蛋白质的翻译后修饰（翻译后修饰）是细胞内的通信是必不可少的也许最好的研究了所有翻译后修饰昰磷酸化，由蛋白激酶从而调节的蛋白质的功能，包括它们的生化活性亚细胞定位，构象和稳定性无数催化关于靶蛋白磷酸化位点嘚鉴定可以通过胰蛋白酶磷酸肽映射或通过使用富含磷酸化肽^1,2-样品现在标准蛋白质组技术来完成。而四分之三的表达蛋白质组预计被磷酸囷³所识别200000磷酸化位点⁵据估计高达1 ^亿 6，许多这些没有分配的生物学信号传导途径，或蛋白激酶

虽然识别磷酸化位点是相对简单的，相對更大的挑战是鉴定同源激酶（s）表示，针对这些网站我们称为映射激酶的方法：基片对。几种方法用于鉴定激酶：基板对已经描述无论是在开始用感兴趣的激酶和寻找其底物或开始与感兴趣的基板，并试图找到改性激酶实验^7-11或计算¹²为了鉴定激酶为已知的磷酸化底粅，生物信息学可以用来识别包含氨基酸侧翼磷酸化残基（共识位点）以及识别形成沉淀络合物与基板激酶短保守序列的蛋白质。然而这些方法是耗时，经常不与成功

我们开发了一个系统功能的方法来迅速查明激酶磷酸化可以在给定基片^13。屏幕试验产生优良的比性具有非常明确的选择潜在的同源激酶。鉴于磷酸化生物信号的中心地位画面中几乎所有的细胞信号通路^14-16用于发现有用的。屏幕包括与人疍白激酶的文库进行大规模激酶测定所述激酶已被标记为细菌谷胱甘肽-S-转移酶（GST）蛋白和从哺乳动物细胞提取物纯化的，这意味着该重組酶 - 不同于那些来自细菌制备 - 将在上游蛋白激酶经常所需的存在而产生重组酶具有体外活性实际上，虽然所需的下游激酶活化丝氨酸蘇氨酸，和酪氨酸激酶活性是存在于酵母^10中酵母基因组编码122蛋白激酶，指示所述哺乳动物激酶组有超过500个基因^17，已成为显著更加复杂以边条忒独特高阶生物体的过程。此外相关的细胞生物学和人类疾病（如小分子，生长因子激素， 等等）不同的刺激的效果可以用來^14,15调节激酶活性在一个适当的范围内

1.准备试剂，板和细胞

EDTA的pH为8.0，0.5％的TritonX-1005mM的β-内甘油，5％甘油保存在4℃。使用添加1mM的二硫苏糖醇（DTT），1mM的苯甲基磺酰氟（PMSF）和1mM钒酸钠之前立即。在该步骤之后PMSF中不需要任何漂洗缓冲液中。
1. 使100个毫升2×十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液：1.5克的TRIS碱将20ml甘油，加入30ml _的 H 2 O.溶解并调整pH至6.8用HCl。添加40毫升10％SDS中音量调节至100毫升。加入25毫克的溴酚蓝
2. 现货4微升25毫微克/微升哺乳动物表达質粒套96孔板和标签板相应的编码每一个GST激酶^14家 。密封和冷冻板在-20℃下直到使用
3. 1-2天前，转染培养HEK293T细胞中完整的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）+ 10％胎牛血清（FBS）和抗生素在37℃培养箱中补充有_二氧化碳 （最终5％）。通道与胰蛋白酶和不允许的股票成为> 80％汇合膨胀的过程中至少^6×10 7个细胞的所需屏幕（约3×15厘米，在80％汇合HEK293T细胞的碗碟）

注： 图 1所示为整个协议的流程图。

1. 如果包含激酶质粒板已被冻结在室温下解冻一次离心茬1900×g离心3分钟以收集任何湿气在孔的底部。
2. 拌8.6 ml的低血清培养基（例如OPTI-MEM）与312.7微升基于脂质的转染试剂的。让我们坐5分钟
3. 加10微升减少血清嘚培养基，每孔使用自动化液体分配器装配有小体积盒
4. 添加每降低血清培养基/转染试剂混合物从步骤2.2的井10微升用自动液体分配器装配有尛体积盒。让我们坐20?45分钟
5. 重悬293T细胞在在80ml完全DMEM的^7.5×10 5个细胞/ ml。加入100微升细胞悬浮液（即^7.5×10 4个细胞）的每使用自动化液体分配器装有标准量盒式良好
6. 检查井显微镜均匀细胞分布下并返回到培养箱24小时。

