氧化镁法脱硫法_百度百科
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氧化镁法脱硫法
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脱硫技术是一种成熟度仅次于钙法的工艺，氧化镁脱硫工艺在世界各地都有非常多的应用业绩，其中在日本已经应用了100多个项目，台湾的电站95%是用氧化镁法，另外在美国、德国等地都已经应用，并且目前在我国部分地区已经有了应用的业绩。
氧化镁法脱硫法原理
锅炉烟气由送入段，冷却至适合的温度后进入吸收塔，往上与逆向流下的吸收浆液反应，
氧化镁法脱硫法
脱去烟气中的硫份。吸收塔顶部安装有，用以除去净烟气中携带的细小雾滴。净烟气经过除雾器降低烟气中的水分后排入。粉尘与脏东西附着在除雾器上，会导致除雾器堵塞、系统压损增大，需由除雾器冲洗水泵提供工业水对除雾器进行。
吸收过程发生的主要反应如下：
Mg(OH)2 + SO2 → MgSO3 + H2O
MgSO3 + SO2 + H2O → Mg(HSO3)2
Mg(HSO3)2 + Mg(OH)2 → 2MgSO3 + 2H2O
吸收了的吸收液落入底，吸收塔底部主要为氧化、循环过程。
由向塔底浆液内强制提供大量压缩空气，使得造成的MgSO3氧化成。这个阶段化学反应如下：
MgSO3 + 1/2O2 → MgSO4
Mg(HSO3)2 + 1/2O2 → MgSO4 + H2SO3
H2SO3 + Mg(OH)2 → MgSO3 + 2H2O
MgSO3 + 1/2O2 → MgSO4
是将落入塔底的吸收液经重新输送至上部吸收区。塔底吸收液pH由自动喷注的20 %浆液调整，而且与酸碱计连锁控制。当塔底浆液pH低于设定值时，氢氧化镁浆液通过输送泵自动补充到吸收塔底，在塔底搅拌器的作用下使浆液混合均匀，至pH达到设定值时停止补充氢氧化镁浆液。20 %氢氧化镁溶液由粉加热水熟化产生，或直接使用氢氧化镁，因为氧化镁粉不纯，而且氢氧化镁溶解度很低，就使得熟化后的浆液非常易于沉积，因此搅拌机与氢氧化镁溶液输送泵必须连续运转，避免管线与吸收塔底部产生沉淀。
氧化镁法脱硫法优点
原料来源充足
在我国氧化镁的储量十分可观，目前已探明的氧化镁储藏量约为160亿吨,占全世界的80%左右。其资源主要分布在辽宁、山东、四川、河北等省，其中辽宁占总量的84.7%，其次是山东，占总量的10%，其它主要是在河北邢台大河，四川干洛岩岱、，甘肃肃北、别盖等地。因此完全能够作为应用于电厂的脱硫系统中去。
脱硫效率高
在化学反应活性方面要远远大于钙基脱硫剂，并且由于氧化镁的分子量较碳酸钙和氧化钙都比较小。因此其它条件相同的情况下氧化镁的脱硫效率要高于钙法的脱硫效率。一般情况下氧化镁的脱硫效率可达到95-98%以上，而石灰石/石膏法的脱硫效率仅达到90-95%左右。
投资费用少
由于作为本身有其独特的优越性，因此在的结构设计、循环浆液量的大小、系统的整体规模、设备的功率都可以相应较小，这样一来，整个脱硫系统的投资费用可以降低20%以上。
运行费用低
决定系统运行费用的主要因素是的消耗费用和水电汽的消耗费用。的价格比氧化钙的价格高一些，但是脱除同样的SO2氧化镁的用量是的40%；水电汽等动力消耗方面，液气比是一个十分重要的因素，它直接关系到整个系统的脱硫效率以及系统的运行费用。对石灰石石膏系统而言，液气比一般都在15L/m3以上，而氧化镁在7 L/m3以下，这样氧化镁法脱硫工艺就能节省很大一部分费用。同时氧化镁法副产物的出售又能抵消很大一部分费用。
镁法脱硫相对于钙法的最大优势是系统不会发生设备结垢堵塞问题，能保证整个脱硫系统能够安全有效的运行，同时镁法PH值控制在6.0-6.5之间，在这种条件下设备腐蚀问题也得到了一定程度的解决。总的来说，镁法脱硫在实际工程中的安全性能拥有非常有力的保证。
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细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用
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　　钙位于元素周期表中第2列,属于碱土金属。钙离子是一种重要的二价阳离子,它和许多其它阳离子的物理学性质非常相似,但具有独特的生物学功能。表现在,钙离子不仅是电流的载体,作为二价阳离子维持胞内外电化学梯度,而且还是一种重要的细胞内第二信使,参与肌细胞收缩、腺细胞分泌、神经递质释放、受精、细胞分化和程序死亡等过程。事实上,真核生物几乎所有的细胞分子事件都有钙离子的参与。细胞内、外自由钙离子的分布很悬殊。组织液中一般为几mmol/L,而胞浆中的自由钙只有100 nmol/L左右。细胞内的钙离子分布也很不平衡,可以被各种细胞器贮存。