实时荧光定量pcr之前要不要做个内参基因的筛选_百度知道
实时荧光定量pcr之前要不要做个内参基因的筛选
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通常不需要，因为我们已经很清楚每个内参的属性。但还需要看你用定量做什么，比如说做组织表达，或者诱导表达，我们都会偏好于不同的内参。
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绝对定量PCR的内参问题（有奖征集）
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这个帖子发布于9年零254天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，在园子里搜索了很久，关于绝对定量是否需要内参的问题，是大家都很疑惑的问题。也有不少这方面的高手，对提问者的疑虑起到了一定的解疑的作用，但是没有一个系统的很实用的帖子。我想能不能哪位能集关于绝对定量实验设计方法、操作、结果分析于一帖的详尽描述。
如果确实需要内参基因的标准曲线，那么在目的基因及内参基因都做出来的情况下，目的基因的拷贝数应如何界定？即结果如何分析的问题。我现在是两条标准曲线都做出来了，但是不知道如何分析。
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呵呵，等待热线战友整理。先简单说一下个人观点，绝对定量PCR是不需要内参。而且我觉得，似乎绝对定量，主要只在用于了解体液中核酸（病毒等）得浓度时才有用，而对基因表达的分析好像没太大意义。
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呵呵，等待热线战友整理。先简单说一下个人观点，绝对定量PCR是不需要内参。而且我觉得，似乎绝对定量，主要只在用于了解体液中核酸（病毒等）得浓度时才有用，而对基因表达的分析好像没太大意义。
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绝对定量不需要用内参但是一定要有标准曲线我不久前为了看我的内参基因是否稳定，作了绝对定量PCR，如果大家觉得有用的话，我可以开个帖子写出来，大家讨论讨论。
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植物实时荧光定量PCR内参基因的选择
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内参基因在实时定量PCR中应用的研究进展
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植物实时荧光定量PCR内参基因的选择
Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ中国农业科技导报，２００９，１ｌ（６）：３０―３６ Ａ加ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ明ｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ植物实时荧光定量ＰＣＲ内参基因的选择胡瑞波，范成明，傅永福（中国农业科学院作物科学研究所，国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京１０００８１） 摘 要：实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌ―ｔｉｍｅｑｕａｔｌｔｉｔａｔｉｖｅＤｅｖｅｒｓｅｔｒ粕ｓｃｒｉｐｌｉｏｎ ＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点，已被广泛应用于基因的表达分析。常规ｑＲＴ―ＰｃＲ采用相对定量进行分析，其关键步骤 是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。持家基因被广泛用作内参基因，但在所有生理条件下均稳 定表达的理想内参基凶并不存在。大多数传统内参基因已不能满足ｑＲＴ－ＰｃＲ准确定量的要求。基于基因芯 片表达数据和ＥｓＴ数据库并结合ｑＲＴ―ＰｃＲ，可以筛选稳定性好的新的内参基因。简要综述ｒ植物ｑＲＴ―ＰｃＲ 内参基冈的研究进展，并就内参基冈的选择中应注意的问题进行了探讨。关键词：实时荧光定量ＲＴ―ＰＣＲ；内参基因；ｇｅＮｏ珊；基因表达中图分类号：Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８旬８“（２００９）０６ＪＤ０３０旬７Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅＶｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ（ｑＲＴ―ＰＣＲ）Ｒｅ８０ｕｒｃｅ锄ｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＩＩｎｐｒｏｖｅｍｅｍ，ＨＵ Ｒｕｉ－ｂｏ，ＦＡＮ Ｃｈｅｎｇ―ｍｉｎｇ，ＦＵ Ｙｏｎｇ―ｆｕ （ＩｎｓｔｉｔＩＩｔｅｏｆＣｒ；０ｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ８ｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｒｎｙ ０ｆＫｅｙＦ∽ｉｌｉｔｙｏｆＣ∞ｐ ＧｅｎｅＡｇＩｉｃｕｌ劬ｆａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ８，Ｂｅｉｊｉｎｇ ｌｏ００８ｌ，Ｃｈｉｎａ）ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｌｙ ａｎｄＡｂｓｌ阳ｃｔ：Ｒｅａｌ一￡ｉｍｅ ｈ培ｈ?山．ｏｕｇｌｌｐｕｔｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓｑｕａｎ￡ｉ￡ａｔｊｖｅＲＴ―ＰＣＲ（ｑＲＴ―ＰｃＲ）￡ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，访ｔｈ ｑｕ册ｔｉｔａｔｉｖｅ ａｃｃｕｒａｃｙ，ｈｊｇｌｌｉｎ ｇｅｎｅｏｒｃｈ煳ｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｈ船ｂｅｅｎ ｗｉｄｅＩｙ ｕｓｅｄ 明ａｌｙｓｉｓ，ｑＲＴ―ｐＣＲ ｄ如ｍｕｓｔ ｂｅ ｎｏｍａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ卸ａｌｙｓｉｓ．ｐｒｏｐｅｒ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅＢａｓｅｄｏｎｔｈｅ ｒｅＩａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｈｏｕｓｅ―ｏｎｅｍｏｒｅｉｎｔｅｍａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ．Ｂｕｔｎｏｔａｃｕｓｔｏｍａｒｉｌｙ ｕｓｅｄ船ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｓｉｎｇｌｅｇｅｎｅｃ肌ａｃｔ酗ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｓｏ陆． Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａＩ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｕｎａｂＩｅ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｎｏ珊ａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｑＲＴ―ＰＣＲ． Ｂ髂ｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒｅｍｅｎｄｏｕｓ ｇｅｎｅ?ｃｈｉｐ ｅｘｐｒｅｓ￥ｉｏｎ ｄａｔａ ａｎｄ ｐｕｂｌｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ＥＳＴ ｄａｔａ，ｎｅｗｒｅｆｅ咖ｃｅｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ８ｕｐｅｒｉｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲｗａｓ８ｔａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｑＲＴ―ＰＣＲ．ｔｏ１’Ｉｌｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｌｌｔ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．ｒｅｖｉｅｗｅｄａｎｄ ａｓｐｅｃｔｓｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｉｎ ｆｕｔｕｒｅｓｅＩｅｃｔｉ帆ｗｅ陀ａｌｓｏＫｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ―ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒ８ｅｔｒａｍｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ；ｒｅｆ每ｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ；ｇｅＮｏ珊；ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ实时荧光定量ＲＴ―ＰＣＲ（ｒｅａｌ―ｔｉｍｅｒｅｖｅｒｓｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｎ８ｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）是在传统进行校正和标准化‘３，４１。ｑＲＴ．ＰＣＲ结果的准确性 在很大程度上取决于内参基冈的选择。本文就植 物ｑＲＴ―ＰＣＲ内参基因的研究进展作简要综述。１ＰＣＲ技术基础上发展起来的一种新的核酸定量 技术，具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量 等特点，已被广泛应用于基因的表达分析¨，２ Ｊ。 