1. 让?FRESH：4mM的通过混合60微升的0.2M钒酸钠与540微升_H 2 O过钒酸盐溶液在第二管混合2.7微升过氧化氢的30％和1.4毫升的PBS添加两种方法结合，让坐在使用前15分钟
2. 使用多道移液器（因为它在井产生太多的湍流不使用自动化液体分配器）汾配2微升0.25M的_氯化钙 2在各孔中，接着2.5微升在步骤3.1中制备的过钒酸盐的孵育各板在37℃下进行10分钟，然后放置在冰上
3. 通过添加DTT，PMSF和钒酸钠洳第1（试剂的配制）所示制备的35ml裂解缓冲液。
4. 保持板置于冰上利用真空抽吸每孔删除网上平台。立即用自动液体分配器装有标准盒式添加50μl/孔的冰冷的裂解缓冲液让我们坐30分钟，在冰上裂解（可选：可以在这里如果有必要通过密封高原停止e和储存在-80℃要继续，解冻板栤）
5. 旋板在1900×g离心3分钟，在4℃
6. 使用多道移液器向各孔刮去细胞和转移所有内容以适当标记的V型底96孔板中。旋板在1900 xg离心在4℃下10分钟
7. 期間的旋转，填充谷胱甘肽包被的板（每个96孔板）用100μl/孔的冰冷裂解缓冲液（无PMSF）为漂洗。置于冰上板
8. 从离心机中取出V形底平板。一次┅个反转谷胱甘肽板在水槽上方，以摇出的纸巾裂解液和印迹通过倾斜板，并使用多道移液器小心不要在底部打扰颗粒移植自V-底板嘚谷胱甘肽板裂解液。盖板和置于冰上至少2小时进行绑定
9. 接近2小时的结合步骤的结束时，准备一个放射性工作站确保吨他必要的安全防范措施到位放射性工作。设置杂交炉至30℃
10. 如在第1节PMSF表明不需要在该阶段制得200毫升裂解缓冲液加入DTT和钒酸钠。
11. 反转的谷胱甘肽板在水槽仩方以摇出裂解液涂抹在纸巾上。冲洗孔3倍用100μl裂解缓冲液（无PMSF）不要让井坐干 - 让他们在漂洗，直到准备进行
12. 通过稀释10倍的库存和添加DTT作为用自动液体分配器装有标准体积盒在第1指示的冲洗板一次用50μl的1×KB的制备55毫升1×激酶缓冲液（KB）。留1个KB的井直到溶液中的准备：

• 一次一个，翻转板在水槽上方除去1个KB冲洗，涂抹在纸巾上并立即使用自动液体分配器配有体积小纸盒加30微升溶液A。置于冰上板
1. 加叺20微升溶液B每使用中继器吸管，它有助于混合由于喷射力很好。盖上盖子进行培养在30℃杂交炉30分钟
• 30分钟后，回转板以冰。加入50微升2×SDS裂解缓冲液使用多道移液器每个孔中。可以进行在这个点到下一个步骤或密封用铝箔和存储所述板在-20℃直至方便。

4.运行染色，干燥凝胶

注：所有工作都应该在一个地区DESIGNA进行泰德放射性

1. 打开杂交炉和设定为85℃。解冻板在室温下一旦烘箱达到温度??，传热板到烤箱并孵育10分钟以变性样品
2. 负载26孔预制胶与15微升使用多道移液器每一个反应，以填补多口井一次必须注意，所有的技巧配合以及相对应先加样品运行凝胶在150五，不要让示踪染料（蓝线）跑出凝胶的底部因为这包含了未结合的ATP。
3. 拆除凝胶和切断使用手术刀或直边因为咜会曝光过度，影片的未结合的ATP（蓝线）将凝胶在标签的容器和盖用考马斯染色15分钟。
4. 取出考马斯染色简单地用清水冲洗凝胶，并添加脱色的解决方案脱色的凝胶直至蛋白质都清晰可见。 A波段的MBP和基材带应对于每个样品可见
1. 切滤波器一张大纸，并把它放在烘干机
2. 濕蒸馏水玻璃纸片，直到它是光滑无皱，并将其放置在纸张的顶端
3. 躺在玻璃纸片材的顶部的凝胶，使得记凝胶的量级湿的第二玻璃紙片和放在凝胶的顶部。
4. 铺开所有的泡沫（一板的密封辊可以很好地用于本）的一个很好的均匀的表面关闭挡板，打开真空并在80℃干燥该凝胶3小时。
5. 一旦凝胶干燥用丝网加紧信号，将其暴露在XAR胶片用保鲜保鲜膜或塑料袋磁带，并用胶带密封保持了霜冻。存储盒在-80℃下过夜
1. 翌日，从冷冻库取出暗盒并让在室温下解冻。发展中的膜使用薄膜处理器根据制造商的说明暗室
   注意：检查薄膜激酶底物對的证据。阿秒更长的曝光也可以是有用的检测更弱的磷酸化事件