从总量上讲,胞内50%的钙位于细胞核内, 30% 位于线粒体内,14%位于内质网内, 5%左右位于胞膜上,只有剩余的1%左右位于细胞质内[ 1 ]。其中,大部分还被胞浆内的各种缓冲剂,如各种钙结合蛋白所螯合,真正的游离钙大概只占0.01%左右。细胞内钙离子很重要,但也很危险。持续的钙升高会和胞内重要的能量物质磷酸根结合形成沉淀而导致细胞死亡[ 1 ]。细胞对钙离子有一套完备的监控系统以维持钙的内稳态平衡。细胞膜系统上有许多跟钙离子调控密切相关的蛋白质。这些蛋白质位于细胞膜或细胞器膜上,可以允许细胞外钙离子顺着浓度梯度进入细胞内,即钙内流,也可以帮助细胞器中的储存钙释放至细胞浆,即内钙释放;膜系统上与降钙相关的蛋白质拮抗着此升钙蛋白质的作用,二者共同维持钙的分布平衡。细胞膜上有很多和钙流入有关的通道和受体。最引人注目就是电压门控性钙离子通道( voltage dependent Ca2 +channel, VDCC) 。VDCC存在于许多具有兴奋性的细胞膜表面,如神经元、心肌、骨骼肌和平滑肌细胞上。它有很多亚型。根据通道的生物物理特性和药理学特性,可以分为L,T, N, P /Q, R型[ 2 ]。L型主要分布于骨骼肌细胞和心肌细胞,与兴奋收缩偶联密切相关; T型在心肌和神经元中分布;N型、P /Q 型和R 型则主要在神经组织中分布,与递质释放有关。除了VDCC, 细胞上还存在受体激活的钙通道( recep2tor activated Ca2 + channel, RACC) ,即通道的开放依赖于配体的参与。可分为配体门控型钙离子通道和代谢型钙离子通道。配体门控型钙通道,离子通道本身就是受体,或是受体复合物的一部分,如NMDAR、部分AMPAR、P2XR、52HT3R等[ 3 ]。这些离子通道为非选择性的阳离子通道, 主要对Na + , K+通透,但也具有一定的钙离子通透性。代谢型离子通道和G蛋白偶联受体(G p rotein coup led recep tor, GPCR)通过Gq /112PLC信号转导通路相连。启动GPCR,可以导致下游钙离子通道的开放。目前已有报道的有mAChR,P2YR, NAa1R, SPR偶联的离子通道等[ 3 ] 。长期以来该通道的分子实体不详,并且在不同的细胞类型中具有不同的名称,如CAN (Ca2 + activated non2selective cation channel) , CR IC(Ca2 + release induced Ca2 + entry) , ROCC ( recep tor operatedCa2 + channel)和SOCC ( store operated Ca2 + channel) [ 3 ]。瞬时感受器电位( TRP, transient recep tor potential)通道家族的克隆为这一领域打开了新的局面,成为这些通道的可能分子实体[ 4 ]。目前,各种在体代谢型钙通道和TRP 分子的对照性研究是钙离子通道领域的热点之一。除了胞膜上的这些钙通道外,能够引起胞内钙升高的还有內质网或肌浆网上的IP3R和雷诺定受体(RyR) [ 5 ]。它们的特点是可以被IP3 或钙离子直接激活,而释放内钙。虽然内质网中的钙浓度并不很高,但由于它体积庞大,延续于整个胞浆内,所以钙释放造成的钙升高要比钙流入对某些细胞功能,如肌细胞收缩的贡献更大。细胞除了具有上述各种升高钙的途径,其本身也有很多降钙的手段。钙离子离开胞浆而恢复静息水平主要依靠膜系统上的钙主动转运系统,即钙泵[ 5 ] 。脂膜上的钙泵(p las2malmembrane Ca2 + 2ATPase, PMCA)消耗一个ATP可以逆着浓度梯度泵出122个钙离子。内质网线粒体钙泵,与PMCA相似,也可以逆着浓度梯度将胞浆钙收藏回细胞器。此外,质膜上还有Na + /Ca2 +交换体,以不耗能的方式转运进3个Na +而转运出1个Ca2 + 。综上所述,细胞膜系统上有各种各样的膜蛋白,可以保证钙离子既发挥相应的生理功能,又维持一定的内稳态平衡。维持此平衡的任何一个蛋白质突变或功能异常,都会导致严重的病症。RyR在骨骼肌细胞中的功能异常会导致恶性体温升高而在心肌中表达下调,可导致心力衰竭; IP3R在神经组织的自发突变会导致Alzheimer病;毛细胞质膜上钙泵的突变导致耳聋[ 5 ] 。既然这些蛋白质的功能如此重要,利用钙离子测定和成像技术对其进行研究和监控,不仅可以揭示其发挥生理作用的机制而且可以阐明某些疾病的发病机理。本文对钙离子测定和成像技术的基本原理从指示剂的选择、负载、注意事项以及光学系统的发展几个方面加以综述。1. 　钙指示剂钙离子不可视。进行钙测定必须借助外界的某种可视化物质作为它的标识物,这就是钙离子指示剂。钙指示剂都是荧光物质,能够捕捉钙,与钙结合后发生荧光强度或波谱性质的变化。它的发展大致经历了三个阶段:生物发光蛋白,化学荧光指示剂和荧光蛋白指示剂。1. 