在ｑＲＴ―ＰｃＲ中，为了去除不同样本在ＲＮＡ产量、 质量和反转录效率上可能存在的差别而获得目标 基因特异性表达的真正差异，通常选择内参基因内参基因的选择标准 理想的内参基因应满足以下条件：①在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达‘４１；②表达收稿日期：２００９ｍ３－２５；修回日期：２００９一ｌＯ－２８ 基金项目：国家８６３计划项日（２００６ＡＡｌＯＡｌｌｌ，２００７ＡＡｌＯｚｌｌ９）；国家转基因重大专项（２００８ｚｘ０８０９ＪＤ０１）；“十一五”国家科技支撑计划项目（２００７ＢＡＤ５９肋２）资助。 作者简介：胡瑞波，博十研究生。研究方向为植物发育分子生物学。Ｅ．咖ｉｌ：ｍｙｈｕ＠ｙａＩＩｏｏ．ｃｎ。通讯作者：傅永福，研究员，主要研究方向为植物发育分子生物学。１＇ｅｌ：０１０．８２１０５８６７；Ｅ―ｍｉｌ：胁１９ｃｎ＠１６３．ｃｍ万方数据 　６期胡瑞波等：植物实时荧光定最ＰｃＲ内参基因的选择３ｌ不受细胞周期调控，不受诸如温度、光照、生物或 非牛物胁迫等内源和外源信号的影响㈣；③其稳定的表达水平与目标基因表达水平相近‘６｜。但 迄今为止，尚未发现这样的理想内参基因。用ｏｌ培ｏ ｄＴ，这可能会使二者的反转录效率不同而 影响基囚表达水平的可比性；其三，不同生理状态 的组织器官中ｒＲＮＡ与ｍＲＮＡ的比例并不是恒定 不变的，ｍＲＮＡ通常占总ＲＮＡ的５％一１０％【ｌ３｜。虽然ｒＲＮＡ合成的调节独立于ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ的转２传统内参基因的缺陷在植物ｑＲＴ―ＰＣＲ研究中用的最多的内参基 因通常是持家基因（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ），主要包 括１８Ｓ ｒＲＮＡ，３一磷酸甘油醛脱氢酶基因（甜只录易受到各种生物因素和药物的影响，其表达水 平也并不是恒定不变的，在有丝分裂期间，１８ＳｒＲＮＡ明显减少或停止表达。再者，ＲＮＡ的部分降解对１８ｓ ｒＲＮＡ的表达水平的影响似乎要小于对ｍＲＮＡ的影响¨４｜。 Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ等【１列分析了拟南芥１０个传统内参 基因（ＡＣ珐，ＡＣ刀，ＡＣ飓，ＡＰ＂，ｅ几ａ，ｅ，群ａ，ＴＵＢ２，ＴＵＢ６，ＴＵＢ９，ＵＢＱ４，ＵＢＱ５，ＵＢＱｌｏ，ＤⅣ），转录延伸因子基因（朋－Ｊ仅），多聚泛素酶基因（∞ｐ），肌动蛋白摹因（Ａｃｒ），０【微管蛋白基因和Ｂ微管蛋白基因（删，形８）等＂’４’６’７Ｉ。在前基因组时代，人们之所以选择持家基因作内参基 因是因为持家基因是牛物体维持生命活动所必需珊ＱＪＪ）在１４个不同组织器官中的表达稳定性，结果表明不同内参基因的稳定性存在显著差异，的细胞器骨架的基本组分（Ａｃｍ阴，刚曰等）或参与牛物体的基本生化代谢过程（ＧＡ肋日，ＥＦ．，ａ，蝴ｐ等），因此持家基因应该在所有的细胞和生理状态下都较稳定地表达。但是，最近一些研究表明，持家基因在不同细胞类型和不同生理状 态下的表达并不是恒定不变的¨。．９ Ｊ。这就使持 家基因作为ｑＲＴ―ＰｃＲ内参基因的功能受到挑战。ＡＪｐ＂和池∞的稳定性相对最好，而刑腼的稳定性最差。Ｋｉｍ等。叫分析了４个水稻内参基因（１８ｓｒＲＮＡ，甜ＰＤ日，ＡＣ丁，刚Ｂ）表达稳定性，结果表明１８ＳｒＲＮＡ无论是在不同发育时期的黄化苗，还是在不同品种和紫外伤害下的黄化苗，表达均最为稳定。Ｊａｉｎ等｜１ ６Ｊ分析了１０个常用内参基因（１８ＳｒＲＮＡ，２５Ｓ但是长期以来，人们在没有更好的内参基因 供选择的情况下，仍采用传统的持家基冈作内参基因而不去考虑在该实验条件下持家基因的表达 是否会发生变化。这主要是由于以往的基因表达ｒＲＮＡ，硼Ｃ，瑚∞，叩Ｑ，Ｄ，ＡＣ丌，，ＧＡＰＤ日，ＥＦＪｄ，ｅ伊４仅和？础）在２５个水稻样品 中的表达稳定性，结果表明邶∞和ＥＦ，ａ在不同发育时期和组织器官中稳定性最好，而１８ｓｒＲＮＡ和２５Ｓ ｒＲＮＡ在逆境胁迫样品中的稳定性 最好。分析中，人们主要依赖于Ｎｏｒｈｔｅｍ杂交、组织化学染色或ＲＴ―ＰＣＲ，而这种分析基本上是定性分析或相对定量分析，持家基因由于表达丰度高，如果目标基因表达被上调或下调就能明显表现出来。 但是ｑＲＴ―ＰＣＲ是对基冈表达的准确定量分析，传 统的持家基因就不能满足定量分析对内参基因的李钱峰等Ⅲｏ以６个籼粳稻品种胚乳为研究材料，分析了７个常用持家基因（ｅＥ几如，胛４口，瑚｝Ｃ，甜尸Ｄ日，船９巧，观和ＡＣ死）表达稳定和ＡＣ＂的表达最为稳定，咄ｃ的表达变化最为明显。性，通过ｇｅＮｏ唧分析表明：不同的品种间，ｅＥＦ勘要求。再者，持家基凶在某些组织器官、发育时期 或生理状态一般是稳定表达的，而当实验条件改变时它们的表达也会发生变化，而且不同类型的 样品（如不同器官问的比较）持家基因的表达也 不一样。如果考虑小到内参基因表达的变化就会 导致ｑＲＴ―ＰｃＲ的结果准确性降低甚至得到卡Ｈ反 或错误的结论¨¨１２ Ｊ。例如１８Ｓ ｒＲＮＡ基因常被用Ｈｏｎｇ等¨引分析了９个短柄草内参基因（ＡＣＴ７．ＲＣＡ，ＥＦｌ仅，ＧＡＰＤＨ，ｓ伍ｍＤＣ，ＴＵＡ６，叩ｃＪ８，叩钟，昭ＱＪ）在２１个不同发育时期组织器官在逆境胁迫（干旱、盐、冷、热）和激素条件下 的表达稳定性，ｇｅＮｏ肿和ＮｏＨｎＦｉｎｄｅｒ分析表明泛 素结合酶基因１８（ｕ占ｃ，８）在所有供试样品中表来作内参基因，但是并不是十分理想Ｊ Ｊ。其一，１８ｓｒＲＮＡ表达丰度很高，当目标基因丰度较低达稳定性最好，船僻和ⅧＱＪＤ在不同组织器官和发育时期样品中表达最为稳定，Ｓ一腺苷甲硫氨时，定量结果准确性较低；其二，１８Ｓ ｒＲＮＡ要求反转录必须使用随机引物，而目标基因反转录常使酸合成酶基因（疏ｍＤＣ）在环境胁迫样品中的表万方数据 　３２中国农业科技导报ｌｌ卷达最为稳定。Ｊｉａｎ等【１引分析了１０个大豆内参基因（ＡＣ呓／７．