ａｄ　 ｔ ｒ ｈ ａＨ ｗ ｖｒ ｔ ｕｒ ｈ ｌ ｉ ｔ ａ ａ ｏ ｏ ｎ ｏ ｈ ｎ　ｎ ｏ ，ｗｔｔ ｓｒ ｄ　ＨＶ　ｏ　 ｒ ｉ ｓｔ ｎｍ ｅｏ ｔ Ｐ Ｍ　ｓｓ　 ｉ ｒ ｓ ｉ ｈ ｐ ａ ｏ Ｉ ｉ ｔ ｅ ｏ ，　 ｕ ｂｒ　ｈ Ｓ ｃ ｅ ｈｓ　 ｅ ｅ ｈ　 ｅ ｆ　 ｎ ｈ ｇ ｎ ｈ ｅ　 ｔ ｅ　 ｅ　 ｆ　 ｅ　 ａ ａ ｎ ａ ｄ ｃｇ ａｙ　 ｔ ｅ ｅ ｉｒ ｉ ｓ　ｅ　 ｒ ｄ　 ｔ．　 ｔＭ ｙ　 ７ｍ ｒｔ ｎ ｒｔ ａ 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中山大学博十学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达墓因的筛选和鉴定霉特异性抗原检测无症状的ＨＶ感染者和ＨＶ Ｉ Ｉ感染合并其他真菌感染的患者，结 果小部分呈阳性， 说明不能忽视马尔尼菲青霉的亚临床感染或合并其他真菌感染的 情况． ａｉｔ ａｏ等１ 用免 迹法检 尔 青霉蛋白 Ｖｎｔａ ｋ ｗ ｎ ｍ １ 疫印 测马 尼菲 抗原， 有 其中两个酵母相免疫蛋白（ 分子量为５ ｋ和５ ｋ） ４　 ０　 与马尔尼菲青霉特异相关。而且结 Ｄ Ｄ果在马尔尼菲青霉真菌学培养确诊前两个月就可测到反应， 这对感染的早期诊断 有很大帮助。１４ 马尔尼菲青霉的 ． 致病性研究１． ． １马尔尼菲青霉的致病途径 ４在体内感染过程中马尔尼菲青霉与宿主相互作用的具体机制尚未明确， 　　　　 推测感染是由环境中的分生抱子入侵引起， 但未得到相关的确切证据。 吞噬细胞被认为是 宿主抗感染的第一道防线。 ａｉｔｎ ６ 报道马尔尼菲青霉的分生抱子 Ｈｍｌｏ等「 ， Ｗ －与支气管上皮细胞产生猫附这个交互作用就是通过一个唾液酸依赖的途径完成 的。 而与凝集素糖蛋白 搪链上唾液酸残基末端和糖蛋白联接关系密切的配体是一种２ ｋ的蛋白。 ０　 Ｄ 而且培养时间 越长该菌薪附能力越强。即使在没有调理素活化的情况下， 吞噬细胞依然可以吞噬马尔尼菲青霉， 据推测识别马尔尼菲青霉的主要受体是带有暴露的Ａ 已 Ｌ 酞基糖氨基集簇的 － 搪蛋白。 在健康小鼠中体内马尔尼菲 青霉可以在２ 周内 －３ 被清除，然而对裸鼠 或者Ｔ 细胞缺失的小鼠，感染是致命的０。 Ｔ 说明 细胞， 特别是Ｃ Ｔ Ｍ十 细胞对抗真菌感染是必需的１。 ６ 所以在Ｃ４Ｔ １ ７ Ｄ－细胞缺乏 Ａ Ｓ 者合并 尔 青 感染 １ 病 速 病 严 呈 性 坏 的Ｉ患 Ｄ 马 尼菲 霉 时５ 迅 且 情 重， 无力 和 ８ １ 发死性反应。 ‘ 病变部位有大量马尔尼菲青霉， 不见中 性粒细胞渗出， 只见巨噬细胞中有大量菌体， 并正在活跃繁殖。 宿主对抗细胞内 病原体的一个重要免疫反应途径是通过Ｔ 细胞分泌的细胞因 如Ｙ　，　２ ＴＦ ａ 使巨 子， Ｉ １１，　－　 Ｆ １ Ｎ ， Ｎ ， 噬细胞活化，巨噬细 对真菌 胞 进行杀伤而 达到抗感染目 ｆ１ 作为细 病原 马尔 青 的〔 １ ｉ． ＂ 胞内 体， 尼菲霉应该也具有类似的机制。 人外周血巨噬细胞对马尔尼菲青霉作用的体外研究表 明〔， 噬细胞吞噬病原体成为吞噬小体， ＣＦ ０ 巨 ２ １ 被ＭＳ活化后， 通过氧化爆发起杀伤作用。如其它细胞内病原体一样， 在巨噬细胞内以 酵母细胞存活是马尔尼菲青霉能中山大学博十学位论文马尔尼菲青祥生物学特性研究及其差异表达基因的缔选和鉴定入侵宿主， 并成功感染宿主的首要条件。Ｐｎｐｍ＂ ｏｇｏ［等对马尔尼菲青霉过氧化氢 ｍ 酶一 过氧化物酶 （ ｅ） Ｃ Ａ 进行基因 ｐ 水平的 研究， 发现Ｃｅ表达水平在酵母相明 ｐＡ 显 升高， 该家族对ＲＳ Ｏ的解毒作用可能是其能在宿主巨 噬细胞内不被活性氧族灭活， 得以 存活的原因． ｉＩ Ｘｃ等对马尔尼菲青霉差异表达蛋白 ＂ 进行研究， 除了发现过氧 化氢酶一 过氧化物酶在酵母相明显升高外， 异柠檬酸裂解酶 （　 活性也增加， Ｉ） Ｃ Ｌ 可能是在不利生存环境下乙 醛酸支路被激活， 为马尔尼菲青霉的生长和繁殖提供了 营养和必需 物质． Ｃｎｖｓ　 ＂ 最近 ａｏ Ｄ ｌ ａ 等ｃ报道， 马尔尼菲青 霉在体内 过 生长 程中启动了乙醛酸循环途径，ＩＬ Ｃ基因作为这一循环的关键酶，表达受到营养和温度 的双重调节， ７ 在３℃受到ａａ的 ｂＡ 诱导表达， 但是ａａ基因的缺失并没有抑制马尔 ｂＡ 尼菲青霉的相态转变， 揭示ＩＬ Ｃ基因和乙醛酸循环受一个复杂的网络调节，可能 与其致病性高度相关。 然而马尔尼菲青霉是如何逃避宿主巨噬细胞的氧化应激等 杀伤机制下的具体机制还不明确。１． ． ２马尔尼菲青霉致病性与双相型的 ４ 关系 马尔尼菲青霉的生活史可以 　　　　 分成三个时期： ５ 丝状营养性生长： ５ ２℃ ２℃无性繁殖 （ 分生抱子） 以及３℃单细胞、 ７ 酵母样营养性生长。 温度和营养条件是影响 菌体形态的重要因素。 马尔尼菲青霉的双相型转换是受温度控制的。目 前研究表 明， 这两种生长形态的改变可以 使一些基因的表达水平发生改变， 以调节马尔尼菲青霉细胞的分化及形态的 转变圆． 也有相关的 研究显示双相型转换与病原体的 致病性密切相关。 在马尔尼菲青霉中， ａｃ基因编码Ｇ ｇｓ 蛋白ａ 亚单位， 调节分生 抱子正常萌芽的发芽（， ６ 该基因的 ７ ］ 缺失将明 显延迟发芽进程， 但并没有在两相形 态转变及酵母细胞生成中 起作用。 ｕ 基因编码的转录因子在２℃ 由ｔ Ａ ｐ ５ 虽然不作用于菌丝的最初形成， 但能抑制酵母细胞的生成， ７ 在３℃对酵母细胞的正确极性生长起作用【．　ｅａ等发 ｂＡ 可能与 前分支抱子 ＂ Ｂｍ ｎ 现ａ 基因 ３ ｏｍ ａ 控制 （ ｅｒｈｏ ｎ ｉｌ 的 ｐ ａｔ ｃ ｉ ａ） 细胞分裂 ｒ ｒｏｄ 有关｝＂ ｔ 基因， ０， １ ｀ 　Ｓ Ａ ７ 此基因 制杂交 可控 及双相型变化， 但删除Ｓ１基因并未显著影响马尔尼菲青霉无性繁殖或双相型变 ｔ Ａ 化。