1　生物发光蛋白生物发光蛋白是上个世纪60年代从水母体内陆续发现的钙结合型发光蛋白,包括aequorin、obelin、mitrocomin、clytin等[ 6 ]。Aequorin,即水母素,是应用最为广泛的生物发光蛋白。它是由分子量为22 kDa的脱辅基发光蛋白, coelentera2zine发光团和氧分子组成的复合体[ 7 ]。一个复合体可以结合3个钙离子。钙离子的结合可以释放氧分子,氧化coelen2terazine而发出波长465 nm的蓝色荧光。Aequorin的这种发光反应的钙有效浓度范围在0. 1μmol/L～0. 1 mmol/L之间,可以用来测量大部分的细胞内钙事件。水母素用作钙指示剂具有如下优缺点。首先,它是钙结合型蛋白复合体,钙离子结合导致发光,不需要荧光激发系统,对设备的要求低,同时,也不会因光照而产生细胞毒等副作用。它的缺点是不能通透细胞膜,需要用微注射或转化表达的方式来负载细胞,对实验者的技术要求较高。另外,它的量子效率低,对指示剂的浓度要求大,同时也需要灵敏的光监测系统[ 8 ] 。正是由于以上各点的限制,用生物发光蛋白来作钙测定的研究已不是主流。但通过基因工程手段改建水母素,将其和编码各种细胞器前驱序列的基因相连,制成重组水母蛋白来测量细胞器内的钙信号,则是目前生物发光蛋白的一个非常有前途的应用所在[ 8 ]。1. 2　化学荧光指示剂化学荧光指示剂是由Tsien和他的同事于上世纪80年表1　常见的化学荧光钙指示剂各项参数指示剂　　　吸收波长nmCa2 + 2free　Ca2 + 2bond　发射波长nmCa2 + 2free　Ca2 + 2bond　KdFmax /FminRmax /Rmin注　释　　　　　　　Quin 2 353 333 495 495 60 nM 5 - 8 钙螯合效应突出Indo 1 346 330 475 401 230 nM 20 - 80 双波长发射(405 /485)Fura 2 363 335 512 505 224 nM 13 - 25 双波长激发(340 /380)Indo 1FF 346 330 475 401 33 mM 5 - 10. 6 低亲和力Fura 2FF 360 335 505 505 35 mM 低亲和力Indo PE3 346 330 475 408 260 nM 抗渗漏Fura PE3 364 335 508 500 250 nM 18 抗渗漏Benzothiaza21 368 325 470 470 660 nM 双波长激发(340 /380) ,中等亲和力Benzothiaza22 368 325 470 470 1. 4 mM 双波长激发(340 /380) ,中等亲和力BTC 464 401 533 529 7 mM 双波长激发400 /480Fluo 3 503 506 526 526 400 nM 40 - 100 最常用的可见光波长染料Fluo 3FF 506 515 526 326 41 mM 低亲和力Fluo LR 506 506 525 525 500 nM 抗渗漏Calcium green21 506 506 531 531 190 nM 14 量子产率高Calcium green22 506 503 536 536 550 nM 602100 量子产率高,较calcium green21发光强度大Calcium green25N 506 506 532 532 14 mM 38 低亲和力Calcium orange 549 549 575 576 185 nM 3Calcium crimson 590 589 615 615 185 nM 2. 5Oregon green 494 494 523 523 170 nM 14 对pH值敏感BAPTA 48821Fura red 472 436 657 637 140 nM 5212 双波长激发(420 /480) ,与Fluo 3, Calcium green可以进行双发射波长比值测定Rhod 2 556 553 576 576 1 mM 142100 易于聚集于线粒体中X2rhod 1 576 580 none 602 700 nM 易于聚集于线粒体中Rhod 5N 547 549 none 576 320 mM 易于聚集于线粒体中,低亲和力X2rhod 5N 576 580 none 580 350 mM 易于聚集于线粒体中,低亲和力注:部分摘自Takahashi A et al [ 23 ]456 神经解剖学杂志　　第22卷　　第4期　　2006年7月代研发出来的一系列化合物[ 9 - 11 ] ,目前已有100多种,表1列出了一些常用的钙指示剂。它们大都是钙螯合剂EGTA或BAPTA的类似物,是在其分子结构的基础上加上了一些苯环结构而制成的,如Quin 2、Indo 1和Fura 2等。这类指示剂种类繁多,有不同的分类方法。