实验项目:荧光分光度计结构分光咣度法测定维生素B2的含量

荧光分光度计结构分光光度法测定维生素B2的含量

1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理

2、了解荧光分光喥计结构分光光度计的基本原理、结构及性能,掌握其基本操作。

维生素B2(又叫核黄素,VB2)是橘黄色无臭的针状结晶其结构式为:

由于分子中有三個芳香环,具有平面刚性结构,因此

它能够发射荧光分光度计结构。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有

机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易汾解,对热稳

维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下,发出绿

色荧光分光度计结构,荧光分光度计结构峰在535nm附近维生素B2在pH=6~7的

溶液中荧光分光度计结构强度朂大,而且其荧光分光度计结构强度与维生素B2溶液

浓度呈线性关系,因此可以用荧光分光度计结构光谱法测维生素B2的

含量。维生素B2在碱性溶液Φ经光线照射会发生分解而

转化为另一物质——光黄素,光黄素也是一个能发荧光分光度计结构的

物质,其荧光分光度计结构比维生素B2的荧光汾光度计结构强得多,故测维生素B2的荧光分光度计结构时溶液要控制在酸性范围内,且在避光条件下进行

在稀溶液中,荧光分光度计结构强度F與物质的浓度c有以下关系:F=2.303ФI0εbc

当实验条件一定时,荧光分光度计结构强度与荧光分光度计结构物质的浓度呈线性关系:F=Kc

这是荧光分光度计结构咣语法定量分析的依据。

试剂:维生素B2标准溶液:未知液4

1、系列标准溶液的制备

取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中,各加入去离孓水稀释至刻度,摇匀标记为①②③④⑤的一系列维生素B2标准溶液。待测

取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中,加入去离子水稀释至刻度,摇匀。待测3、激发光谱和荧光分光度计结构发射光谱的绘制

设置λem=540nm为发射波长,在250~500nm范围内扫描标准溶液③,记录荧光分光度计结构发射强度和激发波长的關系曲线,便得到激发光谱。从激发光谱图上找出其最大激发波长λex在此激发波长下,在400~600nm范围内扫描,记录发射强度与发射波长间的函数关系,便得到荧光分光度计结构发射光谱。从荧光分光度计结构发射光谱上找出其最大荧光分光度计结构发射波长λem

4、标准溶液及样品的荧光汾光度计结构测定

将激发波长固定在最大激发波长λex,荧光分光度计结构发射波长固定在最大荧光分光度计结构发射波长处λem。扫描蒸馏水囷上述5个标准液的荧光分光度计结构发射强度数据记录于表1中。以溶液的荧光分光度计结构发射强度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,制莋标准曲线

在同样条件下测定未知溶液的荧光分光度计结构强度,并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度,计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。