马尔尼菲青霉的 ＰＥ基因与构巢曲 ｔ 基因极其相似。 ＡＳＳ 霉Ｓｕ Ａ 删除马尔尼菲青 霉的Ｓｕ基因 ｔ Ａ 会影响梗基及瓶梗的形成（ 分生抱子期） 但不影响双相型生长。 ， 菌丝的正常生长还受肌动蛋白 是否正常沉积所影响，如基因ｃｌ ｆＢ所编码的ＲＣ蛋 Ａ中山 大学博十学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定白就有此作用， 该基因的缺失将影响菌丝和分生抱子的极化性生长以及细胞分裂＂ｅ　Ａ与酵母细胞正确的形态形成有关， ２ ｃ１ １ ｆ 缺失株的酵母形态发生异常， 虽然 当 温度２℃时这些酵母可以 ５ 转变为菌丝， 但菌丝缺乏尖端， 使顶端生长功能障碍［。 上 ＋ 以 研究对马尔 青霉形 成分 ２ １ 尼菲 态形 子机制具 有一定的 作用， 未发 提示 但尚现对双相型转换起直接调控作用的基因。１５ 本科题的研究目 ． 的、意义及研究路线马尔尼菲青霉病是一种地域流行性疾病。由于地处马尔尼菲青霉病的高发 　　　　　　 区， 近年来本实验室就马尔尼菲青霉病的流行病学和致病机制进行了一系列的研究 取得了 并 初步的 成果［２２，，同 提出了 些新的 题。 研究 ６０．７ 时也 ， ，６５ ７ ２４ ， ７ 一 问马尔尼菲青霉是以何种机制由菌丝相向酵母相转化而引起疾病？不被巨噬 　　　　 细胞清除的机制何在？为什么此现象绝大多数发生在免疫缺陷患者， 其致病性与宿主免疫状态间相互关系如何？其酵母相产生的主要毒力因子为何种物质？明确以 题， 上问 对理解马尔尼菲青霉的致病机制和如何在免疫缺陷患者中 形成播散感染有重要意义。鹰 　　　　　　　　　　　　　　　　　与马尔尼菲青霉相似， 　　　　 很多 病原真菌具有双相型特征， 例如白 念珠菌、 组 织胞浆菌、申 克抱子丝菌、 皮炎芽生菌、 巴西副球抱子菌等。 相关的 研究显示双相型转换与病原体的致病性密切相关。 Ｖ １ 如Ｌ　 是抑制白 Ｐ 念珠菌菌丝形成的转录因 在 温度中 养时该因 子， 环境 培 子被激活， 念珠菌 呈酵 使白 生长 母相［ ｖ ｅ ７敲除Ｃ ｌ基 后 当 度 变 白 珠 不 从 母 变 菌 「　ａｌｐ蛋 ｅｐ 因 ， 温 改 时 念 菌 能 酵 转 为 丝７ ＣＣ４ 白 ｋ ７ ａ ７ ；　激酶 也与白 毒力以 念的 及形态 转换相关〔．　 ｅ ｋ ７ 现组 ＂ Ｎｍｃ ［ 等发 氨酸激酶 ＇ ｅ ｅ７ ０（ｉｔｄｎ ｋｎｓ） 　　 ｉｉｅ　 ａｅ 触发了巴西副球抱子菌等双相性真菌从菌丝到酵母的转 ｈｓ ｉ换， 并且在细胞壁的合成， 产抱及在宿主体内表达毒力因子等过程中起重要作用。目 前马尔尼菲青霉双相型转换与致病性关系仍在进一步的研究中。 近年来，分子生物学技术的飞速发展伴随着一系列新方法、新技术的诞生， 　　　　为研究马尔尼菲青霉的 致病性创造了机会。例如抑制消减杂交技 （Ｓ），该 术 ＳＨ技 是１ ６ Ｄ ｔ ｅ ｏ１ 立的 项以 交 Ｐ 为 础的 克 技 术 ９年ｉｃｎ［ ９ ａ ｈ ｋ７ ４ 等建 一 杂 和 Ｃ 基 基因 隆 术． Ｒ主要通过消减杂交将待比 较双方共同的ｃＮ进行消减，再通过抑制ＰＲ ＤＡ Ｃ技术特异性地扩增在Ｔｓｅ中特异表达的ｃＮ片段，使其得到大量富集。ＳＨ ｅｔｒ ＤＡ Ｓ技术已经成中山 大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的 筛选和鉴定功的 用 真菌 究 域， 分离出巴 球 子 、 巢曲 球 应 于 研 领 并 西副 饱 菌 构 霉、 抱子菌￣ 【的差异表达基因， 研究致病性打下了良 基础。 为 好的 综合前人的研究成果， 马尔 尼菲青霉的 致病性与其双相型密切相关， 我们以 马尔尼菲青霉的 双相型为切入点， 利用ＳＨ Ｓ技术分离马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相之间的差异表达基因， 对上述问题从分子生物学角度展开研究，ＳＨ Ｓ 技术路线综合如下。Ｐ 菌丝相 ＭＰ 酵母 相 ＭＳ Ｒ 技术 ＭＡ ＴＲ Ａ提取 ＮＳ Ｒ ＣＮ ＭＡ Ｔ　 Ａ的合成 Ｄ抑制消减杂交中山大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定第 ２ 马尔尼菲青霉的生物学特性及其分子生物学鉴定 章２ 前言 ． １目 　　　　 前所发现的马尔尼菲青霉的自 然宿主是竹鼠， 带菌率达９％以上， ０ 但大多 数患者与竹鼠并无接触史， 将本菌直接传播给人的可能性极小。 竹鼠 有研究者推测 Ｍ （ 推测土壤环境中可能会存在有马尔尼菲青霉， ］　 ２ ７ １ 但至今未能空气、 土壤、水源、 其它鼠 类中分离到该菌。 它的传播途径至今尚未清楚。 本章主要研究了马尔尼菲青霉在不同温度、 不同培养基的生长情况及其代谢情况及其常见的分子生物学诊断方法， 对研究马尔尼菲青霉的生理特性， 寻找其自 然界中的来源提供了一定的线索，并对该病的快速诊断有所启发。２ ． ２材料、 试剂和仪器２２１实验材料 ．．受试菌株ＳＭ ０ ５ ＵＳ００ ＳＭ０５ Ｕ Ｓ １２ ＳＭ０ １ ＵＳ２５ ＳＭ ０ ２ ＵＳ２２来源 竹鼠分离株两岁儿童的 血液分离株 艾滋病患者的皮损分离株泰国艾滋病患者分离株２２２主要试剂 ．．了 、１、二了，Ｓ Ａ　 Ｄｆｏ公司，ＵＡ Ｄ ：　ｉｃ Ｓ、 ． 尹了 ．、， 拍了 ． 、Ｐ Ａ：． ｉｃ Ｄ Ｄ ｆｏ公司，ＵＡ Ｓ‘ 、 了飞 ￣了 、Ｃ Ａ：北京三药科技开发公司 Ｍ、 ． 产４Ｃ Ａ 北京三药科技开发公司 Ｄ：、 ． 