ＡＣＴｌ ｌ。ＴＵＡ，ＴＵＢ，ＥＬＦｌ仅，ＵＢＣ２，ＥＬＦｌｂ，ＣＹＰ２，３内参基因筛选的新策略合适的内参基因的选择应取决于研究者的实伤ＰＤ，叩ＱＪ『Ｄ）在２１个不同发育时期、组织器官等样本中的表达稳定性，结果表明ｌＯ个内参基因 的表达稳定性存在显著差异，在所有供试样品中验条件，因此在一种实验条件下合适的内参基因 并不一定适用另一种实验条件，或者不同植物间 的内参基因＿ＨＪ．能也是不同的。因此在ｑＲＴ―ＰＣＲ 中有必要对内参基因的表达稳定性进行评价并选 出适合不同实验条件下使用的内参基因。Ｖａｎｄｅ― ｓｏｍｐｅｌｅ等悼２ ｏ开发．ｒ专门用于分析内参基因稳定脱几６和Ｃ凇稳定性最好，笳尸Ｄ和叩ｐ，Ｏ的稳定性最差。在不同的组织器官或发育时期样品中，其稳定性也不同，脱Ｆ，６和Ｃ脚适合于组织器官样品的表达分析，而ＡＣ挖／７和丁蚴在不同发育时期的样品中表达稳定性最好。性的程序ｇｅＮｏ珊（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／～ ｊｖｄｅｓｏｍｐ／ｇｅｎｏ咖），不但可以分析内参基因在不同样品中的表达稳定性，计算出内参基因表达稳 定性的Ｍ值，肘值越大稳定性越差，反之，稳定性 越好。还可计算引入１个新的内参基因后标准化涂礼莉等Ⅲ１分析了７个内参基因（１８ＳｒＲＮＡ，胍幻棚，ⅧＱ７，Ａｃ￡ｉ以，Ｃ冲，叩ＱＪ，叩Ｑ２）在棉花不同组织和不同发育时期的表达稳定性， 发现在纤维发育的后期这些基因的表达都下调， 而纤维发育后期特异表达基因ＡＧＰ的表达则上因子（ｎｏ咖ａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）的配对变异（ｐａｉｒｗｉｓｅｖａｒｉａｔｉｏｎ）ｙ值，并可根据‰／‰＋ｌ比值来判定引 入１个新的内参基因是否会对标准化因子产生显 著影响，默认的ｙ值为０．１５，如果‰／‰＋１大于 Ｏ．１５，则有必要引入第乃＋１个基冈，反之，则不必调。舰￡ｏ棚，咄Ｑ和叩ＱＪ在棉花纤维发育过程中稳定性较好，而Ａｃ眩和昭Ｑ２稳定性最差。Ｎｉｃｏｔ等【ｌ¨分析了７个传统内参基因（Ａｃｒ，ＡＰＲｒ，１８ＳｒＲＮＡ，Ｅ川仅，兀倡，Ｃ，ｒＰ，Ｒ沾傩ＤｍｏＺｐ厂ｏ￡ｅ流Ｌ２）在马铃薯生物胁迫（晚疫病）和逆境胁迫（盐、干旱）条件下的表达稳定性，结果表明 ＥＦＪｄ的稳定性最好。以不同稳定性的内参基因引入新的内参基因。在内参基因的稳定性分析 中，可以利用ｇｅＮｏ彻程序来确定准确定量所需要的合适的内参基因数目。Ａｎｄｅｒｓｅｎ等旧纠也开发作标准，目标基因丘啦Ｄ．２的表达水平变化很大， 用稳定性差的内参基因作内参导致＾啦Ｄ．２的表达水平有较大的误差。了同类的程序Ｎｏ咖Ｆｉｎｄｅｒ。与ｇｅＮｏ珊的计算方 法不同，Ｎｏ咖Ｆｉｎｄｅｒ是基于方差分析对内参基因的表达稳定性进行直接评价。在哺乳动物、酵母 和细菌中，已有很多研究用该类软件去评价内参 基因的稳定性并筛选合适的内参基因ⅢＪ。但是 在植物基因表达分析中，相关的研究还较少。３．１Ｉｓｋａｎｄａｒ等旧¨分析了４个内参基因（ＡＣｒ，ｒⅧ，翻ＪｐＪ｜）片，２５ＳｒＲＮＡ）在甘蔗不同组织器官和ｒＲＮＡ不同品种中的表达稳定性，结果表明２５Ｓ同组织器官中稳定性最好。在不同样品间的表达水平最为一致，以Ｐ嬲在不Ｂｍｎｎｅｒ等【８１分析了ｌＯ个传统内参基因基于基因表达芯片数据发现新的内参基因 大量基冈表达芯片数据为新的内参基因的选择开辟了一条新的途径。通过对基因芯片数据的 分析可以发现在不同生理条件或细胞类型中稳定 表达的基因。Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ等【１２ｌ利用拟南芥全基 因组Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＡＴＨｌ基因芯片数据，筛选ｒ２２０ＵＢＱｌｌ．ＩＵＡ，１８ｓｒＲＮＡ。ＡＣ您．ＵＢＱ７．ＥＦｌｂ。ｌＵＢ。Ａｃ＂Ｊ，剧丹６，Ｃ印）在杨树８个不同发育时期样品中的表达稳定性，发现不同的内参基因的稳定 性存在显著差异，１８ｓｒＲＮＡ表达丰度最高，删个在不同发育时期、逆境胁迫（盐分、干旱、冷 害）、生物胁迫、激素、营养缺乏（硫素、碳源、磷） 和不同光照条件下稳定表达的基因，并用ｑＲＴ― ＰｃＲ比较了该２２个新的内参基因与５个传统的表达丰度最低，ⅧＱＪ Ｊ『和ｒ泓在不同样品间变异系数最小，表达最为稳定，而ｃｙＰ稳定性最差。 综上，已有研究结果表明，不同植物和不同样 品间的ｑＲＴ―ＰｃＲ内参基肉的稳定性存在显著差常用内参基因（ＡＣ眩，ｒ班珩，朋一Ｊａ，咖Ｑ，０，ＧＡＰ－异。因而，针对特定的实验条件和样品类型选择 合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因表达结果至关重要。朋）在不同生长条件和逆境胁迫下的表达稳定性。结果表明，多数新的内参基因的表达稳定性均显著优于传统的内参基因，７删Ｊ（Ａ确筘铊７Ｄ），万方数据 　６期胡瑞波等：植物实时荧光定量ＰｃＲ内参基凶的选择３３鲥＾口（４砣晓舳９Ｄ）和ＰＰ２Ａ（ＡｔＪｇ，刀加）可以作 为新的内参基因，而在以前的基因表达分析中广泛使用的４Ｃ跎是稳定性最差的。而且一些新的这１０个基因包括３个传统的常用持家基因和７ 个Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ等¨纠报道的新的内参候选基因，分 析结果表明并非所有的新的内参基因的表达稳定 性均优于传统内参基因，Ａ巧ＧＪ５７，Ｄ（Ｆ－ｂｏｘ蛋白 基因），Ａ呓晓韶９Ｄ（鲥ⅣＤ）和４巧６Ｄ８２９Ｄ（ｙＬｓ８） 可作为今后该类实验中的新的内参基因。