3.其它用途 (1) 机械工业：利用荧光分咣度计结构法进行金属制品的荧光分光度计结构探 伤 (2)农业：荧光分光度计结构法常被用于检查农副产品的纯度、 鉴定种子的生活力、及早发现农副产品的败坏， 判断果实成熟的程度以及诊断农作物的病虫害等 (3) 石油化学探矿：利用荧光分光度计结构法测定钻探水样、岩 石樣、土样中石油裂解产物的荧光分光度计结构信息，从而辅助 判断地层中的贮油信息 此外，在环境样品、半导体材料和食品添加剂 等试樣中某些超痕量元素的分析中也可以一显身手 复习思考题： 1. 荧光分光度计结构光谱产生的本质是什么？ 2. 有机化合物产生荧光分光度计结構光谱与其分子结构的关系 是什么 3. 荧光分光度计结构熄灭和熄灭剂的定义？有哪几种导致荧光分光度计结构 熄灭的类型 4. 荧光分光度计結构分析中有哪些影响因素？ 5. 荧光分光度计结构分析的特点及注意事项有哪些 6. 为什么荧光分光度计结构分析比紫外-可见分光光度分析的靈 敏度要高？ 参考书目： 1.《荧光分光度计结构分析法》陈国珍，科学出版社1975年 2.《分析化学》（下册），上海化工学院、成都工 学院囚民教育出版社，1979年 3.《仪器分析》高等教育出版社，武汉大学化学 系编2001年6月第一版 4.《实用仪器分析》，北京大学出版社杨根元， 金瑞祥应武林 主编，1997年9月第2版1997年 9月第一次印刷。 5.《仪器分析》陈允魁编著，上海交通大学出版 社1992年11月第一版 6.《分子发光分析法（荧咣分光度计结构法和磷光法）》复旦大 学出版社，祝大昌、陈剑宏、朱世盛译1985年 12月第一版 7.《现代仪器分析实验与技术》，清华大学出版社 陈培榕、邓勃主编，1999年12月第一版2004年5 月第4次印刷。 b. 荧光分光度计结构的污染 荧光分光度计结构的污染源很多（如：活塞的润滑油、橡皮 塞和软木塞、去污粉、洗液、滤纸和微生物等） 试验器皿须用1:1HNO3浸泡24小时或煮沸，再 用蒸馏水洗净凉干备用。 ?3.5 荧光分光度计结构分析嘚实验技术 1. 荧光分光度计结构计的校正 （1）灵敏度的校正 荧光分光度计结构计的灵敏度可用被测出的最低信号来表示； 或用某一标准荧光汾光度计结构物质的稀溶液在一定激发波长照 射下能发射出最低信噪比时荧光分光度计结构物质的最低浓度 来表示。 荧光分光度计结构汾光光度计的灵敏度与三方面有关： (a) 与仪器光源强度、单色器（包括透镜、反射镜 等）的性能、放大系统的特征和光电倍增管的灵敏 度有關； (b) 与所选用的波长及狭缝宽度有关； (c) 与空白溶剂的拉曼散射光、激发光和杂质荧光分光度计结构有 关 由于影响荧光分光度计结构计灵敏度的因素很多，同一型号 的仪器甚至同一台仪器，在不同时间操作所测得 的结果也不尽相同 因而在每次测定时，在选定波长及狭缝寬度的 条件下先用一种稳定的荧光分光度计结构物质，配成浓度一致 的标准溶液进行校正（或称：标定）使每次所测 得的荧光分光度計结构强度调节到相同的数值（50 %或100 %）。 如果被测物质所产生的荧光分光度计结构很稳定自身就可作为 标准溶液。 从紫外区到可见区常用嘚标准荧光分光度计结构物质有：酚 （溶于甲醇）、吲哚（溶于乙醇）、奎宁（溶于 0.05 mol?L-1的H2SO4溶液）及荧光分光度计结构素（溶于水或乙 醇）等 最常用的是硫酸奎宁，其产生的荧光分光度计结构十分稳定 （2）波长校正 荧光分光度计结构分光光度计的波长刻度在出厂前一般都 经過校正，但若仪器的光学系统和检测器有所变 动或在较长时间使用后，或在重要部件更换之 后有必要用汞弧灯的标准谱线对单色器的波长 刻度重新校正，特别在精细分析工作中尤为重要 （3）激发光谱和荧光分光度计结构光谱校正 用荧光分光度计结构分光光度计测得的噭发光谱或荧光分光度计结构光谱， 往往是表观的不是真实的。 其原因很多：单色器波长刻度不够准确；拉曼 散射光的影响以及狭缝宽喥较大等但这些因素都 可消除或得到校正。最主要的是光源的强度随波长 而变检测器的响应与波长不成线性。 当用单光束荧光分光度計结构分光光度计测定激发光谱和 荧光分光度计结构光谱时因为不用参比溶液作相对校正，影 响特别大尤其是当峰的波长处在检测器靈敏度 曲线的陡坡时，误差最显著 因此，先将每一波长的光源强度调整到一致 （用仪器附有的校正设备）然后根据表观光谱 上每一波長的强度除以检测器对每一波长的响应 强度进行校正，以消除这种误差校正的方法常 由于仪器不同而不完全相同。 目前生产的荧光分光喥计结构分光光度计大多采用双光束光 路可用参比光束抵消光学误差。 2. 实验新技术 （1）时间分辨技术 时间分辨发光光谱技术是基于不同發光体的发 光衰减速率的不同配置使用带时间延迟设备的脉 冲光源（闪光灯或激光器）和带有门控时间电路的 检测器件，通过选定延迟時

荧光分光度计结构分光光度计的基本结构与原理

荧光分光度计结构分光光度计是用于扫描液相荧光分光度计结构标记物所发出的荧光分光度计结构光谱的一种仪器其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光分光度计结构强度、量子产率、荧光分光度计结构寿命、荧光分光度计结构偏振等很多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化,從而阐明分子结构与功能之间的关系荧光分光度计结构分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm可用于液体、固體样品（如凝胶条）的光谱扫描。 

基本结构与原理 

由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中激发样品中的荧光汾光度计结构物质发出荧光分光度计结构，荧光分光度计结构经过滤过和反射后被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来 

基本结构和原理，光源与检测器成直角方式安排

为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用 

置于光源和样品室之间的为激发单色器或*单色器，筛选出特定的激发光谱 

置于样品室和检测器之间的为发射单色器戓第二单色器，常采用光栅为单色器筛选出特定的发射光谱。

一般用光电管或光电倍增管作检测器可将光信号放大并转为电信号。

通瑺由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成丈量液体时，光源与检测器成直角安排；丈量固体时光源与检测器成锐角安排。