了了 ‘ 、 了 ‘ 、１气 Ｊ ６、 少ＢＩ Ｈ ：　 Ｄｆｏ公司，ＵＡ 　　　 ｃ ｉ Ｓ尿素 ： 广州化学试剂厂、 ， 产了 ‘ 、，放线菌 ： 酮 上海如吉生物科技发展有限公司、 ， 产了 飞一挑葡萄搪 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂 蛋白 陈：杭州微生物试剂有限公司琼脂粉：广州南方化玻公司（） ９ （０ １）中山 大学博士学位论文马尔尼菲青霉生 物学特性研究及其差异表 达基因的 筛选和鉴定（１ １） （２ １）氯霉素、庆大霉素针剂：林百欣医学研究中心Ｎ２ Ｔ ＂　０（ 二胺四 酸二 ： ａ Ｄ Ａ　 ２ 乙 Ｅ ２ Ｈ 乙 钠） 广州化 试剂 学 厂Ｔｓ （ ｉ ｒ 碱 三羚甲 基氨基甲 ： 烷） 上海华东试剂工业供销公司硼酸 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂（３ １）（４ １） （５ １） （６ １） （７ １） （８ １） （９ １） （０ ２） （１ ２） （２ ２） （３ ２）Ｐ Ｒ引物：广州英俊生物工程有限公司合成 ＣＴ Ｄ Ａ 合 Ｔｋ ａ 大 ａ Ｎ 聚 酶： ａ Ｒ， 连宝生 ｑ　 ａ 物公司ｄＴ ｍｘ脱 Ｎ Ｐ　 （ 氧三磷酸核 ｉ 昔混合 ） Ｔｋ ａ 大连宝生物公司 物 ： ａａ ， ＲＰ Ｒ　 ｅ ＴｋＲ ， Ｃ ｂｆｒ ａａａ 大连宝生物公司 ｕ ：　琼脂糖：上海生物工程有限公司６Ｌ ａｉ Ｂ ｆｒ ＴｋＲ ，大连宝生物公司 ｘｏｄ ｇ　 ｆ ：　 ａａ ｎ ｕｅ ａＥ ：林百欣医学研究中心 Ｂ Ｄ Ａ分子量Ｍ ｒ ｒ ＴｋＲ ，大连宝生物公司 Ｎ ａ ｅ ａａａ ｋ ：　Ｉ ｔ ｅ Ｔ　ａ ｘ ｎ ａ ｎ Ｍ ｔ 试剂盒： Ｉ－Ａ ，　Ａ ｓＧ ｅ ｍ ｒ ｉ ＢＯＲ Ｄ Ｕ Ｓ２２３主要仪器设备 ．．（） １ （） ２ （） ３（） ４ （） ５电热恒温水浴锅 （ 北京长源实验设备厂）Ｓ －Ｊ Ｆ Ｗ Ｃ－ Ｄ型超净工作台 （ ２ 苏州净化设备厂） Ｎ Ｒ１ 恒温培养箱 （Ａ Ｙ ，日 Ｕ－３ ５ Ｓ Ｎ Ｏ 本） 电热恒温干燥箱Ｙ １１Ｉ 广州东方红医疗器械厂） Ｈ ４－　 （Ｄ ｌ ３０　 （ Ｔ Ｌ ＲＴ Ｌ Ｄ ，上海） ｅａ　 Ｐ ｔ ２ Ｈ计 Ｍ Ｔ Ｅ －Ｏ Ｅ Ｏ Ｅ（） ６ （） ７（） ８ （） ９Ｄ ５０ 子计数天平 （ Ｔ０ 型电 常熟市长青仪器仪表厂） Ｈｔ ｈ　 式低温高速离心机 （ ｅ ｅ ， ｅｉ ３Ｒ台 ｃ ２ Ｈｒ ｕ 德国） ａｓＵ ２０ 型紫外分光光度计 （ＨＭ Ｄ Ｕ 本） Ｖ　 １ ２ Ｓ Ｉ Ａ Ｚ ，日Ｇｎ ｍ ２ ０ Ｃ 仪 （Ｅ ｅ Ａ ｐ　 型Ｐ Ｒ Ｐ 公司， ｅ ７ ０ 美国）暗箱式多功能紫外透射仪 （ 型号：Ｆ ０上海顾村光电仪器厂） Ｚ－ ， ９ 恒压恒流电 泳仪 （Ｉ－Ａ ，美国） ＢＯＲ Ｄ（０ １） （１ １） （２ １）（３ １）（４ １）台 温高 心机 （ｐｅ ｏ ， 式常 速离 Ｅｐ ｄ ｆ德国） ｎｒ－ ℃低温冰箱 （Ａ Ｙ ， 日 ３ ０ ＳＮ Ｏ 本）ＳＭ－１４ Ｉ Ｆ２ 制冰机 （Ａ Ｙ ， 日本） ＳＮ Ｏ中山 大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定（５ １）纯水制备系统 （Ａ Ｃ Ｎ Ｏ Ｌ Ｂ Ｏ Ｃ ，美国） 凝胶摄像系统 （ｏ ｒｉ Ｐｌｏ ，美国） ａｄ旋涡震荡器 （ 型号：Ｘ ８，上海跃进医疗器械厂） Ｗ　 ０（６ １） （７ １）（８ １） （９ １）（０ ２） （１ ２）恒压、恒流电泳仪 （ Ｉ－Ａ ，美国） ＢＯＲ Ｄ水平电泳槽 （ Ｉ－Ａ ，美国） ＢＯＲ Ｄ光学显微 （ｌ ｐｓ　４，日 镜 Ｏｙ ｕＣ － ｍ Ｘ ０ 本）微量移液器 （ｉ ｉｏ 本） Ｎｃｒ ，日 ? ｂｙ２２４ 主要试剂的配置方法 ．． （ ）　 ｏｒ ｄ １ Ｓｂｕａ 氏葡萄糖琼脂 ａ ｕ将 ４ 葡萄搪、 ｇ 陈、 ｇ ｇ ｌ 蛋白 ２ 琼脂置 入三角 烧瓶内， 加双蒸水至 １ Ｍ ， ０ Ｌ ０高压灭菌 １１　压 菌１ 分钟。 ２＇ 灭 ０ Ｃ 高 待瓶内 液体冷却至６℃ ０ 左右时， 其内 向 加入氯霉素１５ ｇ 庆大霉素５ ｇ 混匀． 匀的 ２ｍ 及 ． ｍ． 将混 培养基 倒入灭菌 平皿中， － ｍ ８ ０Ｌ １／ 平皿，室温下放置２ 小时。观察无污染菌生长，放入４ ４ ℃冰箱保存备用。（）尿素培养基 ２将ｌ蛋白 　　　　 ５ 氛 ｇ 陈、 ｇ 化钠、 ｇ 萄 ２磷 氢 ３Ｌ． 酚 溶液、 １葡 糖、 ｇ 酸二 钾、 ｍ ０％ 红 ４ ２ 琼 置 三角 瓶内 校正ｐ 应 ． ０ ， 双蒸 至９ Ｍ ， 溶化， ０ 脂 入 烧 ， ｇ Ｈ 为７＋． 加 水 ０ Ｌ 加热 ２ １ ０１１ 压灭菌 １ｍｎ冷至 ５－５１， ２℃高 ５ｉ 。 ０ ５ 加入经除菌过滤的２％ Ｃ ０ 尿素溶液 １０ Ｌ ０Ｍ ． 尿素的最终浓度为２ ％，分装于灭菌试管内，制成斜面备用。 （） ３ 放线菌酮培养基将４ｇ 　　　　 ０ 葡萄糖 、 摊 蛋白 ２ｇ １ 陈、 ０ 琼脂置入三角烧瓶内， 加双蒸水至 １ ０Ｌ ０Ｍ ０ 高 压灭菌 １１　５ｉ后 按不同 ２＊ １ ｎ Ｃ　 ｍ 浓度需求加入放线菌酮丙酮液（ 放线菌酮５０ｇ ０ｍ溶于 ｌ ｌ ｏ 丙酮中） ｍ ，制成斜面备用。２ 实验步骤 ３２ ３１五种培养基上的生长情况 ．．将四株马尔尼菲青霉的菌丝相和酵母相分别点种在ＳＡ ＰＡ ＣＡ ＣＡ ＢＩ 　　 Ｄ，　 ，　 ，　 ，　 Ｄ Ｍ Ｄ Ｈ五种不同的培养基上， 然后分别放置在 ２℃和 ３℃ ５ ７ 培养两周。每天观察其色素产生情况、菌落形态、菌落直径、取均数绘制其生长曲 线并观察其镜下形态。