而在以 往研究中广泛使用的内参基因Ｅｐ，ａ和ＡＣ挖因 稳定性太差不应再继续使用。但是新的内参基冈内参基因（如艘弘）的表达丰度要明显低于传统的内参基因，这对定量表达丰度较低的目标基因时尤为有效。 Ｌｉｈａｕｌｔ等陋１通过分析大豆已发表的基因芯 片数据，发现，多达２００个稳定性较好的基因，并对其中１８个基因在不同发育时期、组织器官、逆境胁迫（创伤、激素、锈病）１３０个样本进行了孤ｗＪ，溜Ｃ和ＰＰＲ即∞￡基因在铜（Ｃｕ）和镉（Ｃｄ）胁迫条件的表达稳定性最差，反而不如传统 内参基因。 Ｅｘｐ６ｓｉｔｏ―ＲｏｄｒＩｇｕｅｚ等Ⅲ１分析了４个新的候ｑＲＴ―ＰＣＲ表达分析，结果表明多数基因的稳定性 优于传统内参基因Ａｃｒ和ｓ班｝，２。但是，肽酶５Ｊ６基因和呼吸爆发氧化酶基因的稳定性最差，说明通过基因芯片数据筛选到的基因必须经过 ｑＲＴ―ＰｃＲ实验的验证。筛选出了４个新的大豆内参基因，分别为ＡＢＣ转运凶子基因，Ｆ－ｂｏｘ家族选内参基因（卯丹．ｆ，酗ⅣＤ，ｃＡＣ和ＳＧⅣ．叩拍。卿）ＡＰ丁，Ｄ＾Ｈ．，，Ｍ）在番茄２７个不同发育时期的组织器官中的表达稳定性，应用ｇｅＮｏ瑚，Ｎｏ丌ｎＦｉｎｄｅｒ和变异系数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆ和７个传统持家基因（甜ＰＤＨ，Ｅ盯ａ，船尸，彤瑚，基因，胰岛素降解酶基因和ｃＤＰＫ蛋白激酶基因。但是，ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ等¨副的研究结果并没有引 起人们的足够重视，在过去几年中，很多研究者在ｖ撕ａｔｉｏｎ）进行分析，结果表明４个新的候选内参基因的稳定性均显著优 于传统内参基因，明ｃ和孤ｗ，的稳定性最好，而进行植物基囚表达分析时仍倾向于使用传统的持家基因作内参，而没有在各自的实验条件下对这 些内参基因的稳定性做任何验证分析。 ３．２基于ＥＳＴ数据库发现新的内参基因胛Ｊｄ和咒从的稳定性最差。Ｒｅｉｄ等ｍ１分析了１４个内参基因（Ａ丹７，ＣＹＰ，ＥＦｌ ｏ【，ＧＡＰＤＨ，ＭＤＨ，ＰＰ２Ａ，ｓＡＮＤ，ＴｌＰ４ｌ，Ｆａｃｃｉｏｌｉ等Ⅲ１建立了一套从大麦ＥｓＴ数据库 筛选新的内参基因的方法。首先根据ｃＤＮＡ文库 来源对大麦公共数据库中的ＥｓＴ序列进行分类，从中寻找在特定ｃＤＮＡ文库中出现频率高即表达ｒ以，７１凇，叩Ｃ，叩Ｑ．厨Ｄ，咖Ｑ，Ｄ）在葡萄浆果发育过程中的表达稳定性，其中包括３个新的内参基因ＪＰ＿Ｐ２Ａ，ｓＡ彻和＂刚Ｊ是拟南芥新的内参基因的同源基因。对不同年份的２组共１８个不同丰度较高的ＥｓＴ序列，再结合网络搜索得到这些基因在不同实验条件下（如逆境胁迫）的表达谱， 筛选出了一批稳定性较好的候选内参基因，并通 过ｑＲＴ―ＰｃＲ验证得到４个大麦的新的内参基因浆果发育时期的样品分析结果表明，甜肋日，Ａｃ丁，Ｅ，，ａ和鲥ⅣＤ的总体稳定性较好。但是， 把２组样品单独分析时内参基因的稳定性却并不 一致，对第一组样品来说，内参基因的稳定性排序 为ＴｌＰ４ｌ，ＡＰ４７＞ＧＡＰＤＨ＞ＭＤＨ＞ｓＡＮＤ；对筛二分别为Ｓ一腺苷蛋氨酸脱羧酶基因、甜ＰＤ日、热 激蛋白＾印９Ｄ基因和一个未知功能基因（ＴＣｌ３９０５６）。 Ｃｏｋｅｒ等１２川统计分析了番茄ＥＳＴ数据库中组样品来说则是ＡＣ彤ＥＦＪｄ＞甜ＰＤⅣ＞叩Ｑ一群Ｄ＞肘ＤＨ。在拟南芥中稳定最好的内参基因 尸＿Ｐ２４和死ｗＪ，在葡萄浆果发育过程中的稳定性 反不如传统内参基因。由此可见，稳定好的内参 基因并不是通用的，其选择需根据不同物种和不同实验条件而定。的１２７个基因在不同ｃＤＮＡ文库中的出现频率，并据此来判断基因的表达稳定性，得出５个稳定 性最好的基因：Ｄａｎ―Ｊ蛋白基因，肿瘤蛋白基因， ＴＵＡ。ＣＹＰ瓢ＧＡＰＤＨ。Ｇｕｔｉｅ仃ｅｚ等¨纠分析了４个内参基因在杨树 中的表达稳定性，其中２个为传统内参基因４新的内参基因的表达稳定性评价Ｒｅｍａｎｓ等‘圳分析了拟南芥在铜（Ｃｕ）和镉咄ｐ，Ｄ和１８Ｓ ｒＲＮＡ，另外２个是拟南芥新的内参基因Ａ群驴铊７０和Ａ蛹哪３舳的同源基因。在８个不同的发育时期样品中，杨树Ａ群驴铊７Ｄ和 （Ｃｄ）胁迫条件下１０个内参基因表达的稳定性，Ａ确筘３３８０同源基因的稳定要高于叩ＱＪＤ和１８ｓ万方数据 　中国农业科技导报１ｌ卷ｒＲＮＡ。但在不同形成层样品中，Ａ群驴４２７０同源基因是不存在的。内参基因的稳定性是相对的， 不同的内参基因在不同生理条件的表达通常不是 恒定不变的。在一种实验条件表现稳定的内参基 因不一定适用于另一种实验条件（表１）。研究者基因和咖Ｑ，０的稳定性最好，Ａ两筘３３８Ｄ同源基因的稳定性较差。用不同的内参基因对杨树Ａ删陋Ｇｍ循Ⅳ刚（ＡⅣｒ）基因进行表达分析会得出截然不同的结论。５必须结合各自的实验条件和样品类型来选择合适的内参基因。 同一基因家族内不同成员问的表达稳定性也 可能不同。泛素基因是一类持家基因，在细胞的内参基因选择应注意的几个问题已有研究结果表明，在所有组织器官、发育时蛋白质降解中发挥重要作用，并广泛用作内参基期、生理状态逆境条件下均稳定表达的理想内参表ｌＴａｂｌｅ ｌ因。