(1)根据测光原理和所得数据的性质,可分为比值型和非比值型(单波长型) 。除Indo1、Fura 2、Benzothiaza和BTC等少数系列外,化学荧光指示剂大都为非比值型染料。( 2) 根据激发光波长可以分为紫外光型和可见光型。前者包括Quin 2、Indo 1、Fura 2等,数目较少;后者数目多,包括Fluo 3、钙绿和Rhod 2等。(3) 根据发射波长可以分为蓝光型,如Indo 1;绿光型,如Fura 2、Fluo 3、钙绿;黄/橙光型,如calcium orange, Rhod 2;红光型,如钙深红, Fura red等。1. 2. 1　化学荧光指示剂的参数　　化学荧光指示剂的各项参数如表1所示。　　存在形式　商品化的指示剂有三种形式:酸化,酯化和葡聚糖化。选择购买指示剂时要充分考虑实验目的、条件以及染料的负载方式,选择合适的商品化形式。其中,酸化和葡聚糖化指示剂不能自由通透细胞膜,酯化指示剂可以自由通透细胞膜,适合于培养细胞或急性分离的大批量细胞钙测定。光谱特性　每一种染料都有四个光谱数值,即自由态和钙结合态的激发波长和发射波长。大多数染料在钙游离和钙结合状态下的光谱性质不发生变化,而只发生发射光强度的变化,这是大多数非比值型染料的测光原理。据报道, Fluo3在结合钙离子后荧光强度可以增强40～200倍[ 12 ]。但In2do 1和Fura 2系列等比值型染料不同,其中, Indo 1结合钙后的发射光峰从475 nm变为401 nm, 401 nm与475 nm的光强之比可以作为钙信号的相对值,对于Fura 2,它的激发波峰在结合钙后从363 nm变为335 nm,而发射波长无明显变化,因此,采用双波长两次相继激发,两次捕光的方式就可以得到染料分别在钙结合态和游离态分别被激发时的发射光强度,二者之比即为钙信号的相对值。解离常数　染料的另一个重要参数是Kd值,即解离常数,它是选择染料时的另一个关键因素。符合[ dye ] +[Ca2 + ] = [ dye·Ca2 + ]可逆方程,其计算公式为:Kd = [ dye ] ×[Ca2 + ] / [ dye·Ca2 + ]　　染料的Kd值不是一成不变的,可以随具体的实验环境而上下波动。Kd值越大,染料对钙的亲和力越低; Kd值越小,对钙的亲和力越大。一般认为待测钙信号的变化范围在Kd值上下浮动时,染料的测钙性能发挥最好。动力域　染料的动力域为染料的最大荧光强度与最小荧光强度(非比值型)或最大比值与最小比值(比值型)之比,也即染料在无钙和钙饱和状态下的强度比或比值比。该值越大,染料的信号可变度就越大,有利于数据的检出。在这一点上, Indo 1、Fura 2和Fluo 3的动力域较大,这也是它们广为应用的一个原因。1. 2. 2　比值型和非比值型染料　　在众多的化学荧光染料中,比值型染料数目较少,但应用广泛。图1为两种常用的比值型染料Indo 1 (图1A) 和Fura 2 (图1B) 在不同钙浓度下的发射光谱和激发光谱曲线。对于Indo 1来说,随着钙离子浓度的升高,钙结合态染料浓度上升,其在405 nm左右的发射光波峰增强,在485 nm 左右的发射光波峰降低。故F405 /F485可以作为钙变化的代表值。对于Fura 2来说,随着钙浓度的上升,胞内结合态染料浓度升高,其在340 nm 左右的吸收峰增强,而游离态染料吸收峰( 380 nm 左右)减弱。强吸收导致强发射。故染料经340 nm激发后的发射光(510nm)强度增强,而在380 nm 激发后的发射光( 510 nm)强度减弱。因此, Fura 2 测钙所得数据为F340 /F380。需要指出的是,此值和Indo 1的F405 / F485代表的含义不同。前者为340nm和380 nm 波长紫外激发时的发射光强度之比;后者为405 nm和485 nm 的发射光强度之比。Fig. 1 　Fluorescence emission and excitation spectrum of Indo 1(A) and Fura 2 (B) with different free Ca2 + concentration( changed from the speech of Miyawaki on the tgcourse of digital imaging technique in Shanghai, Oct 20 -22, 2004) .史　娟等: 细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用457　　比值测定型染料是应用极为广泛的染料,它的数据形式采取比例的方式,不受实验设备、光路组成、染料的负载浓度、细胞类型和实验者个体操作等的限制。数据间具有很高的可比性。另外,在测钙的过程中,活细胞在液流中难免会有动态变化,如细胞的厚薄变化、染料在胞内重新分布变化等。