PPAR γ基因RNA干扰质粒的构建与鉴定
目的 构建表达细胞转录因子PPARγ的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究PPARγ参与的细胞信号通路以及PPARγ为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNA干扰质粒.方法 选取PPAR γ基因的19nt特异性序列,设计针对PPARγ的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体中,用EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将包含PPARγ基因的RNAi重组载体转染前列腺癌细胞PC-3.转染48 h后,收集细胞裂解液,Western blotting分析对照组与转染组PPARγ蛋白的表达水平.结果 双酶切证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确；含PPARγ基因的RNAi载体转染前列腺癌细胞PC-3细胞成功；Westernblotting结果显示,与空质粒对照组相比,转染组细胞PPARγ表达下调.结论 成功构建含人PPARγ基因的RNAi载体,为研究PPARγ参与的细胞信号通路提供了稳定转染的RNA干扰质粒.同时,阻断PPAR γ的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点,研究结果为以PPARγ为靶点的基因治疗提供了有利工具.
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10.3969/j.issn.12.03.004
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【求助】关于细菌基因组文库构建！！
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这个帖子发布于11年零269天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位高手，小弟要准备做一个细菌的基因组文库构建，不知道用什么样的载体比较合适？构建细菌基因组文库常用的载体有那些？另外，我在做文库构建前应该做那些准备工作和主要事项？小弟在这方面是个新手，还忘各位高手能多加指点！谢谢了！斑竹，小弟第一次发贴，不知道规范不规范，还忘批评指正！
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你可以用/和.cn/去搜索嘛！很多相关信息！比如下面：（１）文库构建试剂盒及预制文库 为了方便研究者用自己特别的实验材料构建文库，Stratagene提供品种丰富的cDNA合成试剂盒、文库构建载体、包装蛋白抽提物，以及高效感受态细胞。 （注：Stratagene所有感受态细胞产品同时 6折 优惠！） 构建cDNA文库的载体 在lZAPa载体中定向cDNA克隆可使检测到的克隆数增加1倍。原核和真核表达、增加的克隆容量和更多独特的l克隆位点都是ZAP Expressa载体的独特优点。lZAPa-CMV载体可获得高水平的哺乳动物表达。 双杂交载体通过鉴定与目标蛋白相互作用的蛋白进行体内筛选。BacterioMatchTM双杂交系统的独特设计可在细菌中检测蛋白-蛋白相互作用。CytoTrapa双杂交系统可用来研究细胞质而不是细胞核中的蛋白-蛋白相互作用。HybriZAPa双杂交载体具有l文库的优点，并具有快速转变成用于筛选的质粒文库的能力。文库构建试剂盒提供质粒载体。 构建基因组文库的载体 快速基因组步移和限制酶作图都是通过Lambda DASHaII、Lambda FIXaII和SuperCosI粘 粒载体产生末端特异RNA转录物来完成的，这些载体在插入片段两侧含有T3和T7启动子。大基因分离和作图可通过在SuperCos I粘粒上的简单克隆来完成。通过Not I消化l和粘粒载体可产生含有插入片段和启动子的序列盒，从而增加了基因作图的分辨率。 cDNA合成试剂盒 ·构建定向cDNA文库 ·抗体或表达筛选检测到的克隆数增加1倍 定向文库 Stratagene的cDNA合成试剂盒是文库构建的首选。其独特设计可制备能直接定向插入l载体的cDNA。与非定向cDNA克隆相比，使用该试剂盒构建的文库可产生两倍的用于抗体和表达筛选的功能性融合蛋白。 多功能载体 Stratagene的cDNA合成试剂盒经优化，可与各种多功能文库构建载体一起使用。 质量极佳 为了保证每个cDNA合成试剂盒的质量，Stratagene对每一批产品都构建一个l文库，其产量必须3 2.0′106pfu/5mg对照poly(A)+RNA。cDNA合成试剂盒包括构建一定大小、可定向插入载体的cDNA的所有试剂。试剂盒包括Pfu DNA聚合酶，而不是Klenow聚合酶，在连接子相连之前产生平末端cDNA。