真核生物中，编码泛素蛋白的主要有多聚泛已报道的植物ｑＲＴ－ＰＣＲ内参基因“ｓｔ ｏｆ ｒｅｐｏｒ【ｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｑＲＴ―ＰＣＲ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ万方数据 　６期胡瑞波等：植物实时荧光定量ＰｃＲ内参基因的选择３５Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶基因（Ｒ甜）胁慨ｌＤ击啪Ｄｅｖｅｌｏｐ啪ｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ，ｔ汹ｅ／ｏｒｇａ啮，ｄ厶ｔⅡｃ，ｉｙｏｎ ａｂｉｏｆｉｃ短柄草发育时期组织器官和逆境胁迫 （干旱，盐，高温，低温）、激素 ｓｔｒｅｓｓ（ｄｍｕｇｈｔ，Ｒｕｂｉｓｃｏ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｌｍ圯 ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ堋Ｃ馏，ＡＣ刀Ｓ－腺苷甲硫氨酸合成酶基因［１８］ｓａｌｔ，ｈｅａｔ，（＆，棚Ｃ）Ｓ．ａｄ朗ｏｓｖｌｍｅ“１ｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔ｜ｌｅｔ鹊ｅ ｅｎｃｏｄｍｇ ｇｅｎｅｃｏｌｄ），ｈｏｒｎｌｏ眦组织器官，发育时期，光周期，品种ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａＩｓｔａｇｅｓ，ｔｉｓｓｕｅ／ｏｒｇａ璐，删６，ｃｙ挖Ｇ酐）Ｄ，晒Ｑ，Ｄ［１９］ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｃｔｒｅａｔＩｎｅｎｔｓ，ｃｕｌｔｉｖａｒｓ迫憩蕉Ｃｏｔｔｏｎ擞㈣一酬瞄 嗍剃咒．｜ ｌ ｜ 一 一 慧妻羰慧黧ｍ。以…。。甥舢 一躺伉瞻出｜！Ｄｅｖｅｌ叩ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ，ｔｉｓｓｕｅ／ｏ嘴ｍｓ～一一～～一 茎一Ｈｉｓｔ。ｎｅ Ｈ１ｓｔｏｎｅ３，瑚Ｑ，唧ｊ，“ｄＶ，ｕ廿叫一～一一～一一Ａｃ砣，晒Ｑ２ 肌１ｚ＇ｕ６叫［２０］ Ｌ删Ｊ沣：ａ．末通过ｑＲＴ―ＰＣＲ验证；ｂ．未用ｇｅＮｏｍ或Ｎ０ｆＴｎＦｉｎｄｅｒ分析．Ｎｏｔｅ：ａ．ｄｅｎｏｔｅ ｎｏｔ Ｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙ ｑＲＴ―ＰＣＲ；ｂ．ｄｅｎｏｔｅｎｏｔａｎ｛ＩｌｙｚｅｄｂｙｇｅＮ锄盯Ｎ唧Ｆｉｎｄｅｒ舶ｆ￡ｗａｒｅ．定适用于另一种植物的所有样品类型。比如在拟 南芥中表达稳定的孤ｗＪ和ＰＰ２Ａ在葡萄浆果的素（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）和泛素延伸蛋白（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｍｔｅｉｎ）两类基因。在拟南芥中研究发 现，泛素基因家族不同成员的表达稳定性存在明ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ发育过程中的稳定性较差，”ＷＪ在铜和镉胁迫条件下的表达稳定最差，反倒不如传统的内参基显差异，一些泛素结合酶基因（如Ａ确眵７９６Ｄ）和 Ｅ３泛素连接酶基因（如Ａ￡Ｊ９７５盯Ｄ）的稳定性较因。同理，在杨树中不同形成层样品中ｓＡ肋的稳定性也较差（表１）。好，而一些多聚泛素基因（如咄ＱＪＯ和凇ＱＪ）稳定性较差，而另一些多聚泛素基因（如叩钟和咖∞）被证明在拟南芥、短柄草和水稻中稳定性较好（表Ｊ）。肌动蛋白基因家族也被广泛用作内选择两个以上的内参基因作参照有助于得到 更为可靠的表达结果，这在大豆¨５ｌ、马铃薯【２９１、 葡萄口叫和杨树¨纠中已被证实。因此在追踪基因 表达的微小变化时，单独使用一个内参基因往往 不能得到准确的定量结果，必须几个内参基因结 合使用。参考文献［１］Ｈｕ黯舭ｔ Ｊ，ＤｈｅｄａＫ，Ｂｕｓｔｉｎ参基因，但是其不同家族成员间的稳定性也不同， ＡＣ砣／７的稳定性较差，而，４ｃ＂，的稳定性较好。于双倡（表１）。在Ｔｕｂｕｌｉｎ基因家族中，删的稳定性也普遍高内参基因在不同物种间没有绝对的通用性， 不同物种间同源的内参基因的稳定性也不同，在 一种植物中稳定性表现非常好的内参基因也不一ｓ，甜以．Ｒｅａｌ―ｔｉｍｅ ＲＴ―ＰＣＲｎ∞ＩｌａＩｉｓａｔｉｏｎ；ｓ劬岫ｇｉｅ８鲫ｄ ｃｏｎｓｉｄｅｍ６０ｎ８［Ｊ］．Ｇｅｎ髓蛐ｄ万方数据 　３６中国农业科技导报ｒｅａｌ―ｔｉｍｅＩｍｍｕｎ时，２００５，６：２７９―２８４ ［２］Ｒ丑ｄｏｎｉｃｒｅ如ｒｅｎｃｅｒｉｃｅ ＩｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａ，％ｕｌｋｅＳ，ＭａｃｋａｙＭ，以以．ＧｕｉｄｅｌｉｎｅｆｏｒＲｅ８．Ｃｏｍｍｕ．，２０（）６，３４５（２）：６４６―６５１． ［１７］李钱峰，蒋美艳，了：恒秀，等，水稻胚乳ＲＮＡ定量ＲＴ?ＰｃＲ 分析中参照基因选择［Ｊ］．扬州人学学报（农业与生命科学 版），２【）０８。２９（２）：６ｌ一６６． ［１８］Ｈｏｎｇｓ Ｙ，ｓｅｏ ｇｅｎｅＢ Ｐｇｅｎｅ蒯ｅｃｔｊ伽ｆｏｒ ｑ蚰ｎｌｉｔ丑ｔｊｖｅ瑚¨ｍｅ ＰｃＲ［Ｊ】．ＰＢｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏＰｈｙｓ．Ｒ鹪．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，３１３：８５６―８６２．［３］ＳｕｚｕｋｉＴ，ＨｉｇｇｉｎｓＪ，Ｃｍｗｆｏｒｄ Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＲＮＡｑＩｌａｎｔｉ诅ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０００，２９：３３２―３３７． ［４］Ｂｕｓｔｉｎ ｓ Ａ．