可快速检测食品中军团菌的PCR试剂盒 （实时荧光PCR法）
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军团菌PCR检测试剂盒（实时荧光PCR法）
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产品详细说明
通用名称：军团菌PCR检测试剂盒
英文名称： PCR diagnostic kit for Legionella spp.
【使用方向】
军团菌PCR检测试剂盒是快速准确的定性检测水中军团菌数量的试剂盒，天津生物芯片PCR 联合酶联免疫检测扩增后样品的原理，开发了检验灵敏度高的产品，样品中细菌浓度达10³cfu/ml就可是实现直接检验。PCR 过程中，一段特殊的DNA 片段被扩增然后通过和标记生物素的探针杂交来检测。通过底物酶的培养后，样品的结果可以通过肉眼判别或者酶标仪来读取。本试剂盒使用嗜肺军团菌及军团属的特异引物，可与样本中的嗜肺军团菌及军团属基因组的相应靶位点特异性结合，利用PCR反应达到对嗜肺军团菌及其他军团菌快速检测的目的。试剂盒具有特异性强的特点，可以将嗜肺军团菌及其他军团菌从其它细菌中特异地区分出来。基于
军团菌PCR检测试剂盒用于食品、饮用水、临床样品以及环境样品中的嗜肺军团菌及其他军团菌的检测。
【样品处理】
1. 取可疑菌落于高压灭菌的装有1ml去离子水的离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。
2. 加入200&l无菌水，充分混匀，12000rpm离心2min，弃上清。
3. 加入80&l核酸提取液，用移液器吹吸混匀，50℃水浴1小时，100 ℃ 水浴15分钟，冰上放置10分钟后12000rpm离心3min。
4. 取上清液用于PCR检测。
【使用方法】
1.&&&&&& 试剂配制（试剂准备区）
从军团菌PCR检测试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阳性对照品+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管20&l。每个反应体系试剂用量：PCR反应液19.7&l ，Taq酶0.3&l
2.&&&&&& PCR扩增（扩增和产物分析区）
将样本、阴性对照品和阳性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个
PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品和阳性对照品各5&l，震荡混匀，于2000rpm
离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约
3.&&&&&& 结果判断（扩增和产物分析区）
从PCR管中取出2&l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在紫外灯下，阴性对照品没有任何条带；军团菌阳性对照品具有大小为270bp和354bp的两条带；其中270bp的条带为军团菌属特异的条带，而354bp则为嗜肺军团菌种特异的条带。当被检样品经电泳检测出现仅出现270bp大小的条带时则属于军团菌（非嗜肺军团菌）阳性，若出现270bp和354bp的两条带则属于嗜肺军团菌阳性；当未出现条带或所出现的条带大小与阳性对照品的条带大小不一致时均视为阴性结果。
【注意事项】
1.&&&&&&&& 本试剂盒不做临床诊断。
2.&&&&&&&& 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，试验人员必须进行专业培训，实验过程中严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区用品不能交叉使用。
3.&&&&&&&& 样本准备和试剂准备阶段应使用生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器。
4.&&&&&&&& 对每次实验进行质量控制。
5.&&&&&&&& 试剂使用前要完全解冻，并混合均匀，但应避免反复冻融。
6.&&&&&&&& 样本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。
7.&&&&&&&& 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。
8.&&&&&&&& 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
【军团菌PCR检测试剂盒主要组成部分】
军团菌PCR检测试剂盒
核酸提取液
军团菌 PCR反应液
军团菌阳性对照品
阴性对照品
【储藏条件及有效期】&&&&
-20℃保存，避免反复冻融，有效期一年。
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地址天津经济技术开发区宏达街23号空调冷却塔水嗜肺军团菌污染调查及其生物传感器快速检测方法的研究--《中国疾病预防控制中心》2010年硕士论文
空调冷却塔水嗜肺军团菌污染调查及其生物传感器快速检测方法的研究
【摘要】：
近年来,随着人们生活水平的提高,军团病的发病率有着明显的上升趋势。1976年美国首次爆发“军团病”以来,已经有多个国家有军团病的报道。我国1982年在南京首次证实军团病病例。军团菌主要生长在各种有水的环境中,尤其在空调系统、供水系统中较为常见。我国多个城市对空调冷却塔进行军团菌调查发现其中军团菌的阳性率为50%-80%。空调冷却塔水军团菌污染对于人类健康存在潜在的威胁。目前我国军团菌的检测依然以细菌分离培养法为主,培养周期较长,不利于军团病的预防和控制。本课题对南方某城市中央空调冷却塔水军团菌污染状况作了相关调查与分析,同时对分离的菌株进行了分子分型研究,建立了分子流行病学资料。另外,本课题还初步建立了光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌的方法,为大样本量Lpl污染严重水样的现场快速筛查提供了一个新的方向。