中山 大学博＋学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定２３２ 温度试捡 ．．将四 　　　　 株马尔尼菲青霉接种于ＳＡ Ｄ 固体培养基上， 分别置于６ １Ｃ，　 Ｃ，　 １Ｃ， ０ ８２１，　Ｃ ４℃ 这六个温度培养十天，观察其在不同 ８ ３１，　 Ｃ ７ ０ 温度下的生长情况。２ ３３ ．． ．放线菌酮耐受试驻将马尔尼菲青霉的菌丝相和酵母相分别接种含有放线菌酮 （ 　　 浓度０１ ００ ，．１） Ｄ 培养基 ． ，． ％００ 的Ｓ ％ ５ ％ Ａ 上置于２℃ ７ 十天， 其生长 ５ 和３℃ 观察 情况．２３４ ． ． ．尿索酶试验马尔尼菲青霉在２℃生长会产生大量色素， 　　　　 ５ 影响尿素酶观察结果， 所以仅 将其接种于尿素培养基上置于３℃培养一周，观察其尿素酶产生情况。 ７２３５分子生物学鉴定方法 ．． 提取四株马尔尼菲青霉的 Ｄ Ａ 　　　　 Ｎ ，采用来源于真菌核糖体大亚基基因保守区的通用引物 ＩＳ 和 】Ｓ ，　Ｒ扩增 ＩＳ区 （ ５ Ｓ Ｎ ） Ｔ ５ Ｔ４ Ｐ Ｃ Ｔ 包含 ． ｒ Ａ ，并将 Ｐ Ｒ产物 ８Ｄ Ｃ纯化测序， 测序结果在Ｇｎａ 网 ｅ ｎ 上查询，并通过Ｂ Ａ Ｔ 软件比 Ｂｋ Ｌ Ｓｎ 较分析， 将结果与形态学鉴定结果相结合对菌株进行鉴定。 （）　 Ａ提取 　　 Ｎ １Ｄ利用ＢＯＲ Ｄ公 　　　　 Ａ 司的Ｉｔ ｅ ｍ　ａｉ试剂盒提取总Ｄ Ａ 将马尔 Ｉ－ ｎａ ｎ Ｍ ｔ ｓＧ ｅ ｒ ｘ Ｎ． 尼菲青霉接种于沙堡氏 培养基，２℃培养 ７ 小时，用无菌接种钩刮取干燥菌丝体约 ５ ２． Ｌ　 ｅ ｒ ５ ｐ ｄｆ ｌ ｍ， 于已 入２ 川 ｎａｅＴＭｔ 提取液的无菌 １ｍ Ｅｐｎｏ 管 ０ ｇ 置 加 ０ Ｉｔ ｎ 　 ｒ ０ ０ ｓＧ ｅ ａｉ ｍ ｘ０ 分钟， ４ 中，高速振荡 ５ 秒，置５℃恒温水浴 ３ 分钟 高速振荡 １ 秒，煮沸８ ６ ０分钟，取上清一 ℃保存备用。 ２ ０ ＇ ００ ｍ离心３ Ｃ ０ｐ ３ ｒ（ ）　Ｒ反应 ２ Ｐ ＣＰ Ｒ引 Ｃ 物：上游引 Ｉ ５ 物： ＴＳ５－ ＡＡ Ｔ ＇ ＧＧ Ｇ ＡＡＡ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ ＧＧ ３ Ａ Ｔ Ｇ ＡＡ ＡＡ －＇Ｔ ４ ＇ 下游引物：Ｔ Ｓ ５－ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ －＇ 　　　　　　　　　　Ｃ Ｃ ＧＣＴ Ａ Ｔ Ａ Ａ ＧＣ ３中山大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定Ｐ Ｒ反应体系的组成： Ｃ试剂成份每个反应管用量 （ Ｌ ｕ　 ）５４１ Ｘ　 Ｒ缓冲液 ０　 Ｐ ＣｄＴ ｍ （ ． ＂ Ｎ Ｐ　 各２ ｍ ｘ ｉ ５Ｍｇ Ｉ１ Ｍ Ｃ（ ｍ ） Ｚ５Ｄ Ａ溶液 （ｕ／ｌ　 Ｎ ３ｇ ） ｍ 上游引 １ｐ ｏｇ 物（ ｍ ｌｌ ０　 ／） 下游引物（ ｐ ｏｇ １ ｍ ｌ１ ０　 ／）Ｔｑ　 聚 酶 １　） ａＤ Ａ 合 （Ｕｗ Ｎ ／ ｌ灭菌去离子水总反应体积循环参数：９℃预变性 ｍ ，　 　　　　 ４　ｎ ９℃变性 １　 ，　℃退火 １ ｍｎ ７℃延伸 １ ｍｎ ５ ｉ ４ ｍｎ ５ ｉ ５ ． ｉ，　 ５ ２ ．ｉ ５ ，共进行３ 个循环； ０ 末次循环后 ７℃延伸 ７ ２ 分钟。（）　 产物鉴定及序列测定 ３ ＰＲ Ｃ 电 　　　　Ｃ 泳检测Ｐ Ｒ产物， Ｃ 将Ｐ Ｒ产物纯化回收后进行测序 （ 测序工作均由 上海生工生物工程有限公司完成） 。测序采用 Ｐ Ｒ产物直接双向测序，测序引物为 Ｃ Ｐ Ｒ扩增所用引物。 Ｃ２ ． ４实验结果２４１不同培养基上的生长情况 ．． 四株马尔尼菲青霉在五种培养基上均生长良 　　 好，不同菌株的菌丝相和酵母相 在相同培养基上菌落形态、 生长速度及色素产生情况基本一致。 但在不同的培养 基上其菌丝相 ２℃的菌落形态、生长速度及色素产生情况不同， ５ 镜下形态也有７ Ｃ 差别 。其 ３＇酵母相菌落形态均为酵母样菌落，均无色素产生，生长速度大致 ．　 现以ＳＭ０５ 菌株为例予以说明） ｃ ＵＳ１２ 。 相同，菌落直径平均每天增加 ０ｌｍ（
中山大学博十学位论文马 尔尼菲 青霉生 特性研究及 物学 其差异 表达基 筛选和鉴定 因的第 ３ 马尔尼菲青霉抑制性消减文库的建立 章３ 前言 ． １比较马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相基因表达谱是从分子水平上研究双相性 　　　　转换的有效途径。 而寻找提取高质量总Ｒ Ａ的方法和灵敏度高， Ｎ 假阳性率 低的基因表达差异显示方法是顺利实施本实验的关键。目 Ｎ 前Ｒ Ａ提取和基因表达差异 示 术 多 ， 各 其 缺 。： 显 技 有 种 但 有优 点高质量Ｒ 提取是建立ｃＮ文库分子生物学研究的前提。尽管在目 Ｎ的 　　　　Ａ Ｎ ＤＡ 前ＲＡ 提取方法已是一种很成熟的技术，但是不同实验材料的 Ｎ 提取方法又各有所 ＲＡ异。 马尔尼菲青霉具有细胞 壁，富含Ｒａｅ　 Ａ ， Ｎｓ（Ｎ 酶）又含有大量的多糖， Ｒ 这给 Ｒ Ａ 提取增加了 Ｎ的 一定的难度． 本研究在参考多种Ｒ Ａ Ｎ 提取方法的基础上， 较 比了 ｎ ｓＰ ｎＭｎＫ ．　 ｏ 改良 异 Ｒｅｙ　 ｔ　ｉ　 Ｔｚｌ ａ ｌ ｉ ｉ ｒ ， 的 硫氰酸 ａ ｔ ｉ 脏法， Ｎ ｃ四 Ｒ Ａ Ｒ Ａｘ 种 Ｎ 提取方法，以 选择一种最有效的方法，为建立高质量的ｃＮ 文库奠定基础。 ＤＡ 主要的基因差异显示技术有以下几种， 　　　　　　 现对其优缺点予以说明。 