[发明专利]作为高甘油三酯血症标记物的大肠杆菌在审
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【说明书】：
按一套共3个方案，研究了ob/ob小鼠来源的大肠杆菌对常规瘦小鼠的定居。对于每个方案，从法国拉尔布雷勒的查尔斯河实验室购得8周龄雄性C57BL/6J小鼠。将小鼠分别圈养，在12h/12h光/暗循环下，让小鼠自由获取普食(Kliba3437，瑞士ProvimiKlibaNafag公司)和Vittel水。在2周适应后，将小鼠分配到两个重量匹配的组之一。第1组接受Vittel水，第2组接受加入108CFU/mL大肠杆菌的饮用水，长达65天。每周记录体重、水和食物摄取两次。从基线(第0天)至补充周期结束(第63天)，使用EchoMRITM3-in-1(德克萨斯州休斯敦声望医疗系统公司(EchoMedicalSystems,Houston,TX))在清醒状态下测量身体组成。在第-3天、第+3天，然后在处理期间两周一次，对来自粪便的肠杆菌科计数。在处理结束时，小鼠：1)过夜空腹后处死，2)空腹6小时后接受口服葡萄糖耐量测试(OGTT)，或3)过夜空腹后接受口服脂质耐量测试(OLTT)挑战。所有小鼠均在第66天处死。通过切开尾部测量血糖，然后用异氟烷麻醉小鼠。从腔静脉取血液样品收集于涂有EDTA的管中，通过离心收集血浆并储存在-40℃下直到分析。对脂肪组织、肝脏、肠和盲肠内容物称重，快速冷冻于液氮中，并储存在-80℃的冷冻机中以待进一步分析。进行两个独立的实验，每个实验组使用总共12只动物。从ob/ob小鼠粪便分离、制备和检测大肠杆菌将8只ob/ob小鼠的粪便接种于肠杆菌科特异性Drigalski培养基上。每只小鼠选择一至两个肠杆菌科菌落，用API20Egallery(法国生物梅里埃公司(Biomerieux,France))分析。将来自相同菌落的DNA通过肠细菌基因间重复共有序列-PCR(ERIC-PCR；参见例如Dalla-Costaetal.,J.Med.Microbiol.,47:227-234(1998)(Dalla-Costa等人，《医学微生物学杂志》，第47卷，第227-234页，1998年))和基因外重复回文序列(REP)PCR比较遗传同一性[20,21]。在用LB培养基制备的有氧悬浮液中，对选择的大肠杆菌菌落计数。通过将预培养物加入15mLLB培养基，从冰冻甘油储液制备新鲜大肠杆菌悬浮液，每周两次。使预培养物在37℃下生长6至8小时。然后，将2.5mL饱和预培养物溶液加入两个装有250mLLB培养基的烧瓶中，使培养物过夜生长。第二天早上，将细菌溶液以5000×g(4℃)离心5min，将细菌沉淀物重悬在最终体积为2.5L的Vittel水中，然后供应给小鼠。为确认大肠杆菌成功定居，通过将不同稀释度的新鲜粪便悬浮液接种在半选择性培养基(Drigalski生长培养基)上进行富集来定量粪便中的大肠杆菌水平。此外，盲肠大肠杆菌使用大肠杆菌特异性引物进行定量PCR来定量，并与总细菌含量进行比较。PCR扩增的引物和条件在表1中示出。表1.用于检测细菌的引物序列和PCR条件“F”代表正向引物。“R”代表反向引物。口服葡萄糖耐量测试(OGTT)OGTT在处理期结束时在光循环中食物剥夺6小时后进行。使用AscensiaEliteXL血糖仪(瑞士苏黎世拜耳公司(BayerAG,Zurich,Switzerland))测量通过切开尾部而获得的血液中的空腹葡萄糖浓度后，在时间0点通过经口灌服给动物供应30％葡萄糖溶液，剂量为2g/kg(重量/体重)。在15、30、60和120min后测量血糖。在0、15和60min也将血液收集在涂有EDTA的管中以进行胰岛素分析(德国汉堡IBL公司(IBL；Hamburg,Germany))。口服脂质耐量测试(OLTT)在独立的实验中，经大肠杆菌处理的小鼠和对照小鼠在过夜空腹(14小时)后进行OLTT。与OGTT一样，在处理期结束时进行OLTT。动物在时间0点通过经口灌服接受6ml/g(重量/体重)玉米油。在0、60、120、180和240min将血液收集到涂有EDTA的管中，以进行甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)分析。