研究表明，用Pfu DNA聚合酶削平cDNA末端可产生更有效连接子连接反应，从而产生更多的一级克隆。 为了方便选择，Stratagene提供完整的文库构建试剂盒，也单独提供l或质粒载体和Gigapacka包装抽提物。 文库构建试剂盒 ·构建低背景的高代表性大文库 ·易于扩增和筛选文库 ·克隆对大肠杆菌有毒性的基因 ·使用Lambda ZAPa载体从l快速转化成质粒形式 ·包装效率高 质粒文库构建试剂盒 ·质粒载体提供了方便的多克隆位点 ·使用Stratagene的感受态细胞具有最高转化效率 ·提供原核和真核表达载体 PCR文库构建试剂盒 ·构建PCR文库同时保持RNA的复杂性 ·适用于小量珍贵的RNA样品 ? 仅需100ng的总RNA ·用连接非依赖（LIC）克隆方法定向克隆cDNA 应用 ·从有限组织来源构建cDNA文库，例如：激光捕获的显微切片(LCM)或发育相关的组织或细胞样品 ·通过功能分析或核酸探针进行筛选 筛选 ·细菌中卡那霉素抗性 ·哺乳动物细胞G418抗性 pCMV-PCRa载体 哺乳动物表达由CMV早期启动子驱动。SV40多聚腺苷酸化序列提供哺乳动物转录和翻译终止所需的信号。T7和T3启动子可进行PCR转录、测序和PCR。 高效构建PCR文库 PCR文库构建试剂盒由三个独立的组成部分。当作为一个试剂盒一起使用时，可通过逆转录反应从总RNA制备cDNA。用PCR扩增cDNA片段，然后用LIC处理构建定向克隆产物。将产物克隆到高水平哺乳动物表达载体pCMV-PCR中并转化超级感受态细胞XL-Golda，可构建质粒文库。该方法可从有限样品(100ng总RNA)构建代表性好的文库。与之相比，传统文库方法需要至少5-10mg富集的poly(A)RNA。 基因组文库构建试剂盒 构建基因组文库的载体 Stratagene提供用于基因组文库构建的多种策略。对于小基因组生物体，Lambda ZAPaII 和ZAP Expressa载体分别提供10-20kb的克隆容量以及切割单个克隆或完整文库成为多功能噬菌粒载体的能力。Lambda DASHaII和Lambda FIXaII载体适合9-23kb片段的常规基因组克隆。SuperCos1粘粒载体接受30-40kb的插入片段，可用单个克隆中分离大基因。 Stratagene所有用于基因组文库构建的载体都含有T3和T7 RNA聚合酶启动子，用于快速基因步移和高分辨率基因作图。 包装蛋白提取物 Gigapack a III Gold包装抽提物 用于cDNA文库 ·用于获得最大的一级文库 ·无限制活性，防止降解甲基化DNA和含有Eco K位点的插入片段。 ·无内源性限制酶活性，构建更具代表性的文库 GigapackaIII Plus包装抽提物 ·当不需要最高的包装效率时，可选用廉价的GigapackIII Plus抽提物 GigapackaIII XL包装抽提物 用于粘粒和基因组文库 ·用于大的插入片段 ·优先包装47-51kb的重组子 ·产生大的插入片段并减少来自非重组子的背景 ·因为许多来自植物和动物细胞的基因组序列高度甲基化，在包装和铺平板过程中容易被降解，而GigapackIII XL包装抽提物却尤适于构建基因组文库
--------------------------------------------------------------------------------（２）基因组DNA文库构建实验技巧
基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。（2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，
然后以此为参考定位所需的片段。（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。三、载体的选择目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。选用何种载体可以参考如下几个因素：1．目标区域的大小如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。表1 各种载体的比较载体 容量（kb） 宿主 导入细胞方式 黏粒 30-45 大肠杆菌 转导 P1 70-100 大肠杆菌 转导 PAC 130-150 大肠杆菌 电转 BAC 120-300 大肠杆菌 电转 YAC 250-400 酵母 转化 2．筛选文库的难易程度黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。3.载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。
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谢谢了！我再好好研究一下！如果有什么问题，希望您还能怎么帮助我！
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