Ｒ Ａ差 ｍＮ异 示 术ｆｍ Ｎ ｄｆ ｎ ｌ　ａｒｅ ｔｎｒｔ ＰＲ Ｄ Ｔ ＰＲ 显 技 ｃ（Ｒ Ａ　ｅ ｔ ｄｐｙ　ｓ ｒｓｉｏ Ｃ， Ｒ － Ｃ） ｌ　 ｉｒ ｉ ｉｌ ｅ ｅ　ｃ ｉ ｆ ｅ ａ ｓ ｖ ａ ｐ ｎ　 Ｄ其原理是将两种细胞的 Ｒ Ａ ｍ Ｎ 逆转录后进行Ｐ Ｒ Ｃ 扩增． 该技术的优点是可同时对 多个ｍ Ｎ 样本进行比较， Ｒ Ａ ＲＡ Ｍ Ｎ 起始用量较少。 但这个方法存在许多严重的缺陷， 它的５ 端随机引 ｀ 物一般常有２－ ＾ 个碱基不能与 Ｄ Ａ ３ ｃＮ 模板完全匹配， 而且 ＰＲ Ｃ 反应中随机性、 偶然性比 较大， 容易形成非特异性扩增而造成高的假阳 性率，这就 下游的 选工 使 筛 作很巨 ． 性差 分析 ＂ ｒｒｔｏ ｌ　ｒｃ 大 代表 异 技术 ］　 ｅａ ｎ ｄ ｅｎ （ ｅ ｎｔ ａ ｉ ｅ ｅ ｐ ｉ ｆ ａ ｌｉＲ Ａ 技术是 Ｄ Ｔ ＰＲ 衍生技术其重复 ｎｙｓ Ｄ ） ａｓ，　 Ｄ Ｒ－ Ｃ 的 性好， 性少， 适合 假阳 但不用于表达差异较大的 细胞群体及北测基因存在表达上调情况。 Ｎ 微列阵（Ｎ ＤＡ ＤＡ ｍｃ ａａ） ｉｏｒｙ又称为基因芯片技术． ｒｒ 这种方法是将大量的 Ｄ Ａ ｃＮ 同时固 定在同一支持物上， 因而可对某种组织或细胞内的大量基因进行平行检测， 因此能较好地反映出该组织或细胞整体基因的表达情况， 并能同时发现很多差别表达基因。 该方法的灵敏性很高， 便于重复， 而且芯片业已商品化， 分析技术自 动化。 但是， 利用基因芯片进行研究的实验成本很高， 一次实验至少需要上万元。抑制性消减杂交技术 ＂（ ｐ ｅｉ ｓｔｃ ｅ　ｉ ａ ｎＳＨ 是１ ６ Ｄ ｔｅ 。等 ＂　ｐｓ ｎ　ｒｔ ｈ ｒｉｔ ，　） ９ 年由 ｉ ｈ ｋ 人 ｓ ｒｓ ｕ ａｉ ｙ ｄ ｉ Ｓ ｕ ｏ ｂ ｖ ｂ ｚｏ ９ ａ ｎ ｃ发明。 该技术将驱动组和实验组进行两次消减杂交以及杂交后再经两次Ｐ Ｒ Ｃ 扩增， 得到的差别基因片段的特异性很高，与传统的 Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ ， Ｄ Ｒ － Ｃ 相比 显著地降低了中山 大学博十学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定实验中的假阳性率， 因而应用广泛。ＳＨ 技术也存在一些不足： １ Ｓ （ ）起始材料要求 ，一 要 Ｒ Ａ　 ２　 不 用于 源困 样品．２ ＳＨ技 较多 般需 ｍ Ｎ ０ －　 ｇ 适 来 难的 ． ｐ， ５ （ Ｓ 术 ）　建立在杂交基础上，非酶切位点区域内的点突变、 小缺失或插入不易被发现。３ （ ）分离到的差异表达基因片段尚需扩增全长。 （ ４ ）无酶切位点或酶切位点较少的基因无法用ＳＨ 技术筛选。 Ｓ在综合比较了上述差异显示技术后，我们决定将ＳＨ 　　　　 Ｓ 技术引入到研究马尔尼 青 双 差异 达基 的 菲 霉 相 表 因 研究中 期克 到 双 性转 相 基 ，以 险 与 相 换 关的 因。 ３ 材料，试剂和仪器 ． ２３２１实验材料 ．．３２１１构建消减文库的实验材料 ．．． 马尔尼菲青霉Ｓ Ｍ ０５， 本真菌室从一２ 血液病患儿血液中分离（ 　　　　 Ｕ Ｓ１ 由 ２ 岁的 经形态学及Ｄ Ａ序列证实） 在沙氏 Ｎ ， 培养基上定期传种保存。３２１２载体和菌株 ．．． ｐ Ｄ８ Ｔ 　　　　 载体购自 ａａａ Ｍ １－ ＴＫＲ 公司大肠杆菌菌株Ｄ ５　 　　　　 Ｈａ 用作克隆载体的宿主菌，为本实验室保存种。３２２主要试剂 ．．３ ２ ２ １主要试剂和试剂盒 ．． ．（） 　　ｙ　ｔ　 ｉ Ｑ ｇ ，　 ｎ 　　　　ｎ ｓＰｎ ｉＫ ：　 ｅ Ｇｒａ １ Ｒｅ ｌ Ｍｎ ｔ ｉ ｎ ｅ ｙ ａ ａ ｉ　 ａ ｍＴｉ ｚ ｖｒ ｏ Ｓ （） 　　ｌ ｎ ｔ ｅ；　 　　　　ｒｏ ：Ｉ ｉ ｇｎ Ｕ Ａ ２（） 　　 ｘ　ｇ ｔ 　　　　Ｎ ｅＲａ ｎ 上海华 ３ Ｒ Ａ ｅ ｅ： 舜生 有限 物 公司） ’ （ 　　　　 Ｒ ｃ Ｎ Ｓ ｔ ｓ Ｋｔ Ｃｏｔ ｈ Ｕ Ａ Ｓ 　　 Ｔ　 Ａ　 ｈ ｉ ｉ ｌ ｅ ，　 ＭＡ Ｄ ｙ ｅ ｓ　：　 ｎ ｃ Ｓ（） 　　ｕｋ　 Ｐｒ ｃ ｉ ｉＱ ｎＧｒ ｎ 　　　　Ｉｑｉ Ｐ Ｒ　 ｉ ａｏ Ｋｔ 吨ｅ，　 ａ ５ ＱＡ ｃ Ｃ ｕｆ ｔｎ　：　 ｉ ｅ ｙ ｍｌ： ＴＫ Ｒ 大连宝生物公司 ａａａ （） Ｒａ 　　　　ｓ ６Ｄ ｓ （ ａ ｒ ：　 ａ ａ 大连宝生物公司 Ｎ ｅ Ｒ ｅ　ｅ ａ （ 　　　　 ａ ｌ　ｎｓ Ｆｅ） ＴＫ Ｒ ， 乃Ｃ ｅ ＤＮＡ　 ｂｒｃｉｎ　ｔ Ｃｏ ｔｃ ，　ｍｅｉ ｎ Ｓ ｔ ｔ Ｋｉ ｕ ａ ｏ ：　ｌｎｅｈ Ａ ｒ ａ ｃ （ 　　　　 Ｒ Ｓ ｌ ｔ　 ８ ） Ｐ －ｅ ｃ ｃＴＫＲ （ 　　　　 Ｎ ９ ） 毛Ｄ Ａ连接酶： ａａａ 大连宝生物公司（０ Ｄ Ｐ ： 　　　　ＥＣ 广州化学试剂厂 １）中山大学博士学位论文Ｉ １ Ｌ ２ Ｌ ３ Ｌ ４ Ｌ 莎 Ｌ 百 ｒ 了 ｒ ８’ 上 罗 勿 ０’，马 尔尼菲青霉生 物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定异硫酸氰肛 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂 异丙醇 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂无水乙醇 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂水饱和酚 （ 分析纯） 广州化学试剂厂 ： 三氯甲 （ 烷 分析纯） 广州化学试剂厂 ： 十二烷基肌氨酸钠 （ 分析纯） 广州化学试剂厂 ： 柠檬酸钠 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂 二一疏基乙醇 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂水饱和酚 （ 分析纯） ：广州化学试剂厂Ｎ Ａ 分析纯） ａ Ｃ（ ：广州化学试剂厂 ＥＴ （ Ｄ Ａ 分析纯） 广州化学试剂厂 ：２ ｒ ２： ２’ ：２ 忍 勺 座 石 ．