TG和NEFA分别使用购自法国的生物梅里埃公司和维吉尼亚州里士满的和光诊断公司(WakoDiagnostics(Richmond,VA))的商业化试剂盒测量。血浆和组织分析使用COBASC111(德国曼海姆的罗氏诊断公司((RocheDiagnostics,Mannheim,Germany))测量血浆甘油三酯、总胆固醇、非酯化脂肪酸(维吉尼亚州里士满的和光诊断公司)、β-羟基丁酸(德国诺伊斯的和光化学公司(WakoChemicalsGmbH,Neuss,Germany))。使用商业化试剂盒测量血浆胰岛素(德国汉堡的IBL公司)和LPS-结合蛋白(ELISA-LBP；#CKM043；马萨诸塞州坎顿的细胞科学公司(CellSciences,Inc.；Canton,MA))水平。血糖通过切开尾部使用AscensiaEliteXL血糖仪(瑞士苏黎世的拜耳公司)测量。血浆炎症标记物在MSD小鼠TH1/TH29-Plex超灵敏试剂盒平板(马里兰州盖瑟斯堡的MSD公司(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,Maryland))上测量。使用制造商的说明实施检测。根据Folch等人的研究[22]从200mg冰冻肝脏提取脂质。胆固醇使用商业化试剂盒(德国曼海姆的罗氏诊断公司)遵照制造商的说明测量。TG首先在碱性溶液(0.5N的KOH乙醇溶液)中水解，然后使用商业化酶TG分析试剂盒(法国的生物梅里埃公司)遵照制造商的说明测量。mRNA表达分析总RNA使用AgencourtRNAdvance组织试剂盒(德国贝克曼库尔特Agencourt(Agencourt,BeckmanCoulter,Germany))根据制造商提供的方案从50mg肝脏或肠段制备。使用第1链cDNA实时PCR合成试剂盒(AMV；瑞士巴塞尔的罗氏生物医学公司(RocheBiomedical,Basel,Switzerland))以oligod(T)15作为引物对1.5μg总RNA进行逆转录。实时逆转录-PCR分析在荧光温度循环仪(PCR5700序列检测系统，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))中进行。引物序列在表2中列出。表2.用于RNA表达分析的引物序列和PCR条件。“F”代表正向引物。“R”代表反向引物。统计分析数据以中值±中值的标准误差示出。将在独特时间点获取的结果通过Wilcoxon检验评估，而将双尾非参数检验(Mann-Whitney检验)用于比较处理与对照组。为分析大肠杆菌对体重和体重增加的影响，应用了混合效应建模(重复测量)。结果遗传性肥胖(ob/ob)小鼠的肠道末端部分和粪便中的大肠杆菌水平增加。通过定量PCR技术检查ob/ob小鼠和以C57BL/6J为背景的野生型小鼠的肠腔内容物，结果显示ob/ob和野生型小鼠中的总细菌数类似(表3)，而肠道末端部分(即，盲肠、结肠和粪便)中大肠杆菌的比例在ob/ob中比在瘦小鼠中分别高2.0、3.1和2.9logCFU/g。为评估过度代表的菌株(over-representedstrain)在功能上是否可能与肥胖症相关，从这些小鼠分离大肠杆菌。为此，将8只不同ob/ob小鼠的粪便加入肠杆菌科选择性培养基，并在选择性条件下生长。所有生长的菌落通过在API20Egallery上分析被鉴定为大肠杆菌。用ERIC-PCR和REP-PCR比较所有克隆的遗传同一性，结果显示所有菌落具有相同的分子标记(molecularsignature)。由于这些技术未显示不同分离株之间的任何差异，挑取来自显示出最高体重的小鼠的单个菌落进行以下实验。表3.ob/ob小鼠和野生型对照小鼠胃肠道中的总细菌和大肠杆菌计数。数据以中值±中值的标准误差示出。*p&0.05，**p&0.01(Wilcoxon检验)，n＝5只小鼠/组。为测试从ob/ob小鼠分离的大肠杆菌菌株的可能生理影响，让野生型常规普食饲养的小鼠自由获取含108CFU/mL大肠杆菌的水65天。每周测量水摄取两次，补充大肠杆菌未见差异(表4)。表4.累积水和食物摄取/效率。