1.对南方某城市酒店和宾馆、商场和超市、医院、写字楼等公共场所的空调冷却塔水进行军团菌的分离培养,了解军团菌的污染状况。初步了解空调冷却水军团菌污染状况与水温、细菌总数、空调使用年限、空调冷却塔水消毒情况等因素之间是否存在一定联系。
2.用SBT分型技术对常规分离培养出的嗜肺军团菌菌株进行分子生物学分型,分析分离菌株的多态性,确定菌株的遗传基础之间相互的联系和变异,了解该城市军团菌分布流行病学特征。
3.利用光纤倏逝波生物传感器适合现场快速检测的优势,初步建立1型嗜肺军团菌的快速检测平台。对该方法的检测条件进行优化,并在最佳检测条件下确定检测的灵敏度和特异性,并对人工感染样品进行检测,同时用传统方法进行计数,确认该方法的可行性。
研究内容与方法
1.采用平皿计数法对中央空调冷却塔水进行军团菌的分离培养,用血清学方法对分离菌株进行初步鉴定。检测冷却塔水水温、细菌总数,调查空调冷却塔的使用年限及消毒情况,分析其与军团菌检出之间是否存在一定联系。
2.采用SBT基因分型技术(按照EWGLI标准)对所分离菌株进行分子分型。提取菌株基因组DNA,测定DNA在260nm,280nm处的吸光度值,计算DNA浓度。分别扩增7个管家基因(flaA、pile、asd、mip、momps、proA、neuA)的内部核酸序列片段,从394-710bp。获得的PCR扩增产物均进行纯化,并对纯化后产物测序。将测序结果上传至EWGLI数据库比对,得到菌株的等位基因图谱,确定分离菌株的序列分型。菌株ST分型结果利用MEGA4软件,按UPGMA绘制进化树,得到菌株的树形聚类图,观察菌株之间的相似度,分析菌株的亲缘关系。
3.研究光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌的方法,根据双抗体夹心免疫反应原理建立了Lp1的检测平台。利用Alexa Fluor 647荧光染料标记检测抗体,标记后的抗体分装后-20℃避光保存备用。将光纤用异丙醇清洗后用链霉亲和素包被,生物素标记的捕获抗体与链霉亲和素作用后发生亲和素-生物素放大反应,更有效地将捕获抗体连接到光纤上。在此基础上,对检测的最佳条件进行了优化,包括：捕获抗体与目标物的最佳反应时间,反应体系与检测抗体的最佳反应时间,捕获抗体的最佳浓度,检测抗体的最佳浓度等。在最佳检测条件下,确定检测Lp1的灵敏度和特异性,同时通过检测人工感染样品确认该方法检测实际样本的灵敏度和特异性,初步建立了Lp1快速检测方法。
1.22户公共场所中有19户检出军团菌,阳性率高达86.4%；54份空调冷却塔的水样中有31份检出军团菌,总检出率为57.4%。不同类型场所采集的水样军团菌检出率无统计学意义(P0.05)。检出的菌株均为嗜肺军团菌,其中Lp1型占35.5%,Lp2-14型占64.5%。不同冷却塔水温、水样菌落总数、空调使用年限、水样消毒与否对军团菌检出率影响均不显著(P0.05)。
2.采用SBT基因分型技术对分离的嗜肺军团菌进行分子分型,31株分离的嗜肺军团菌共得到19种SBT分型。其中11株Lp1共有分为5种ST型别,分别为ST1、ST159、ST160、ST154、ST52。其中ST1型5株,占45.5%,ST159型2株,其他ST型别各1株。20株Lp2-14共分为14种ST型别,其中数据库已知型别为ST242、ST152、ST8、ST367、ST560五种,其中ST242有5株占30%,还有a～f五种新ST型别各一株,Oa、Ob、Oc型别只扩增出6种基因,其中Oa有3株,Ob和Oc各1株。
3.应用MEGA4软件对菌株的ST分型按UPGMA绘制进化树。对7个基因均扩增出的26株分离株遗传聚类分析结果显示可以将其分为两个同源谱系。其中2株ST159型、1株ST54型、1株ST160型及1株未知型别e属于一个同源系,提示有一定的亲缘关系；余下的序列型归属于另一个同源系。另外,结果还揭示了对于嗜肺军团菌来说,不同血清型菌株也有可能起源于同一个遗传祖先,具有相同ST型别的菌株也可能有不同的起源。
4.光纤倏逝波生物传感器可以在40min之内自动完成检测。捕获抗体与目标物最佳反应时间、反应体系与检测抗体的最佳反应时间均为l0min,捕获抗体最佳使用浓度是100μg/ml,检测抗体最佳使用浓度为20μg/ml。在此条件下得到该方法检测Lpl的灵敏度为1.8×103cfu/ml。同时该方法对于Lpl检测的特异性强,13株其他血清型嗜肺军团菌,2株非嗜肺军团菌及4株非军团菌检测结果均为阴性。本实验通过对环境分离的31株菌制备的模拟样品的检测确认了该方法检测实际样本的灵敏度和特异性。检测结果显示样品中Lpl菌浓度在1.8×103cfu/ml以上时阳性率为100%；低于灵敏度,但浓度接近于1.8×103cfu/ml时,一份样品的3次检测中可能有1-2次结果为阳性。另外,Lp2-14型菌液模拟样品的检测结果均为阴性。
本研究在南方某城市公共场所内获得了中央空调冷却塔水中军团菌的现场流行病学资料,为比较研究提供了可靠数据。同时对分离的嗜肺军团菌进行了SBT分型,有利于了解菌株的多态性及其遗传基础之间相互的联系和变异,为制订该城市军团菌的监测防治措施和控制军团病爆发流行提供科学依据。另外,本课题还初步建立了光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌的方法,为大样本量Lpl污染严重水样的现场快速筛查提供一种新途径。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：R123.1【目录】：
缩略语表4-6
中文摘要6-9
ABSTRACT9-14
第一章 绪论14-30
1 嗜肺军团菌及其检测研究进展14-23
2 生物传感器研究进展23-29
3 本课题的研究意义29-30
第二章 南方某城市集中空调冷却塔水军团菌污染现状调查与分析30-37
1 材料与仪器30
2 方法30-31
3 结果与分析31-35
4 讨论35-37
第三章 分离的嗜肺军团菌序列分型(SBT)的初步研究37-48
1 材料与仪器37
2 方法37-40
3 结果与分析40-45
4 讨论45-48
第四章 光纤倏逝波生物传感器快速检测1型嗜肺军团菌48-65
1 材料及仪器48-51
2 方法51-56