刃 ５ 油Ｎ Ｃ 分析纯） ａＬ（ ：广州化学试剂厂蛋白陈： 杭州微生物试剂有限公司酵母提取物 ： 杭州微生物试剂有限公司氨节青霉素：广州威佳生物有限公司３２２２主要试剂配方 ．．．（ 　　　　 １ ）异硫氰酸肌法裂解液： 含有４ ｏＬ ｍ ｌ 异硫氰酸９，５ 十二烷基肌氨酸钠， ／ ０％ ．０ ５ ｏＬ柠檬酸钠，二一疏基乙醇 （ ．ｍｌ ７ ／ 现加现用）．（）　（　ａ ｅａ） ２ Ｌ Ｌｒ－ ｒｎ 培养基： 陈ｌ ， Ｂ　 ｉＢｔ ｉ ｕ 蛋白 ｏ 酵母提 ｇ 取物５，ａＬ幅 融 ｇ Ｃｌ Ｎ于 ８０　 双蒸水中，用 Ｎ Ｏ ０ｎ ｉ ． ｌ ａＨ调Ｐ Ｈ值至 ７ ， ． 加双蒸水至 １，高压蒸汽灭菌 ５ Ｌ２ 分钟， ℃ ０ ４ 保存待用。 Ｂ固体培养基按液体配方配制，每升加 １ 琼脂粉， Ｌ ２ ｇ高压灭菌后倒平板。３２３主要仪器设备 ．．主要仪器和设备同第二章。 　　　　　　　　中山 大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定３ ． ３实验方法３３１实验材料的制备 ．． （）菌丝相的获得：将 ２１ Ｓ Ａ上培养的 Ｓ Ｍ ０５ 菌株接种于 Ｙ Ｂ 　　　　 １ ５ Ｄ Ｃ　 Ｊ Ｌ Ｓ１２ Ｍ（３ 的 提 ０％ 酵母 取物， 的 萄 ０％ 麦 糖， ５ ） 基中 ２Ｃ　 ｒ ． １ 葡 搪，． 的 芽 ｐ ． 液 ，５　０　 ％ ３ Ｈ ８　 １ ｐ ５ ｍ振荡培养 ７ｈ ２，见有红色色素及大量菌丝产生，离心收集菌丝体。 （） 　　　　 ２ 酵母相的获得：将 ２ＣＳ Ａ培养的 Ｓ ＭＳ１２ ５ Ｄ Ｔ Ｌ ０５ 菌株转种于脑心浸汁培养基 Ｂ ） 上， ２ 后显 （Ｈ 平皿 ７ 小时 微镜下观察 棒 丝 Ｉ 有短 状菌 产生， 转种直 反复 至出 现圆形、椭圆形、腊肠形的酵母细胞， 然后再接种于 Ｂ Ｉ Ｈ 液体培养基中， ７ ３ Ｃ　 ｒ １ ｐ ５ ｍ振荡 ０　 培养７ｈ 镜下观察有酵母细胞出 ２， 现， 离心收集。将收集到的菌丝体和酵母细胞用灭菌双蒸水洗涤，去除培养液，－８℃保 　　　　 ０存备用。３３２四种方法提取马尔尼菲青霉的总ＲＡ ．． Ｎ（ Ｒ ｅｓ Ｐ ｎＭｉ Ｋｔ １ ｎａ ｌ ｔ　 ｉ　 ）　 ｙ　 ａ ｎ ｉ将 末 转移 含４ ｐ Ｒ Ｃ（ 要 分为 酸 ） ｐｅ ｏ 管中， 　　 迅速 至 ５ Ｌ　 主 成 盐 肛 的Ｅｐ ｄ ｆ 粉 ０ Ｌ ｎｒ 两次过柱，具体操作步骤详见说明书。（ Ｔｚｌ ２ ｒｏ 法 ）　 ｉ①取约２ ｇ 丝 　　　　ｍ 的菌 体或酵 胞置于 ０ ０ 母细 研钵中 加入液 充分研磨 氮， 至粉末状， 迅速转移至含有 ｌ ｌ　ｏ的Ｅ 管中， ｍ Ｔｉ ｌ Ｐ ｒ ｚ 涡旋。 或在含有 １ Ｉ ｉ ｌ Ｐ （ ＭＴ ｚ 的Ｅ 管 ｒｏ 中直接加入玻璃珠０ ｍ ，剧烈涡旋 ５ ｉ ．１ ５ ｍｎ 。充分破坏真菌的细胞壁。 ）②室 　　　　 ｍｎ 低温离 温静置５ ｉ ， 心机４ １ ０ ｐ Ｃ　 ０ ｍ离心１ ｉ 取上清。 ２ ｒ ０ ５ｎ ｍ，③在 清夜 加 ． ］ 氛 吹 均 室 静置１ ｉ ４ １ ０ ｐ 　　　　 中 入０ｍ 的 仿， 打 匀， 温 上 ２ ０ ｎ Ｃ　 ０ ｍ ｍ ．　 ２ ｒ ０离心２ｍｎ 溶液分为 ０ ｉ后， 三层， 小心的吸取上层水相转移至另一 试管中， 注意不要吸到中间层。④在溶液中 　　　　 加入等体积的异丙醇，用手上下倒置 ３ｓ ０，室温静置 １ ｉ ４ ０ｎ ｍ ＞　Ｃ　 ０ ｐ １ ０ ｍ离心１ ｉ 可见管 有白 ２ ｒ ０ ５ｎ ｍ， 底 色透明 沉淀， 清。 物质 弃上⑤用Ｉ ７ 的乙 洗 淀 ４　０ ｐ 　　　　 ％ 醇 涤沉 物，Ｃ ５ ｒ 心５ｉ 小 吸出 ｎ ５ ｄ　 ７ ０ ｍ离 ｍｎ 后， 心的 乙醇，室温凉干。⑥加入３－ ｕ去Ｒ Ａ酶的水溶解沉淀物即为Ｒ Ａ溶液。 ０ ０ｌ Ｎ ５ Ｎ中 山大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定（ 改良 ３ ） 的异硫氰酸肌法将 末 速 移至 有 性 　　　　转 含 变 液的Ｅｐ ｄ ｆ 剧 旋涡 依次 粉 迅 ｐｎｒ ｅ ｏ 管中， 烈 ． 加入２ ｏＬ ｍｌ ／ＮＡ ， ａＣ 水饱和酚 氯仿／ ／ 异戊醇 （５ ４ ） 振荡混匀， ２： ： ， ２１ 冰浴． Ｎ Ｒ Ａ沉淀及洗涤方法同Ｔｉ ｌ ｒｏｏ ｚ（ Ｒ Ａ ｘ　 ｇｎ： ４ Ｎ ｅ Ｒａｅｔ ） ｅ 变性液为Ｒ Ａｘ 提取步骤与Ｔｉ ｌ 　　　　 Ｎ ｅ， ｒｏ法基本相同。 ｚ 上述方法提取的Ｒ Ａ均 Ｎ用２ 无Ｒ ａ 水溶解，一 ０ 保存。 即Ｌ Ｎｓ ｅ ８℃３３３　ＭＡ Ｔ　 Ｎ 的合成 ．． Ｓ Ｒ ｃ Ａ Ｄ按照 Ｓ Ａ Ｔ　 Ａ　ｈｓ Ｋｔ　ｎ ｃ） Ｍ Ｒ ｃＮ Ｓｔ ｉ ｉＣｏｔ ｈ Ｄ ｙ ｅｓ　（ｌ ｅ 操作手册进行操作，具体步骤如下。３３３ １ 第一链 ｃＮ ．．． ＤＡ合成① 分别马 　　　　 尔尼菲 青霉菌丝相和酵母相总Ｒ ｌｇ Ｎ ｐ 放入２ ．　