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& 鸡大肠杆菌计数方法研究
鸡大肠杆菌计数方法研究
用OD值测量大肠杆菌菌液浓度
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.):　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　
鸡大肠杆菌计数方法研究
陶海静　(郑州牧业工程高等专科学校生物工程系,河南郑州450011)
摘要　寻求一种简单、快捷的大肠杆菌计数方法。采用分光光度计测定经鉴定的大肠杆菌悬液的OD值,同时通过直接涂片计数法计算大肠杆菌数。细菌悬液经适当浓度稀释后OD值在0.1～1.0范围内,细菌悬液的OD值与活菌数之间成直线关系。利用OD值测定大肠杆菌数目是一种简单、快捷的细菌计数方法。关键词　大肠杆菌;OD值;计数法中图分类号　S858.31　　文献标识码　A　　文章编号　07)27-08504-01StudyontheCountingMethodofE.coliinChickenTAOHai2jing　(DepartmentofBiologicalEngineering,ZhengzhouCollegeofAnimalHusbandryEngineering,Zhengzhou,Henan450011)Abstract　TheobjectiveoftheresearchwastoseekasimpleandrapidcountingmethodofE.coli.TheODvalueofE.colisuspensionthatwasidenti2fiedwasdeterminedbyspectrophotometerandE.colinumberwascalculatedbydirectsmearcountingmethod.WhentheODvalueofbacteriasuspensiondilutedbyappropriateconcentrationwasintherangeof0.1～1.0,theODvalueofbacteriasuspensionandnumberwereinlinearrelation.DeterminingE.colinumberbyusingODvaluewasasimpleandrapidbacteriaod.Keywords　E.ODCountingmethod
　　在养鸡生产实践中,要细菌性疾病之一[1-2]。[3]苗[4]。,用计数器计数时,为寻求一种简单、快捷的计数方法,笔者尝试利用OD值进行细菌数目的测定。结果表明,利用OD值计数法,只要提前将其标定便可长期使用,不受时间和其他因素的限制,因此不失为一种简单、快捷的细菌计数方法。
1　材料与方法1.1　供试材料
1.1.1　鸡大肠杆菌增菌培养基制作。葡萄糖3g,磷酸氢二钾2g,磷酸二氢钾1g,氯化钠5g,蛋白胨5g,酵母膏5g,蒸馏水1000ml,调pH值为7.4,放入高压灭菌锅105℃灭菌30min。1.1.2　鸡大肠杆菌分离鉴别[5]。无菌采集剖检大肠杆菌病
[7];接种9h后,小鸡开始出现死亡,至
13只。对死亡小鸡进行剖检,见其气管及支气管轻
微出血,肝脏、肺脏出血,十二指肠、小肠及盲肠扁桃体出血,腺胃乳头有脓性液体流出;从死亡鸡肝、脾均回收到试验菌。对照组5d后仍健活。
经鉴定确定为致病性大肠杆菌后按5%的量接种于鸡大肠杆菌增菌培养基上,37℃培养16h,置4℃冰箱保存备用。
1.2　供试仪器　显微镜、722分光光度计。1.3　试验方法
1.3.1　细菌悬浮液的配制。取5ml培养16h的菌液,用45ml灭菌大肠杆菌液体培养基稀释,充分振荡摇匀,使细菌充
分分散。然后用移液管依次取10、9、8、7、6ml,分别放入5个试管中编号为1、2、3、4、5。在这5个试管中分别加入大肠杆菌增菌培养基,使其悬浮液均达到10ml,充分摇匀,制成一组浓度梯度的细菌悬液,待测。
1.3.2　分光光度计测量方法。用大肠杆菌增菌培养基作为