Ｊ，Ｙａｎｇ Ｍｇｅｎｅｓ，“口ｆ．． ｓｔｕｄｉｅ８ＰＩｌｌＩＩｔ ｉｎＥ１ｐｌｏｒｉｎｇｖａｌｉｄＱｕａｎｔｉ６ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡＰｃＲｕｓｉ”ｇｒｅａｌ?ｔｉｍｅｒ；ｅｖｅｒ∽ Ｍ０１．ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉＩＩｎＢｒ孤：ｈｙｐｏｄｊｕｍｔ砌８ｃ“ｐｔｉｏｎ［５］ＲＴ―ＰｃＲ：ｔｒｅｎｄｓ ａｒｌｄｐｆｏｂｌｅｍｓ［Ｊ］．Ｊ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ｂｙ ｒｅａｌ―ｔｉｍｅ１１２一１２２．ＰｃＲ［Ｊ］．ＢＭｃＢｉ０１．，２００８，８：Ｅｎｄｏｃｒｉｎ０１．，２００２．２９：２３―２９．Ｔｈｅｌｌｉｎ Ｏ，ＺｏｒｚｉＷ，Ｌａｋａｙｅ Ｂ。以耐．．Ｈｏｕｓｅｋｅ印ｉｎｇ ｇｅｎｅｓ蹦［１９］Ｊｉａｌｌ Ｂ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｂｉ Ｙ，ｅ￡越．．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｍａｌ ｃ佣ｔ“ｆｏｒｇｅｎｅ ｅｌｐｒｅｓ８ｉｏｎｉｎｔｅｍａｌ ｓｔａｎｄａＨＩｓ：ｕｓｅ毗ｌｄ ７５：２９―２９５．ｌｉｍ“ｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ０１．，１９９９，Ｖｓｔｕｄｙｉｎｓｏｙｂｅａｎｂｙ ｑｕａＩｌｔｉｔａｔｉｖｅｆｉｅａｌ?ｔｉｍｅＰＣＲ［Ｊ］．ＢＭｃ Ｍ０１．Ｂｉ０Ｌ，２００８，９：５９．ａｌｊ（ｉａｔｉｏｎｉｎ［６］ＤｈｅｄａＫ，Ｈｕ黯ｅｔｔ Ｊ Ｆ，Ｂｕｓｔｉｎ Ｓ Ａ，ｅ￡ｏｆ．．ｇｅｎｅ８ｏｆ［２０］涂礼莉，张献龙，刘迪秋，等．棉花纤维发育和体细胞胚发 生过程Ｉ｝Ｉ实时定量ＰｃＲ内射照基冈的筛选［Ｊ］．科学通 报，２００７，５２（２０）：２３７９―２３８５． ［２１］Ｉｓｋａｎｄａｒ Ｈ Ｍ，Ｓｉｍｐ∞ｎｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｓ Ｒｈｏｕ鸵ｋｅ印ｉｎｇｔｉｍｅｆ斫ｎｏ咖ａｌｊｚｉ“ｇ ＲＮＡｅｘｐｒｅ８ｓｉｏｎｒｅａｌ－ＰｃＲ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ８，２（）【）４，３７：１１２一１１９．Ｂ［７］鼬ｍＲ，ＮａｍＨＹ。鼬ｍ Ｓ Ｕ，甜口Ｌ．Ｎｏ珊ａｌｉ龃ｔｉｏｎ ｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ―ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｈｏｕ鸵ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎ秭 Ｌｅｔｔ．．２００３，２５：１８６９一１８７２．ＩＳ，ｃａｓｕＲＥ，以口ｆ．．Ｃｏｍｐａｒｉ∞ｎ ０ｆ陀ｖｅ玛ｅ ｉｎｔ砌８ｃｒｉｐｔｉｏｎＡｆｏｒｏｆｒｉｃｅ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬＭ，Ｙａｋｏｖｌｅｖｒｅａｃｔｉｏｎ卸ａｌｙ ｓｉｓｑｕ蛐ｔｉｔａｔｉｖｅ 陀ａ１－ｔｉｍ８ ｐｏｌｙｍｅｒａ舱ｃｈ８ｉｎ Ｐｌ明ｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ叫ｇａｒｃ锄ｅ［Ｊ］．［８］Ｂｍｎｎｅｒ ｃｏｎｔＩｄｓ ＢＭＣＡ，Ｓｔｍｕｓｓ Ｓ Ｈ．Ｖａ王ｉｄａｔｉｎｇ ｉｎｔｅｍａｌ ｐｌａｎｔｇｅｎｅ ｅｌｐｒｅｓｓｉｏｎＭ０１．Ｂｉ０１．Ｒｅｐ．，２（）（Ｍ。２２：３２５―３３７．ｆ０。ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ８ｔｕｄｉｅ８［Ｊ］．［２２］Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ Ｊ，ＤｅｍａｌｊｚａＬｉｏｎａｖｅ憎ｇｉｎｇ ｏｆ ｏｒＰｒｅｔｅｒ Ｋ，Ｐａｕｙｎ Ｆ，日ｎｆ．．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ―Ｉ）ｃＲｎｏｒ．ＰｌａｎｔＢｉ０１．。２００４．４：１４―２０．ｒｅａｌ?ｔｉｍｅｍｕＩｔｉｐＩｅｄａＬａ 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ａｂｉｏｔｉｃ ２９０７―２９１４．ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｅ１ｐ． Ｂｏｔ．，２００５，５６： Ｋ，ｄ以．ｒｅｆｂｒｅｎｃｅ ＰｌａｎｔＧｅｎｏ呲，２００８，ｌ：４４―５４．［１２］Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ Ｔ，Ｓｔｉｔｔ Ｍ，Ａｈｍａｎｎ Ｔ，Ｕｄｖａｒｄｉ Ｇｅｎｏｍｅ―ｗｉｄｅｇｅｎｅｓＭ０ｆ“ｉｎＰ。ｃｉｃｅｒｉ Ｇ Ｐ，Ｐｒｏｖｅｍ Ｐ，村以．Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ ８ｉｌｉｃｏ”ｔＥａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ明ａｌｙｓｉｓ蚰ｄ ｗｅｂ眈ａｌ℃ｈ ｅ嚼ｎｅａｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃ砒ｉｏｎ柚ｄｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎｏｆ ｓｕｐｅｒｉｏｒｏｐｔｉｍｉ嬲ｔｉｏｎ ａｌｌｏｗｓ ｓｕｉｔａｂＩｅｆｏｒａｇｉｌｅｉｄｅｎｔｉｎｃａｔｉｏｎｏｆ ｒｅｆｂｒｅｎｃｅ学ｅｎｅｓｆｏｒ ｔｎｍｓｃｒｉｐｌｎｏ珊ａｌｉｚａｔｉｏｎＡｍ６ｉ出ｐ括［Ｊ］．ｎｏＨｎａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐ陀＊ｓｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］． Ｐｌ柚ｔＰｈｙｓ“．，２００５，１３９：５一１７． ［１３］Ｓｏｌａｎ鹤Ｍ， ｒｉｂ０８０ｍａｌ ｒｅｌａｔｅｄ ＭｏｒａｌａｓＭ０１．ＢｉｏＩ．，２００ｒ７。６３：６７９―６８８． Ｅ． Ｕｎ鲫ｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆ ｕｓｉｎｇＲ，Ｅｓｃｒｉｃｈ［２７］ｃｏｋｅｒ Ｊｓ，Ｄａｖｉｓ ｔｏｍａｔｏＥ．ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｈｏｕ∞ｋｅｅｐｉ“ｇＲＮＡｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｍｍＩｆ斫Ｎｏｒｔｈ锄ｂｌｏｔａｎａｌｙｓｅｓＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ８ ｉｎｐｌａｎｔｓｕｓｉｎｇ｜ｃ±汀ｄａｔａ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｌ’ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｔｏ ｔｈｅｉｍｂａＩａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎｍｅ８ｓｅｎｇｅｒａｎｄ ｒｉｂ∞ｏｍａｌ２（）０３．３５（４）：７４０―７４８．［Ｊ］．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００ｌ，２８８（１）：９９一１０２． ［１４］［２８］Ｒｅ眦ｎｓ Ｔ，ｓｍｅｅｔｓｒｅａｊ―ｔｉｍｅ ｔ７Ⅺｚ缸，ｍＲＴ．Ｐ（：ＲＫ，Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｊｏｎｔｏＫ，甜口Ｌ．Ｎｏ珊ａｌｉｓａｔｉｏｎｉｎｏｆｂｓ嘲Ｉ Ｓ，ＣｚｅⅢｉｎｓｋｉｔｉｏｎＤＫ，ｗｅｃｈ鸵ｒＭＡ，耵ｎ正．Ｏｐｌｉｒｎｉｚａ?ＲＴ―ＰＣＲ０ｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ一ｔｉｍｅｐａｒａｒ鹏ｔｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ 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中国农业科技导报 JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY ) 14次参考文献(30条) 1.Huggett J;Dheda K;Bustin S Real-time RT-PCRstrategies and considerations 2005 2.Radonic A;Thulke S;Mackay I M Guideline for reference gene selection for quantitative real-time PCR[外文期刊] 2004 3.Suzuki T;Higgins P J;Crawford D Control selection for RNA quantitation 2000 4.Bustin S A Quantification of mRNA using real-time reverse.transcription PCR RT-PCR:trends and problems[外文期刊] .Thellin O;Zorzi W;Lakaye B Housekeeping genes as internal standards:use and limits 1999 6.Dheda K;Huggett J F;Bustin S A Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in realtime PCR 2004 7.Kim B R;Nam H Y;Kim S U Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping genes in rice 2003 8.Brunner A M;Yakovlev I A;Strauss S H Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies[外文期刊] 2004 9.Lee P D;Sladek R;Greenwood C M Control genes and variability:absence of ubiquitous reference 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