比值测量可以消除这些因素带来的影响,使测量结果具有相当的准确性。最后,染料尤其是酯质染料在胞内的浓度会随时间的变化出现波动(具体原因见下) ,比值型染料可以消除此波动,忠实地反映细胞内钙信号的变化。正是由于以上无可比拟的优点,比值型染料尤其是Fura 2成为目前应用最为广泛的化学荧光指示剂。但它也有自己的缺点,表现在紫外激发,会导致组织产生一定的自发荧光,还会损害细胞的能量代谢系统,而且不适合于大多数的激光共聚焦( confo2cal laser scanningmicroscopy, CLSM)测钙系统等。这些不足在一定程度上限制了染料的应用。和比值型染料不同,非比值型染料的特点是染料在结合钙后发生发射光强度的变化。该类染料多为可见光激发,自发荧光小,对细胞的损害较小而且适用于CLSM 系统。但其数据直接为荧光强度值,易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。因此,目前很多学者倾向于用△F /F这种“假比值”来衡量非比值型染料钙信号变化[ 13 - 15 ]。其计算公式为:△F /F = ( F2Fbase ) / ( Fbase2B)其中, F 是实际检测值, Fbase是刺激前胞内染料的荧光强度,B是细胞周围的背景噪音。这种“假比值”可以在一定程度量化非比值型染料的测钙结果,但其准确性、抗干扰性远不能和比值型染料相比。最近出现了将两种非比值型染料如Fluo 3 和Fura Red共同孵育细胞进行测钙的研究[ 16, 17 ]。随着钙离子浓度的升高,当用488 nm的激发光激发染料时, Fluo 3 和Fura Red 会发生不同的变化:前者荧光强度增加,后者荧光强度减弱。因此, FFluo 3 /FFura red便可以用作比值来衡量钙信号变化而达到比值测量的目的。但这一方法也有缺陷,即Fluo 3和Fura red 毕竟分属不同的染料个体,它们在胞内可能会随时间产生的不同的变化倾向,导致其比值变化不似单一Fura 2 或Indo 1忠实可靠。另外, Fura red在488 nm 激发时的量子产率很低,荧光强度很弱,因此,往往要用比Fluo 3高出2～3倍的浓度孵育细胞才能得到好的信噪比。但由于其属于高亲和力染料,孵育浓度过高,会导致高的钙缓冲效应。1. 2. 3　选择化学荧光指示剂的标准　　基于以上的各点,在选择化学荧光指示剂时应考虑以下几个因素。光源的光谱性质　由于指示剂皆为荧光物质,需要激发光,所以,光源所能提供的光谱范围应包含染料的激发波长。这一点对汞灯和氙灯光源来说一般不存在问题,因为它们的光谱在经过合适的滤光后都能满足紫外光和可见光范围内的激发要求。但对于CLSM系统需要特别注意,因为目前所常用的氩或氩氪激光器所提供的波长一般不包括紫外波段的波长。染料的商品化形式　实验方法和目的直接决定所要选择的染料的化学形式,如单纯对培养细胞或对急性分离的成批细胞进行测钙,可以考虑酯质染料。而和膜片钳记录相结合,则可以考虑染料的酸性形式。酸式染料分子量小,易于通过膜片尖端扩散进细胞,且不容易发生染料的渗漏和区室化(见4. 4) 。对一些较大的细胞如卵母细胞进行测钙,如果操作者具备微注射技术,可以考虑葡聚糖偶联的染料。这种染料直接注入细胞,可以精确控制染料的胞内浓度且不会发生渗漏现象。染料的钙亲和度　一般情况下胞浆钙的变化是人们测钙的主要目的。由于胞浆钙平均水平较低,可以选择解离常数较小的高亲和力染料,如Indo 1、Fura 2、Fluo 3,钙绿,钙黄和钙红等。而如测试者欲测量细胞器钙,则应该选择高Kd值的低亲和力染料如Indo 1FF、Fura 2FF、Fluo 3FF、Rhod 2、Rhod 5N等。一般待测钙变化符合0. 1 ×Kd < [ Ca2 + ] < 10×Kd条件时,测钙效果最好。染料的动力域　在以上各条件的基础上,选择动力域大的染料可以增强信噪比,有利于信号的检出。1. 3　荧光蛋白钙指示剂荧光蛋白钙指示剂是基于绿色荧光蛋白(GFP)基础上的钙指示剂。绿色荧光蛋白于1962 年发现于水母体内,1992年其编码基因被克隆[ 18 ]。随后,利用分子生物学突变技术,蓝色(BFP) 、青色(CFP) 、黄色(YFP) 、远红外荧光蛋白(DsRed) 相继出现,掀开了生物学领域的“绿色革命”。荧光蛋白的一个直接应用就是研究生物大分子之间相互作用或大分子本身构象变化的荧光共振能量转移( fluores2cence resonance energy transfer, FRET) 技术。其基本原理是:在一个大分子上偶联上荧光供体基因如BFP,在与其作用的另一个大分子上偶联上受体荧光蛋白如GFP。当两个分子没有结合时,在用BFP的激发波去激发时,只有BFP可以发出蓝色荧光而GFP只发出很微弱的荧光或不发光。但当两个分子结合而且相互作用发生构象变化时,由于两个荧光基团间的空间距离缩小,供体的发射的能量便可以转移至受体,而使受体被激发发出自己的荧光。