典型病变鸡肝脏,用无菌刀片划开,触片革兰氏染色镜检,见阴性两端稍深染的杆菌,同时用接种环沾取切面划线接种于麦康凯鉴别培养基上,37℃培养24h,在麦康凯培养基上形成3mm左右,红色,光滑湿润圆形隆起小菌落,挑取红色单个菌落接种于普通肉汤培养基纯化培养,37℃培养24h,肉汤浑浊,管底有沉淀物,将培养物涂片革兰氏染色镜检,同组织触片,但菌体着色均匀,单个或偶有2～3个相连。
1.1.3　生化鉴定[6]。将纯化后的细菌培养物进行乳糖、甘
对照,其他5个试管细菌悬液作为待测液。移入0.5cm×1.0
cm规格比色槽中,在722分光光度计上进行测定。所用波长
为450nm。每个样重复测定3次,记下吸光度的平均值。
1.3.3　直接涂片计数法。用测微器测出油镜的视野半径γ,
γ然后计算视野的面积π。
涂片的制作:以灭菌微量吸管吸取充分混合的被测菌液
0.01ml,滴加于清洁的划有100mm2方格的载玻片上。将玻
露醇、麦芽糖、葡萄糖和蔗糖发酵试验。该细菌能够分解利用乳糖、葡萄糖和麦芽糖,其中以乳糖产酸产气最多,但不能分解利用甘露醇和蔗糖,也不分解肌醇。
1.1.4　动物攻毒试验。取40只3周龄非免疫健康小鸡平均
片标本固定,以碱性美蓝染色5min,水洗,干燥后即可镜检。
镜检和计数:将涂片置于已测知视野面积的油镜下观察,检查x个视野(按菌数决定),计算每个视野中所见的细菌数,假设其总数为n,则平均每视野具有n/x个细菌,故1
πr2×nx。ml被检菌液中的细菌总数=100×100mm2
2　结果与分析
分成两组,一组为试验组,另一组为对照组。试验组20只接种普通肉汤培养基纯化培养的培养物,肌肉注射0.5ml/只;对照组10只接种普通肉汤培养基,肌肉注射0.5ml/只。接种5h后,试验组的小鸡出现羽毛蓬松、精神沉郁、双腿无力、
作者简介　陶海静(1972-),女,河南中牟人,硕士,讲师,从事动物生物
技术研究。
收稿日期　
用722分光光度计测得灭菌大肠杆菌培养液(对照)及5个试管悬浮液(待测)的OD值(吸光度),见表1。将表1数值绘图显示,细菌悬液与吸光度之间呈直线相关。笔者对此试验做了大量的工作,如把大肠杆菌多次培养,稀释一定倍数后测OD值及菌数,结果表明,它们在坐标上的对应点均
(下转第8516页)
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文档介绍：
第29卷第5期2009年5月环境科学学报ActaScientiaeCircumstantiaeVo.l29,No.5May,2009基金项目:国家自然科学基金重点项目(No.)SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.)作者简介:陈灏(1964)),男,副研究员(博士);*通讯作者(责任作者),E-mai:lchenhao@rcees.Biography:CHENHao(1964)),male,associateprofessor(Ph.D.);*Correspondingauthor,E-mai:lchenhao@rcees.陈灏,谷立坤,刘雷,等.2009.纳米TiO2水悬浮液对大肠杆菌生长的影响[J].环境科学学报,29(5):919-923ChenH,GuLK,LiuL,etal.2009.EffectofnanoTiO2watersuspensiononthegrowthofEscherichiacoli[J].ActaScientiaeCircumstantiae,29(5):919-923纳米TiO2水悬浮液对大肠杆菌生长的影响陈灏*,谷立坤,刘雷,周莹中国科学院生态环境研究中心,北京100085收稿日期:修回日期:录用日期:摘要:为了考察纳米TiO2(&100nm)水悬浮液对典型环境微生物)))革兰氏阴性菌大肠杆菌生长的影响,制备并表征了水中分散的平均粒径和含量分别为74.3nm、1.5mg#L-1(样品1)和82.2nm、3.1mg#L-1(样品2)的2种纳米TiO2水悬浮液,并在有、无紫外光照条件下进行细菌培养实验.