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HPLC法对氟尼康中盐酸多西环素及氟苯尼考含量的测定
　　[摘要] 目的: 建立了同时检测药物氟尼康中盐酸多西环素、氟苯尼考的高效液相色谱检测法。方法:采用Hypersil-ODS2 (4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相为乙腈∶甲醇∶磷酸二氢铵(0.1 mol/L)=10∶11∶29,pH=3.50,检测波长为254 nm,流速为1 ml/min。结果:实现了氟尼康中盐酸多西环素、氟苯尼考的较好分离;盐酸多西环素在6.25～200.00 μg/ml范围内线性关系良好,r=0.999 4,平均回收率为99.29%,RSD为0.51%(n=3);氟苯尼考在6.25～250.00 μg/ml范围内线性关系良好,r=0.999 9,平均回收率为98.87%,RSD为0.32%(n=3)。结论:该方法快速简便,灵敏度高,重现性好,可作为药物氟尼康质量标准的测定方法。 中国论文网 /6/view-2521473.htm　　[关键词] 高效液相色谱;盐酸多西环素;氟苯尼考;氟尼康 　　[中图分类号]R927.2[文献标识码]B [文章编号]09)07(a)-068-03 　　 　　盐酸多西环素、氟苯尼考为我国兽药标准《兽药国家标准-兽药地方标准上升国家标准(第一册)》中批准的内服药。盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride)为四环素类广谱抗生素,主要用于革兰阳性和阴性菌感染[1]。氟苯尼考(florfenicol)为氯霉素类广谱抗生素,主要用于治疗鱼、猪、牛及家禽类的细菌性感染[2]。我国及欧盟、日本等国对盐酸多西环素和氟苯尼考在动物体内含量有严格要求,因此,对于有治疗作用的氟尼康中盐酸多西环素和氟苯尼考含量的测定,需有严格的标准定量测定。药典中包含两种物质各自的检测方法,而对于两种物质的同时检测没有相应的规定。因此,建立盐酸多西环素和氟苯尼考的同时检测的方法,在药物生产和药品检验过程中极为重要。盐酸多西环素和氟苯尼考的检测方法多采用薄层检测法、气相色谱法、液相色谱法[3-6]等。本论文采用较为简单的溶剂作为流动相,建立了同时检测两种物质的高效液相色谱法,方法简便、精确、检测灵敏度高,分析时间短等优点,可以作为药品质量标准制定的依据和参考。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 仪器与试剂 　　1.1.1 仪器高效液相色谱仪(LC-10ATvp日本岛津公司)配SPD-10Avp紫外检测器;TOP色谱工作站;针筒式微孔滤膜过滤器0.45 μm(天津市腾达过滤器件厂); AL-204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);PHS-3CPH计(上海精密科学仪器有限公司),KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。 　　1.1.2 试剂盐酸多西环素、氟苯尼考标准品、氟尼康(河北远征药业提供);甲醇(色谱纯,天津康科德公司);乙腈(色谱纯,天津康科德公司);磷酸二氢铵(天津市博迪化工有限公司);磷酸(天津市北方天医化学试剂厂);三次蒸馏水。 　　1.2 色谱条件 　　色谱柱:大连依利特公司,Hypersil-ODS2 (4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈∶甲醇∶磷酸二氢铵(0.1 mol/L)=10∶11∶29,pH=3.50,检测波长为254 nm,流速为1 ml/min,柱温:30℃,进样量10 μl,灵敏度0.01 AUFS。 　　1.3 储备溶液配制 　　分别精密称取盐酸多西环素、氟苯尼考标准品各50 mg,置于50 ml棕色容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为储备液,4℃冰箱冷藏待用。 　　1.4 供试液的制备 　　用研钵将氟尼康研碎后,称取50 mg,置于50 ml棕色容量瓶中,用流动相溶解后并定容,作为供试液,4℃冰箱冷藏待用。