3 结果与分析56-62
4 讨论62-65
研究结论65-66
参考文献66-71
文献综述:光纤倏逝波生物传感器在微生物检测中的应用71-82
个人简历83
发表论文情况83
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【参考文献】
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意见建议：
第一：与小儿的免疫功能一定关系,患有反复呼吸道感染的病儿,也可引起继发性免疫功能下降,需要进一步的检查.如有免疫功能缺陷者,可根据化验结果进行免疫刺激疗法,用胸腺素,转移因子等,有体液免疫缺陷者可应用适量的丙种球蛋白.
第二：与小儿的营养状况有密切关系,尤其是合并有营养不良,佝偻病,缺铁,缺锌的小儿更易反复呼吸道感染.头发或血的微量元素等检查,结合全身情况作出评价.如查出体内微量元素不足,要及时找出营养缺乏的原因,并应在有经验的医生的指导下进行防治.一般原因为孩子生长速度过快,喂养不当或孩子经常患病等原因造成.此时要有针对性的予以纠正,同时也要遵医嘱进行适量的营养素的补充.
问急宝宝17个月肺炎嗜肺军团菌不发烧这病多严重？一般多...
职称：医师
专长：子宫肌瘤
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问题分析：您好考虑孩子是否支原体感染的如果是支原体感染意见建议：病程长发热有的可能会10天左右的建议抗生素用阿奇霉素配合头孢类抗生素静点观察看看
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评价成功！重庆市公共场所水环境嗜肺军团菌污染研究
Legionella Pneumophila Contamination in Water System in Public Places of Chongqing
目的 了解重庆市公共场所水系统嗜肺军团菌污染现状,监测公共场所水系统清洗消毒效果,为卫生监督管理提供依据.方法 依照卫生部《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(2006年)附录A方法(前)和《公共场所集中空调通风系统卫生规范》WS 394-2012附录B方法(实施),采集本市多家公共场所冷却水、冷凝水、冷冻水、温泉水、淋浴水、游泳池水、生活用水等共399件水样品,进行嗜肺军团菌检测以及菌型分布检测.结果 在399件样品中检出44件阳性,阳性率为11.0％;空调系统水嗜肺军团菌阳性检出率逐渐下降(29.0％/15.6％/9.0％),差异有统计学意义(x2=8.53,P＜0.05);空调系统水嗜肺军团菌检出率高于生活水嗜肺军团菌检出率(13.9％/7.1％),差异有统计学意义(x2=4.608,P＜0.05);检出44株嗜肺军团菌,其中LP1型有32株(72.7％);LP2-14型有12株(27.3％).结论 本市公共场所水系统中存在嗜肺军团菌污染,应加强公共场所水系统的清洗消毒,严格监管.
Abstract：
Objective To see Legionella pneumophila contamination in water systems in public places of Chongqing and provide evidences for hygienic supervision and management.Methods According to related national regulations,a total of 399 water samples including cooling water,condensate water,chilled water,thermal water,shower water,swimming pool water and drinking water were collected from public places,and Legionella pneumophila and its serotypes were tested.Results Legionella pneumophila in water samples was detected from 44 (11.0％) samples.Positive rates of Legionella pneumophila in air-conditioning system water were gradually decreased (29.0％/15.6％/9.0％),and the differences were statistically significant (x2 =8.53,P ＜ 0.05).The positive rate of Legionella pneumophila in air-conditioning system water was higher than that in life water (13.9％/7.1％),and the difference was statistically significant (x2 =4.608,P ＜ 0.05).44 strains of Legionella pneumophila were detected,including 32 (72.7％) LP1 strains and 12 (27.3％) LP2-14 strains.Conclusion Legionella pneumophila contamination exists in water systems of public places in the city.Cleaning and disinfection of public water systems should be enhanced,and supervision should be tightened.
重庆市疾病预防控制中心微生物检测所 重庆400042
年，卷(期)
Keywords：
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