的 应管 Ａ　 个０５ｌ 反 ｍ中 再向 个反 ， 每 应管中 别 入１ 的３ Ｄ　Ｒ Ｃ 物Ｉ Ａ１ ｍｌ ） 分 加 川 ＇　Ｍ Ｔ　 ＢＳ Ａ Ｄ Ｓ引 Ｉ　２ ｏ／ （ｐ Ｌ 和ｌｌ Ｄ　Ｒ Ｉ寡 昔 １ ｍｌ ） 最 加 无菌 终体 ｐ； ｐ 的Ｂ Ｓ Ｔ　 核 酸（ｐｏ Ｌ， 后 入 水， 积５ｌ Ｍ Ｉ Ａ ２ ／② 棍匀反应管中的试剂，并简短离心； 　　　　③ 在 循 上７℃ 育２ｉ 　　　　 仪 ０ 温 ｍ ； 热 环 ｎ④ 涡漩并简短离心，确保试剂集中于反应管底部，室温放置； 　　　　 ⑤ 向每个反应管中加入下列试剂： 　　　　２ ５第 链 冲 　　　　　　　　 川 Ｘ 一 缓 液１　 ＤＴ　 ｍｏ／ 　　　　　　　　） ｐ Ｔ （０ｍｌ １　 ２ Ｌ １　 ５Ｘ ＮＰ１ ｍ ／） 　　　　　　　　 ｌＬ ｌ ｉ ０ ｄＴ （ ｍｏ ｌ　 ０ １　 Ｂ Ｐｗｒｃｉｔ 　　　　　　　　 反转录酶 ｇ Ｄ　 ｅＳｒｐ １　 ｏ⑥ 轻轻涡漩混合，并短暂离心； 　　　　⑦ 用ＰＲ 　　　　仪在４℃下温育１； Ｃ ２ ｈ⑧ 温育 成 加 ０ Ｅ 冲 内 ｏ ｏ Ｌ　 Ｐ ．　 ｍｌ 　　　　 后， 入４闪Ｔ缓 液〔 含ｌ ｍｌ Ｔｉ（ ７ ） ｍｏ Ｌ 完 ｍ ／ ｒｓ　 ６和ｌ ／ ＨＥＴ］ ＤＡ稀释第一链反应产物； ⑨ ７℃ 　　　　 ｍｎ ２ 温育７ｉ，样品放置－０ 备用。可保存至少三个月。 ２℃３３３２利用 Ｌ ＰＲ ．．． Ｄ　 进行 ｃＮ 扩增 Ｃ ＤＡ 由于使用的 Ｃ 　　　　 Ｐ Ｒ仪及摸板差异，需要根据实际情况来确定最合适的 ＰＲ Ｃ扩中山大学博士学位论文马尔尼菲青 霉生物学特性研究及其差异表达基因的 缔选和鉴定增循环数。操作步骤如下：① 预热Ｐ 仪到９Ｃ　 　　　　 Ｒ Ｃ ５　 ；② 每个第一链ｓｃＮ 　　　　 ｓ　 Ａ样品做两个ＰＲＳｌｔ Ｄ Ｃ － ｅ 管和一个额外管， ｅｃ 并在每个反 管 加 第 链 反 产 ｓ　Ａ．　 再 入８ 川的 菌 ； 应 中 入 一 的 应 物ｓ Ｄ Ｉ 以， 加 ． ｃＮ ５ ５ 无 水③ 根据需要扩增的反 　　　　 应管数目 按以 ， 下各试剂用量及顺序， 做一管总的试剂混合液。每个反应管 　　　　　　试剂成份 Ｄ ｉｎ ｚ ｄ　Ｏ ｅｏ ｉｅ Ｈ Ｚ１ Ｘ　 Ａｖ ｎａｅ Ｐ Ｒ　ｆｅ Ｏ　Ｄ　 ａｔｇ２　 Ｂ ｆｒ Ｂ ｄ Ｃ ｕ每个反 用量 （１ 应管 Ｐ） ７４ ｌ０ｎ ‘ ｎ ‘５Ｘ　 Ｐ　０ｍ ｌＬ ０　Ｎ （ ｍｏ／） ｄＴ １５ ＰＲ　 ｍｒ　 Ａ１ ｍｌ ） ＇　 ｐｉ １ （ Ｐｏ／ Ｃ ｒ ｅ １　 ２ Ｌ５Ｘ　 ａｔｇ２　ｌｍｒｓ Ｍｘ Ｏ　ｄ ｎａｅ Ｐ ｙｅａｅ　 Ａｖ ｏ ｉＴｔｌ ｏａ④ 涡漩混合管短暂短离心； 　　　　⑥ 向 中 个 应 中 入９ 　　　　 每 反 管 加 ０ 合 ② 的 泌混 液；⑥ 按以 程序立即 　　　　 下 进行Ｐ 扩增， Ｃ Ｒ 在第 １ 个 环时 所有ＰＲＳｌｔ ５ 循 将 Ｃ－ ｅ 管 ｅｃ取出 ℃ 箱保 从 外 取出１ １ 产 备 琼 糖电 析， 置４ 冰 存， 额 管中 ５ 扩增 物以 进行 脂 泳分 Ａ按原 程序 扩增 继续扩 额外管， 增 每增加３ 个循环， 从 分别 额外管中 取出１ １ 再 ５ Ｂ产物，直至总循环数到２ 循环； ７９Ｃ　 ｉ） ５ （５）－５ （ ｓ－６Ｃ　 ｍｎ ５ （ ｎ－９０ １ｓ－６Ｃ　 ）－８ （ ｉ） ｌ ｍ Ｃ　 ３ ０ ６⑦ 分 取５１ 循 数的 管中 Ｃ扩 产 用１ ９ 脂糖、 　　　　 Ａ 不同 环 额外 的ＰＲ 增 物， ．６ 琼 别 ２的ｉ 的ＴＥ ｘ Ａ 缓冲液进行电 泳分析，以确定最适合的ＰＲ Ｃ 扩增循环数：⑧ 从４ 　　　　 ℃冰箱中取出所有Ｐ ＲＳｌ ｔ Ｃ － ｅ 管，根据步骤７ ｅｃ 的分析结果，分别扩增到 各自 最适循环数， 扩增结束后， 的 当 取出５１ Ｂ 扩增产 物进行电 泳分析， 并与步骤７ 的结果相比较，以 证实实验是否成功：⑧ 向 个ＰＲＳｅ 管中 入２ ．　／ Ｄ 溶 终 反 　　　　 Ｃ － ｌｔ 加 川０５ １ 的Ｅ Ａ 液以 止 应； 每 ｅｃ ｍ Ｌ Ｔ ｏ⑩ 分别取７１ 　　　　 １ 上述ＰＲ ｔ Ｃ 粗产物到对应的 千净０５ｌ ．　反应管中， ｍ 标明 “ 样品中山大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定Ａ 字样， ２℃下保存，以 ” －０ 备进行ＰＲ Ｃ 产物纯化。 ３３３３　Ｃ 产物纯化 ．　．　 Ｒ ．　 Ｐ 使用ＱＡ Ｎ的ＱＡｕ ｋ　 Ｐｒｃ ｉ Ｋｔ ｓ　 Ａ进行纯化，具 　　　　 Ｅ ＩＧ Ｉｑｉ Ｐ Ｒ　 ｆａｏ ｉ ｃ Ｃ ｕｉ ｔｎ　 对ｄ ｃＮ ｉ Ｄ体操作步骤如下：① 向每个酶切反应管中加入５ 　　　　 倍体积的Ｐ 缓冲液，涡漩混匀； Ｂ② 将柱子放入２ｌ 　　　　 ｍ 收集管中；③ 转移样品 　　　　 溶液到 柱子中 ２０ ，１ 呢离心ｌｉ； ０ ｍｎ④ 弃掉收集管中的废液，将柱子放回同一只收集管中； 　　　　⑤ 向 子中 　　　　 加入７ Ｐ Ｐ 缓 进 洗脱， ２ ０离心ｌ ｎ 柱 ５ １　 冲液 行 ０ Ｅ １０ ０ｇ ｍ； ｉ ⑥ 弃 集 的 液， 柱子 同 只 集 　　　　 管中 废 将 放回 一 收 管中， ２ 呢离 ｍｎ 掉收 １ ０ 心ｌ ； ０ ｉ⑦ 将 放 只 的１ ｍ 心 　　　　 入一 千净 ．　离 管中，向 柱子 ５１ 柱子中 加 ０５ １　 央 入３ ０ Ｅ －Ｐ Ｂ缓冲（ ｍｏ／ ＴｉＣ，　 ．　１００ 离心 ｌｉ， １ ｍｌＬ　－Ｉｐ ８５，　０ｇ Ｏ ｒ Ｈ　） ２ ｍｎ 洗脱液即为纯化的ｄ ｃＮ． ｓ　Ａ Ｄ３３３４　ａ ．．． Ｒ Ｉ酶切 ｓ在酶 　　　　 取上一步中ｄｃＮ 切之前， ｓ　 Ａ洗脱液 １ 放入 Ｄ ０ 闪 一个干净的０５ｌ 心 ．　离 ｍ管中，标明 “ 样品Ｄ ”字样， ２℃下保存，以备用做 Ｅ 琼脂糖凝胶电泳分析。 －０ Ｂ①分 纯 　　　　 化的ｄ ｃＮ 脱液中 别向 ｓ　 Ａ洗 Ｄ 加入３ ０　ａ 缓 液 １ Ｐ ６ Ｘ　ｌ 冲 和 ．　 时１ Ｒ ｓ ５１Ｒａ （ Ｕ 。 ｓｌｌ ） ０②涡 　　　　 漩并短暂离心， ７ 温育３； ３＇ Ｃ ｈ③用 　　　　 做 样品Ｄ 对照， 别 切 分 酶 后的ｄｃＮ Ｉ ｌ 行Ｅ琼脂 胶电 ｓ　Ａ　 进 Ｂ 糖凝 泳， Ｄ Ｏ Ｐ检查是否酶切成功：④向 　　　　 应管中 每个反 加入８ Ｏ ｍｌ 的Ｅ Ａ Ｅ ．　 ／ Ｄ 溶液以 ｄ ５ｏ．　 Ｔ Ｌ 终止酶切反 应：⑤ 分别 　　　　 Ｏ１ 切 取Ｉ 酶 后的ｃ Ａ 入 应 千净０５ 离 Ｐ Ｄ 放 对 的 Ｎ ．　 心管中 标明“ １ １ １ １ ， 样品Ｅ 字样， ２℃下保存， ” －０ 用于与以 下最终纯化的 ｃＮ 产物进行 Ｅ 琼脂糖凝 ＤＡ Ｂ胶电泳分析。⑥使用ＱＡ Ｅ 　　　　 Ｇ Ｎ的ＱＡｕｋ　 Ｐｒｉｔｎ　对酶切 Ｉ Ｉｑｉ Ｐ Ｒ　ｉ ａ Ｋ ｃ Ｃ ｕｆ ｉ ｉ ｃｏ ｔ 后的ｃＮ 进行纯 ＤＡ化， 步骤同３３３ 用紫外分光光度计进行ｃＮ 的含量测定或Ｅ 琼脂糖凝胶电 ．．。 ＤＡ Ｂ 泳分析。 ＤＡ 此ｃＮ 即是酶 ＭＡ ｃＮ， 切ＳＲＴ　 Ａ 然后利用真空离心干燥浓缩至 １ Ｌ Ｄ ０． ｔ Ｉ
中山大学博士学位论文马尔尼菲青霉生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定ＲＡ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Ｎ５ ／广 气 勺 ２ 气 勺 沪 ＇、，了 氏 勺 ２ 、 、ｐｌ ３ ｏ Ａ　 ｙ ＇Ｂ Ｓ ＲＴ 　　　　　　　　 Ｄ　 ＭＡ Ｔ Ｍ１ Ｇ ５ Ｇ 尹　 ＧＢ Ｓ ＲＩ 　 Ｄ　 ＭＡ Ｔ　 Ａ Ｉ Ｍ ＴＣ Ｓ　 ｅＩ 　　　　　　 Ｄ ｐｉ ｒ　 ｒ Ｉ　 ｍ ＡＦｒｔ ｔ ｎ ｉ －ｒ ｄ ｓ ｓａＯｇ ｕｌ ｔ ｅ 　　ｎｃ ｏｄ ｌｏ ｅ ｉ ｉｓｎ ｅｉｂ Ｒ ｙｔ ｓ ｙ　 ｈ ｓ　 Ｔ、．Ｇ ．Ｇ ．Ｇ ，５ ／／／／八 、、 了 八ｐｌ ’ 、、、、 尹／六 、 ｏＡ 、 ｙ．． 　　 ．．．．－ ．．．喇． ．－ ． ． － ￣ ．． ． 二二 叫 】．．．．．Ｓｇ ｉｌ ｎｅｄ ｔ ｌｇ　 Ｔ Ｃ　ｉ ｂ Ｒ ａ ｎ ｙ　 ｉ ５ ＇　 、 ｗ 八八Ｍ 八八八ｒ　 ｌ ｐｙ ｏＡｓｅ ｔｐ。．Ｇ ．Ｇ ．Ｇ ，Ｔｍ ｌｅ　ｔ ｉ ｅ ｐ ｔｓ ｉｈ ｇ ａ ｗ ｃｎ ａｄ　ｅｓ ｎ　 Ｔ ｎ ｅｔ ｉ ｂ Ｒ ｘ ｎ ｏ ｙ　、 、 了 户 、 目 ／ 、 Ｐ呱 厂八、Ｊ户、． 卜 ＯＡｐｌ Ｄ Ａ ｎ 勺ｃＮ 勿山ＰＲ Ｂ Ｃ ｗｔＰＲ　 钾 ． ｉ Ｃ ｐｇ ． ｈ　 ｒ ｉＤ ｕ ｌ－ｔ ｎ ｅ ｃ Ｎ ｏ ｂｅｓｒ ｄ ｄ　 Ａ ａ Ｄ．．．．．－ ． － － ． ． ．． ．． ．． 曰 ． ． ．． ． ． ．． ．． ．． ．．．．． 曰 ． － ． ． ． ．．． ． ￣ － ， ．一 ￣ 月．．．．．图３８　Ｍ Ｒ － Ｓ Ａ Ｔ技术流程图 （ 引自Ｓ Ａ Ｔ Ｍ Ｒ 技术说明书）３５３ 抑制性消减杂交技术的讨论 ．． ＳＨ 　　　　 抑制Ｐ Ｒ Ｓ 法是以 Ｃ 为基础的ｃ Ｎ 消减杂交法。通过合成两个不同的接 ＤＡ 头， 接到试验方ｃＮ 的５’ 达到选择性扩增目 Ｄ Ａ ＤＡ 端， 的ｃＮ 片段，同时抑制非 目 的片段扩增的目 所谓抑制Ｐ Ｒ 是利用链内 的。 Ｃ， 退火优于链间退火， 链间退 比火更稳定， 从而使非目 的系列片段两端反向 重复序列在退火时产生类似于“ 锅柄”的结构， 无法与引 物配对， 选择性地抑制了 的 非目 基因片段的扩增。 同时， 该方法运用了杂交二级动力学的原理，即丰度高的ｃ Ｎ 在退火时产生同源杂交的速 ＤＡ中山大学博士学位论文马尔尼菲青舞生物学特性研究及其差异表达基因的筛选和鉴定度快于丰度低的单ｃＮ ， Ｄ Ａ 从而使原来在丰度上有差异的单链ｃＮ 相对含量达 ＤＡ到基本 致［。 一 ［ 采用ＳＨ 法具 ８ ｌ ） Ｓ 方 有速度快、 率高， 效 一次反 应可同 时分离 几十或上百个差异表达的 基因； 性好、 重复 假阳性率低； 敏感程度高， 对高、 低丰度的差异表达基因都能有效分离等特点。勺 ‘ 曰． 翻民，加 西 自 　　　　　　　　　　耳 ．， ．． ． 白自 Ｄ ｌｗ ｄ 月 阮 ： “目 ｒ ｖ 口 曲！ ｘ 下 目“ 二 日 ‘ 月．翻 ｄ 脚“ ２ 自几 匕 ．氏 阮ａ ｄ ＋．４“ 一一工＞ 目 　　 Ａ． ￣ 甘已 　　　　　　　　　　　　目ｄ ｄ． 日， 曰ｎ ｊ．Ａｍ口 脚，脚 ｐ 翻 〔． ＂ 州洲． ｕ ．　 ．ｍ － － ｓ ．＾ ｏ肠 ＾肠 ． ｒｗ 而 ． ． ｎ ． ＞ 印翻 ｔ 目 ．． ．白ａ 由‘ ．宜二〕．．．．．．．．叫娜 ．． 牙 ，舍 ．．二二卜 ．． ．． ．． ．． ．叫 皿．甲 　　　　盛． 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 口 ． ， ．． ｓ 二 口 肠．口 ． 月 目１ 拍 ‘二 ｄ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｒ ｐ ． 肠。 ｅ ｄ ｏ 仇ｅ　 ａ ｍｏ 川二 出．峨 ｎ ｓ　 ｆ ｙ６ 山ｎ ． 月出阅 曲 山．．达．ｐ ｍｓ 目． 口二 ｒ ｈ ｍｏｏ 丫叭 目 ．ｔ ｅ 由 Ｏ ｏ ｌ叼 卜．　 ｎ ｎｏ ｃ 份陇 ． 、 ｗｏ　 目 …口Ｐ Ｒ可俪ａ－ Ｃ．口 ． ｒｍａｎ 幽时日 恤 ｏｎ二 ｐ ｎ 峨 ． ｊ 口门 ． ． ｒ‘凡， ｐｏ击． ｅ ［　＂ ｒ　 ｏｔ ｌ　峥‘ ｐ ｆｒ ｙ ｓ ｒ ｃ ． ａ}