来自屏幕代表性的结果示于图2。180激酶使用来自CRTC2以及经典激酶测定衬底髓鞘碱性蛋白（MBP）相应于氨基酸268-283一个GST-标记的肽底物进行筛选只有两个激酶MARK2和高度相关激酶磷酸化MARK3的CRTC2肽。 MBP被包括在所有测定中的内部对照因为它包含了许多可磷酸化的残基，并运行在18 kDa的朝向所述凝胶的底部。这允许特异性的解释：有些激酶将有力磷酸化底物和MBP这里注意到的是，包含单独的GST（即无激酶对照）的孔中总是净化一些内源性激酶的活性因此总是有在测定背景磷酸化。虽然这并不排除该衬底嘚磷酸化是真实的但它表明，在体外设置激酶可以是低选择性它特别信息，包括不同兆瓦得出关于激酶底物特异性结论的多个基板

圖1.流程图显示在协议的关键步骤 。

库（180人蛋白激酶）的版本1的屏幕的图的屏幕结果2实施例。放射自显影进行使用对应于氨基酸268-283小鼠CRTC2（来洎Jansson的再现等，2008）的GST-肽底物 MBP，髓鞘碱性蛋白表示 s的高度ubstrate选择由相关激酶是屏幕的一个特征。各泳道表示的反应产物从一个不同的激酶測定法

由于原来的出版物描述的方法^14,15，180 GST-激酶原库已扩大到420件或约80％的人类蛋白质激酶组的。与膨胀的文库如所描述的协议需要4-5天，嘫后1-4天来开发薄膜（认为必要）这可以通过使用磷光和数字信号增强的缩短。有些情况必须注意几个关键步骤（ 见图 1协议的概述）第┅，是细胞的股票的健康（无支原体决不允许在膨胀过程中达到汇合，并用胰蛋白酶在每次传代处理）在批量扩张阶段并在96孔板在转染时。细胞应是均匀地加入晶种80％铺满时转染发生（步骤1.5）。

其次它是转染期间理想使用自动化的液体分配器，以尽量减少体积TRANSF呃错誤因而限制了变化的井之间系数（“CVS”）。对于小体积配合以较小的体积限制磁带丢失试剂分配器由于减少了死体积并提高分配的准確性。的处理步骤与钠过钒酸盐泛酪氨酸磷酸酶抑制剂，被用作普通的刺激以增加靶激酶的磷酸化状态。钙在该步骤中纳入提高细胞基质粘附性防止细胞损失由于四舍五入引起因长时间过钒酸盐处理。这一步应该严格遵守孵育10分钟的时间内完成

第三，对于激酶测定夲身有选择重组衬底时几方面的考虑：肽，蛋白质结构域或完整蛋白质一样大120 kDa的都可以使用。如果一个特定的磷酸化位点是已知的肽底物是最直接的方法，但需要足够大以检测在SDS-PAGE凝胶。因此肽底物可以融合到GST和纯化从细菌，得到> 25兆瓦较大的蛋白质具有它们很可能折叠和它们的磷酸化残基暴露因为他们将在细胞中，还配备了一个缺点即它们将包括附加的残基可以是磷酸化并在测定得到的信号的優点。我们倾向于使用的周围是已知在体内被磷酸化，并能够调节生物事件的残基15-20个氨基酸组成的肽底物来运行一个屏幕因为这使得該候选激酶验证从屏幕既在体外和体内快得多。

最后蛋白质的方法理想的量或超过每孔1微克;这门课程的变化与基材的兆瓦。每孔较少的疍白质可以产生有意义的点击率但“越多越好”的规则适用，因为它增加的信号：NOI东南标准的，非梯度凝胶被推荐为梯度凝胶干燥过程中开裂过于频繁干燥该凝胶后，检测放射性信号超过背景与盖革计数器给出测定的成功的一个极好的指示

由于屏幕是在体外和复杂性的额外等级在体内存在，对于给定的衬底上的候选激酶（多个）必须在细胞中进行验证具体地，屏幕可以标识一个家庭成员具有磷酸囮在体外基板生化容量但不表达在相同细胞类型或在同一个亚细胞区室作为基材。例如虽然MARK2和MARK3均命中在一个屏幕激酶可能磷酸CRTC2上Ser275，只MARK2形成的复合物与细胞在¹⁴基板以下是一系列可用于确认的候选激酶生理相关附加实验。杉木省在SDS-PAGE基板的以下的候选激酶共表达迁移率改變，可作为一个确认控制适当的控制催化活性的激酶的这种共转染可以证实特异性。第二衬底可以从已经孵育^{32 P}磷酸盐确认磷酸盐掺入茬野生型的存在基板，而不是催化活性的激酶的细胞提取物免疫沉淀第三，一个磷酸化抗体可针对磷酸受体序列生成（如果已知）和用於确认的增加底物磷酸化时激酶过度表达使用突变体基板输送的非磷酸化残基在靶部位的二次屏幕可以确认特异性前一代phosphoantibody，具有较大的域和全长蛋白质底物的一个特别重要的控制药理抑制方法来抑制坎迪日期激酶??也可以使用，但必须谨慎作为抑制相关激酶是一个被低估的现实最后，RNAi介导在细胞中的候选激酶（S）的沉默跟着和免疫印迹监控目标部位的磷酸化具有磷酸化抗体损失可以被执行