因此,供体的荧光减弱而受体的荧光增强。这样, Faccep tor /Fdonor就可以用来检测两个分子间是否发生了相互作用。目前应用FRET的荧光蛋白配对有以下三对: BFP 2 GFP; CFP 2 YFP; GFP 2DsRed。配对的有两个基本原则: (1)供体的激发波长和受体的激发波长不能重叠过多,否则会发生交叉激发; (2)供体的发射波长需和受体的激发波长有相当的重叠,否则能量转移不能进行。基于FRET 原理,Miyawaki 于1997 年研制出了利用FRET测钙的分子系统,命名为cameleon[ 19 ]。Cameleon是用分生手段构建的蛋白质复合体。它包括四个部分:钙调蛋白(CaM) ,是最为普遍的细胞内钙受体,可以介导许多钙的生物学效应;M13,是肌球蛋白轻链激酶的26 个氨基酸序列,可以和CaM 结合; 荧光供体BFP 或CFP 和受体GFP 或YFP。以CFP cameleon 为例,如Fig. 2 所示, CaM 的一端连接CFP, 另一端通过M13连接YFP。CaM的分子呈哑铃形,两端的“EF手”结构可以分别结合两个钙离子。一旦和钙离458 神经解剖学杂志　　第22卷　　第4期　　2006年7月Fig. 2　Schematic illustration of cameleon molecular structure and itsCa2 + - imaging p rincip le ( changed from Miyawaki et al19 )子结合, CaM会发生构象变化,其两端的“球形结构”向中间靠拢,以M13 为纽带, YFP和CFP间的距离缩小而发生荧光共振能量转移。这样,当用440 nm波长的蓝光激发时, CFP480 nm 的青色荧光减弱而YFP 530 nm 的黄色荧光增强,利用FYFP / FCFP便可以间接衡量细胞内钙信号的变化。荧光蛋白指示剂与发光蛋白和化学染料相比有其优越性。与发光蛋白相比,属于比值测定,且荧光信号强,对光子监测系统要求低。与化学荧光剂比较,可以微注射或异源表达测钙,染料的靶向定位好,可以测量特定的细胞器内的钙信号,而且无渗漏现象。但它也有缺点,如信号的动力域窄(Rmax /Rmin < 2) ,对pH值变化敏感等[ 20, 21 ]。2. 　钙指示剂的负载指示剂只有成功地进入细胞,才有可能对钙信号进行监控。负载指示剂的方法很多,在此介绍三种常用的方法。2. 1　酯质载入商品化的酯质染料带有乙酰甲酯(AM)尾,具有疏水性可以被动地扩散至细胞内。AM染料对钙离子没有亲和性,经细胞内的酯酶水解脱掉AM 尾后才可以发挥指示剂的作用。水解后的酸式染料为亲水性,不能扩散出细胞膜。所以,染料最终可以不可逆地在细胞内达到很高的水平。酯质染料的孵育条件因染料种类,细胞类型而有所不同。以Fura2 AM为例,对于培养细胞和急性分离的细胞,一般1 ～5μmol/L浓度室温孵育30 min,可以达到较好的负载效果。在孵育的过程中,可以使用p luronic F2127 或cremophor EL等助扩散剂,可以帮助疏水性的酯质染料均匀地扩散在细胞外液中,提高负载效果[ 22 ]。脂质载入的优点是操作简便易行,不需要专门的技术要求,而且能在较短的时间内获得很高的染料浓度。缺点是受胞内酯酶的影响很大。如果酯酶活性低,则水解率低,染料的终浓度就不会太高。而且,未能及时水解的染料会在测量的过程中扩散,造成染料渗漏和区室化。2. 2　微注射法该法针对膜不可通透性的染料,如酸式染料、葡聚糖偶联染料以及蛋白质染料。将染料溶解在配制的细胞内液中(内液成分尽可能与胞浆成分接近) ,灌注至玻璃微管,徐徐注入细胞内。这种方法直接将染料注入细胞内,精确性高。但对操作者的技术要求高,对细胞的损伤大,而且仅限于大型细胞。不适合于成批细胞的钙测定。2. 3　膜片尖端扩散法该法是将电生理膜片钳记录和钙离子测定相结合时所用的负载法。这种方法可以将电信号和钙信号相结合,对于阐明某些受体、离子通道的生理功能非常具有说服力。将染料溶在电极内液中,染料通过低阻抗玻璃微电极尖端和细胞形成的传统全细胞封接口被动扩散进入细胞。利用这种方法负载染料,可以针对任何一种染料形式。但酸式染料分子量小,扩散快,效果最好。扩散进入的染料只存留于细胞浆,不存在渗漏和区室化问题。但染料本身的扩散受很多条件如细胞大小、电极尖端的大小、输入阻抗、系统阻力、内液粘度和时间等因素的影响。大口径低阻抗(1～2 MΩ,灌注正常电极内液) ,系统阻力在10 MΩ以下的小细胞的扩散相对较快, 5～10 min 即可达到较好的扩散效果,而小口径高阻抗、高系统阻力、大细胞则需要较长的时间。除了以上三种常用的负载法,染料的负载还有低钙法、ATP法、低渗透休克法、重力法、刮载法和脂转运法等[ 23 ]。这些方法只是针对特定的细胞或组织、实验目的和条件时所用的特定方法,不具有普遍性,不再赘述。3. 　