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FDTD方法在电大尺寸复杂目标电磁散射计算中的应用
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关注微信公众号[发明专利]H5亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株的构建及其应用在审
申请/专利权人：
公开/公告号：CNA
发明/设计人：;;;;;;;;
公开/公告日：
主分类号：
分类号：;;;;;;
搜索关键词：
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国兽医药品监察所，未经中国兽医药品监察所许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【】
【说明书】：
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察无绿色荧光的蚀斑，挑选单个无荧光蚀斑于0.5ml M199营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，获得重组病毒并将该病毒被命名为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus)rDEVΔUL2-H5株，该株病毒已于日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13794。实施例2——鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5的鉴定1.采用ORF C17F和ORF C17R(序列4和序列5)引物(见表1)进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，HA基因成功插入到UL2基因内。2.重组病毒rDEVΔUL2-H5病毒含量测定重组病毒rDEVΔUL2-H5接种CEF，细胞病变达70％～80％时收获，冻融1次后用CEF测定病毒含量，为105.8TCID50/0.1ml。3.动物试验将30只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组10只。第1组肌肉注射rDEVΔUL2-H5，每只1000TCID50，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID50，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后21天，翅静脉采血后，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况。攻毒对照组100％死亡，免疫100％保护，血清中禽流感病毒H5HI抗体效价几何平均值为1:64，说明重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H5株具有良好的免疫原性。实施例3——疫苗的制备本发明所提供的制备疫苗的方法，是将重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5)接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞(SPF CEF)，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。1.细胞制备：选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。2.病毒液的制备：按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒重组鸭肠炎病毒(rDEVΔUL2-H5)接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72h，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。3.半成品的检验(1)无菌检验：每组分别取样，按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一五年版(三部).中国农业出版社，2016，本发明称《中国兽药典》)的方法进行，应无菌生长。(2)病毒含量测定：每0.1ml病毒含量≥105.0TCID50。4.配苗及分装：将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。5.冻干：分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)附录437页迅速进行冷冻真空干燥。实施例4——疫苗检验本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》)的方法进行。(1)性状：淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。(2)无菌检验：按《中国兽药典》进行检验，均无菌生长。(3)支原体检验：按《中国兽药典》进行检验，均无支原体生长。(4)外源病毒检验：按《中国兽药典》进行检验，均无外源病毒污染。(5)鉴别检验：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60min后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组全部出现病变，中和组未出现细胞病变。(6)安全检验：用21日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，均全部健活。(7)效力检验1)鸭肠炎病毒部分病毒含量测定：每羽份病毒含量为104.4TCID50。用鸭检验：对照鸭5/5死亡，免疫鸭10/10保护。2)H5亚型禽流感病毒HA蛋白部分病毒含量测定：每羽份病毒含量为104.4FAID50。(8)剩余水分测定：按《中国兽药典》规定方法进行测定，剩余水分为3.1％、3.0％、2.9％、3.0％，符合规定。(9)真空度测定：按《中国兽药典》规定方法进行测定，均出现紫色辉光，符合规定。实施例5——重组病毒rDEVΔUL2-GFP的应用根据GenBank公布的鸭H5亚型禽流感病毒HA基因序列，人工合成HA基因(序列7)，通过NheI和BamHI插入到质粒pT-UL2-GFP-gpt中，获得重组转移载体pT-UL2-H5。按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL2-H5与rDEVΔUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。经蚀斑纯化，获得的重组病毒rDEVΔUL2-H5株。H5亚型禽流感病毒HA基因序列(序列7)序列表&110& 中国兽医药品监察所&120& 一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法&130&&160& 7&170& Patentin version 3.5&210& 1&211& 29&212& DNA&213& 人工序列&223& 对人工序列的描述：扩增UL2基因左同源臂的上游引物UL2uF&400& 1GCGAATTCTG GCGGACTTGT GTAGTTTGC 29&210& 2&211& 29&212& DNA&213& 人工序列&223& 对人工序列的描述：扩增UL2基因左同源臂的下游引物UL2uR&400& 2GCGTCGACGG ATCGCATGTA GACGTTGGT 29&210& 3&211& 26&212& DNA&213& 人工序列&223& 对人工序列的描述：扩增UL2基因右同源臂的上游引物UL2dF&400& 3ATGTCGACCG CTGGCGCACC ACAAGG 26&210& 4&211& 28&212& DNA&213& 人工序列&223& 对人工序列的描述：扩增UL2基因右同源臂的下游引物UL2dR&400& 3GCAAGCTTCG AACCGCATTA GGCGACAA 28&210& 5&211& 20&212& DNA&213& 人工序列&223& 对人工序列的描述：鉴定用上游引物F1&400& 5ATGGAGAAAA TAGTGCTCCT 20&210& 6&211& 22&212& DNA&213& 人工序列&223& 对人工序列的描述：鉴定用下游引物R1&400& 6TTAGATGCAA ATTCTGCATT GC 22&210& 7&211& 1714&212& DNA&213& 人工序列
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