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 流动相的选择 　　实验中考察了乙腈-水、甲醇-水的不同比例的流动相对两者的分离效果,盐酸多西环素和氟苯尼考的出峰时间相同,不能够达到分离,因此将乙腈、甲醇以一定比例混合加入磷酸二氢铵的盐溶液,对3种溶液比例进行了调节,实验中随着乙腈和甲醇比例的增加,两种物质出峰时间同时前移,分离效果渐差;当乙腈比例逐渐增大时,氟苯尼考的色谱峰型渐差;当甲醇比例逐渐增大时,盐酸多西环素的色谱峰型托尾严重;磷酸二氢铵盐溶液比例增加时,两种物质出峰时间向后推移,且分离效果逐渐变优,但盐溶液加入过多时,二者保留时间较长,且分离不佳。此外,pH值的确定也会同时影响二者的分离效果,适当减小pH值,可以达到较优的分离效果。实验通过调节得到乙腈∶甲醇∶磷酸氢二铵溶液=10∶11∶29,pH=3.50,为最佳比例。 　　2.2 检测波长的选择 　　盐酸多西环素的紫外吸收的最大波长为269 nm,氟苯尼考的紫外吸收的最大波长为220 nm,盐酸多西环素和氟苯尼考结构式中均含有苯环,因此为了使得两者都能更好的检测,选定检测波长为254 nm。 　　药品氟尼康中盐酸多西环素和氟苯尼考的分离色谱图、标准品盐酸多西环素和氟苯尼考的分离色谱图。 　　2.3 标准曲线的绘制 　　精确移取储备液适量,并将储备液置于容量瓶中,用流动相定容,由此逐级稀释得一系列的标准溶液,用孔径0.45 μm的有机系微孔滤膜滤过。在1.2项条件下,进样分析,以其色谱峰面积(Y)作为纵坐标,以分析样品浓度(C)为横坐标,进行线性回归,绘制标准曲线。 　　盐酸多西环素的标准曲线为:Y=-10 611+3.533 2×106C,r=0.999 4,在6.25~200.00 μg/ml浓度范围内线性良好;氟苯尼考的标准曲线为:Y=-292.97+1.99×105C,r=0.999 9,在6.25~250.00 μg/ml浓度范围内线性良好。 　　2.4 回收率试验 　　分别精密称量0.080 、0.100、0.120 g的盐酸多西环素和氟苯尼考置于10 ml容量瓶,加入适当流动相定容,并定量稀释成约80、100、120 μg/ml的溶液(每个浓度n=3),超声溶解,用孔径0.45 μm的有机系微孔滤膜滤过。精密吸取上述溶液10 μl,注入液相色谱进行分析,用标准曲线进行计算回收率。 　　2.5精密度试验 　　将盐酸多西环素和氟苯尼考储备液稀释10倍,分别量取两种溶液各25 ml,均匀混合后,注入液相色谱进行分析,连续进样7次,计算该方法的精密度,得到盐酸多西环素的精密度为RSD=0.87%;氟苯尼考的精密度为RSD=0.72%。 　　2.6稳定性试验 　　供试品溶液在自然光照射的条件下,在0、2、4、6、10、12、24 h时测定其主成分峰面积,盐酸多西环素和氟苯尼考二者峰面积基本不变,RSD分别为0.94%和0.83%,结果表明供试品氟尼康溶液在24 h内基本稳定。 　　 　　3 讨论 　　 　　经过反复试验,对检测方法中使用的溶剂、检测波长、流动相等分析条件进行了多次摸索,找到了一种在同一色谱条件下,实现对药物氟尼康中盐酸多西环素和氟苯尼考的同时检测的方法。本方法简便、快捷,结果可靠准确,可用做药物氟尼康的质量标准的测定方法,灵敏度高,显示出较好的分离效果。 　　 　　[参考文献] 　　[1]徐群.高效液相色谱法测定盐酸多西环素原料药中的有关物质[J].齐鲁药事,):159-160. 　　[2]郭霞,张素霞,沈建忠,等.鱼肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的高效液相色谱检测[J].中国兽医科学,):743-747. 　　[3]范琦,蒋心惠,邓晴源,等.高效液相色谱法测定人尿中盐酸多西环素[J].中国医药药学杂志,):447-450. 　　[4]杨方,余孔捷,黄建生.高效液相色谱法检测鳗鱼中氟苯尼考残留量[J].分析试验室,):44-46. 　　[5]王旗,蒋激扬,谢蜀生.高效液相色谱法测定血清中多西环素[J].中国临床药学杂志,):224-226. 　　[6]王军,张晓明,曾万溪.盐酸多西环素HPLC测定色谱条件的改进[J].现代食品与药学杂志,):53-55. 　　(收稿日期:)
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