钙离子浓度的校正方法无论是比值型还是非比值型染料,测钙所得到的直接结果都不是钙离子浓度,而是荧光强度值或比值。这就需要对此测定值进行钙离子浓度的换算和校正。校正公式为:[Ca2 + ] i = Kd ×( F - Fmin ) / ( Fmax - F) (非比值测量法)[Ca2 + ] i =β ×Kd ×(R - Rmin ) / (Rmax - R) (比值测量法)其中, F 和R 分别为测量所得的荧光强度值和比值, Fmin和Rmin、Fmax和Rmax分别是无钙和钙饱和时的强度值和比值。Kd 是解离常数,β为比值中分母方波长在无钙和钙饱和时的荧光强度之比,如对于Fura 2 来说,β = F380 min/F 380 max[ 24 ]。校正过程的关键是要制作校正曲线得到Kd、β、Fmin或Rmin、Fmax或Rmax。EGTA2Ca2 +缓冲液是最常用的校正液。校正液可以商品化购买也可以自己制作。如A 液可以为10mmol/L EGTA, B液为10 mmol/L Ca2 + 2EGTA。两种缓冲液的其他组分要完全一样。将A液、B 液按不同比例混合可以得到一系列不同浓度的游离Ca2 +溶液。由于EGTA对Ca2 +的解离常数已知,故Ca2 +缓冲液的Ca2 +浓度可以计算得出(商品化的校正液都给出了此值) 。将此缓冲液系列作为待测物利用指示剂进行测钙,取得F、R值、Fmin & Rmin和Fmax &Rmax值,而后按上述公式进行回归拟合。所得到的β和Kd值即可用来校正测钙所得到的F, R 值。虽然利用以上离体的方法可以对钙离子浓度进行定标,史　娟等: 细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用459但指示剂的性质在细胞外和细胞内往往有很大的不同,如受胞内温度、pH和离子强度等的影响。因此,最精确的校正方法就是在特定的细胞内进行在体校正。在体校正的常用方法就是利用一些钙离子通道开放剂如ionomycin、4 2溴2A 223187 使细胞内钙浓度可以和细胞外达到平衡[ 25, 26 ]。其具体的方法也是要制作或购买含有不同游离钙浓度的系列缓冲液。其中含有低浓度的ionomycin 。这样细胞外的游离钙就可以在ionomycin的帮助下进入细胞内,使细胞内的游离钙浓度已知。而后按照上述方法,可以得到染料的各种参数值而对某一具体的测定进行校正。除此而外,在体校正还可以用微注射缓冲液的方法来进行,但这种方法会改变细胞内环境而产生误差。钙离子浓度的校正是指示剂测钙的一个很重要的方面,但目前很多学者在用比值法测钙时已倾向于不进行定标而直接使用测量值进行结果的描述,也已为大家所接受。这是比值测量法的又一个优点。4. 　钙离子测定的潜在问题和解决方法钙离子测定虽然操作过程简单,技术难度低,但在对结果的衡量和评估时有很多潜在的问题点需要考虑和分析。4. 1　细胞内缓冲效应所有的钙指示剂都是钙离子的螯合物。钙离子与之结合虽然会改变指示剂的发光强度或波谱性质,但反过来指示剂也会对钙离子的微弱变化进行缓冲。这一点在高亲和力染料如Quin 2、Fura 2、钙绿等尤为明显[ 27 ]。Quin 2现在甚至经常被用来衡量细胞内的钙缓冲力[ 28, 29 ]。因此在利用这些高亲和力染料进行测钙时,合适的浓度、孵育温度和时间控制很关键。切忌孵育浓度过高和时间过长造成染料的高浓度聚集。4. 2　自发荧光很多的细胞内组分可以发出自发荧光,如一些结缔组织成分和胶原纤维等。但它们的影响一般不很大。细胞内最严重的自发荧光干扰来自腺嘌呤核苷(NADH, NADP)和黄素腺嘌呤核苷( FMN, FAD) 。NADP被还原生成NADH,其自发荧光增强,而FMN 被氧化生成FAD 发出自发荧光[ 30, 31 ]。NADH 的激发波长和发射波长分别是340 nm 和440～470nm, FAD 的激发和发射波长分别是450 nm和530～550 nm。因此,对于一些紫外激发的短波长指示剂如Fura 2 和Indo 1,估计自发荧光对实际测量结果的污染状况尤为关键。克服这一问题的一个方法就是在指示剂负载前记录待测细胞的背景荧光,而后从实际测量结果中减去此背景值。使用一些长波长指示剂也可避免自发荧光污染。4. 3　细胞毒和染料的褪色指示剂属于外来物质,长时间的滞留对细胞多少具有毒害作用。这主要表现在对细胞呼吸和增殖的抑制作用。有报道表明罗丹明2123 可以滞留在癌细胞和心肌细胞的线粒体内影响其氧化还原反应的进行,而Fluo 3 负载的海胆卵细胞不能进行正常的发育[ 32, 33 ]。另外,长时程的光照可以导致染料的褪色,即指示剂本身发生某种变化而变得对激发光或对钙离子不敏感。染料褪色的直接影响就是信号强度随时程的延长而基线下滑[ 34, 35 ]。这在用单波长染料测钙时表现得尤为明显。比值测定在一定程度上可以避免这一负面影响。因此,必须摸索既可以获得良好的信噪比又可以缩短光照时间的平衡点。克服染料褪色的另一个方法就是在灌流液中加入抗氧化剂或在测定台上充盈氮气以达到隔绝氧气的作用[ 35 ]。4. 4　染料的区室化区室化是利用化学荧光指示剂测钙时的一个非常普遍和重要的问题。它是指染料被某些细胞器捕获而没有均匀地分布在胞浆中。由于细胞器中的钙信号变化和胞浆中有很大的不同,故染料的区室化可以影响最终的胞浆钙信号。区室化受负载条件、细胞类型和染料种类的影响。同一种染料在不同的细胞中可能会聚集到不同的细胞器中。利用洋地黄皂苷或Triton X2100 处理细胞增加膜的通透性,使胞浆内的染料外流就可以显示染料区室化的程度[ 36 ]。染料区室化可能由细胞器上阴离子转运系统介导,也可以因酯质染料在胞浆内不完全水解而被动扩散至细胞器内形成[ 37, 38 ]。另外,当胞浆内的酯酶活性低于细胞器内时,竞争的失败也可以导致染料的区室化[ 39 ]。由于染料的区室化都是由酶2蛋白质系统介导,属生化反应,对温度很敏感。因此,预防的一个措施就是降低孵育和测钙温度。4. 5　染料的渗漏染料可以从细胞内渗漏至细胞外。其机制和区室化相似,由质膜上的阴离子转运系统和染料的不完全水解造成。克服染料渗漏的有效方法包括: (1)选择电负性弱的染料,例如钙绿由于比Fura 2 多一个正电荷,其渗漏现象弱于Fura2; (2)选择抗渗漏型染料,如Fura PE3、Indo PE3、Fluo LR等。这些染料在母体染料的基础上加上了哌嗪环,后者在细胞内可以质子化达到抗渗漏的目的; (3)选择葡聚糖偶联的染料或通过膜片尖端源源不断地负载染料。5. 　钙测定光学系统的发展钙测定的发展除了伴随指示剂的发展外,光学系统的变迁也是一个重要方面。最初也是直到现在还广泛使用的是传统广视野倒置显微镜监测系统,它的特点是工作距离长,能够在载物台上加载各种各样的辅助设备,并且可以和电生理记录相结合。它的缺点就是使用场光源,由于光散射,在所观察的视野内,样品上的每一点都同时被照射并成像,入射光可以照射到整个细胞,细胞的整个发射光都可以通过物镜而成像,使图像的清晰度和分辨率降低。这种测钙方式适合于大强度、广范围的钙信号,而不太适合于低强度、局域性定位的钙信号。如前所述,胞内钙信号有严密的调控机制。许多在体细胞中的钙事件都是小范围、局域化的,因此,传统的监测系统难以对这种精细的钙信号进行分析和研究。激光共聚焦显微镜的出现给钙测定领域带来了新的契机。它采用激光束作光源,激光束通过照明针孔和物镜以聚焦的方式对标本进行层层扫描而收集钙信号,在此过程中,焦平面以外的散射光线不能通过探测针孔而使测得的钙信460 神经解剖学杂志　　第22卷　　第4期　　2006年7月号具有很强的空间分辨率。这一优点使微弱的局域性钙信号测量成为可能。但大多数的CLSM 系统使用氩或氩氪激光作为光源,这两种激光的激发波长范围目前比较局限,不适合于短波长指示剂的使用,而且由于层层扫描, CLSM测钙的时间分辨率较低。最近,双光子激发激光扫描镜术( TPLSM) 也被应用于钙测定系统中。TPLSM可以同时发射两个光子照射荧光标本,由于波长和能量成反比, TPLSM 可以用原激发波长2倍的激光激发荧光染料。这种长波长激发对于减轻染料的细胞毒,细胞自发荧光和保持标本的活性很有帮助。另外,TPLSM与CLSM具有相似的空间分辨率。但它的原理是,由于被两个光子同时激发的几率与光子密度的平方成反比,远离聚焦平面的标本不能被双光子激发而导致高的空间分辨率。结　语　　在过去的二、三十年中,钙测定无论是从指示剂的选择还是光学监测系统方面都获得了快速的发展。现在,细胞内钙离子测定已经成为一项研究细胞分子功能的常规技术。但尽管如此,如何针对特定的细胞钙事件选择合适的指示剂和成像元件仍然是测钙的首要任务。在指示剂方面,虽然水母发光蛋白在信号强度、时间分辨率及信号监测系统上处于劣势,但它无需荧光激发系统;化学荧光指示剂虽然种类繁多,性质多样,适合于各个成像系统,应用最为广泛,但它有自身难以克服的缺陷如缓冲力、区室化和需要荧光激发等;而利用FRET原理和分生手段构建的cameleon 测钙系统虽然具有敏感,准确等优点,但它需要复杂的表达系统而且对酸碱度高度敏感。钙测定研究在光学监测方面,从传统的广视野显微镜术,到激光共聚焦显微镜术到双光子显微镜术,钙信号的采集和摄取正朝着局域化、高的时空分辨率的方向发展。这些发展将有助于揭开钙离子生理和病理作用的奥秘,为人类认识自身和克服疾病提供技术支持。另外,最近,一种高通量钙离子测定术正悄然兴起,它对样本实施微板多孔分析,同时可以监测96、384 乃至1536 个不同的钙信号,大大地缩短了测量时间,提高了工作效率[ 40 ]。该技术对于需要同时检测多种钙信号的用户,尤其是对于药物公司在初期阶段新药的筛选和开发无疑是一个福音。
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