实验结果显示,在无紫外光照条件下,2个样品对大肠杆菌的生长均有抑制作用,在大肠杆菌生长稳定期,样品1和样品2分别使OD600值平均下降0.03和0.11;单独紫外光照可对大肠杆菌生长产生抑制作用,使OD600值平均下降0.04,而同样紫外光照剂量下样品2可使OD600值平均下降0.18,显示出纳米TiO2对大肠杆菌生长的协同抑制作用.关键词:纳米TiO2;水悬浮液;大肠杆菌;生长文章编号:09)05-919-05中图分类号:X171文献标识码:AEffectofnanoTiO2watersuspensiononthegrowthofEscherichiacoliCHENHao*,GULikun,LIULe,iZHOUYingResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085Received29July2008;receivedinrevisedform24December2008;accepted31March2009Abstract:Theeffectofnano-TiO2watersuspensiononthegrowthofGramnegativeEscherichiacoliwasinvestigatedusing2nano-TiO2samples.TheaverageparticlesizeandTiO2concentrationofSample1weredeterminedas74.3nmand1.5mg#L-1respectively,andthoseofSample2were82.2nmand3.1mg#L-1.ResultsshowedthatthegrowthofE.coliwasinhibitedbybothsampleswithoutUVlight.Sample1andSample2reducedtheOD600valuesinthesteadystateperiodofE.coligrowthby0.03and0.11respectively.UVlightwasfoundtohaveanegativeimpactonthegrowthofE.coli,andcouldreducetheOD600valueby0.04.WhenthesameamountofUVradiationwasappliedwithSample2,theOD600valuewasreducedby0.18,indicatingasynergisticinhibitioneffectofnano-TiO2particlesonthegrowthofE.coli.Keywords:nanoTiO2;Egrowth1引言(Introduction)纳米颗粒是指粒径为1~100nm的颗粒物,因其具有小尺寸效应、量子效应和巨大的比表面积等,正得到越来越广泛的应用.但是,人工纳米材料和纳米器件在广泛使用后会大量进入环境,并以分散的纳米颗粒物的形式长期存在于水环境中,由此造成新的环境问题(汤鸿霄,2005).目前,纳米颗粒的生态环境效应问题已经引起了全世界的广泛关注(Dowlingetal.,2004;Brumfie,l2003;Masciangiolietal.,2003;Service,2003).微生物是整个生态环境系统的重要组成部分,其中细菌的比例高达90%以上,它们的存在范围最广、对环境变化的反映也最为敏感.因此,选择环境中典型微生物(革兰氏阴性菌大肠杆菌)作为指示生物,对于深入了解纳米材料的生态环境效应机理具有重要意义.国际上已有人开展了纳米材料对微生物生长影响的研究,发现纳米Ag、纳米Cu、纳米ZnO、纳米SiO2等对微生物都有明显的抑制作用(Adamsetal.,2006;al.,2007),在作用机理研究方面注重紫外光激发下的氧负离子对细胞及其原生质成分的损伤(Guillardetal.,2008;环境科学学报29卷Gogniatetal.,2007;Manessetal.,1999).纳米TiO2是一种已得到广泛实际应用的纳米材料,但其水悬浮液对微生物影响的研究目前开展得还不够,其中主要的原因和困难是即使实验所用纳米TiO2粉末的商品标注粒度小于100nm,由于纳米TiO2在水中极易团聚,其在水中的实际粒度也将远大于100nm(Adamsetal.,2006;Hristovskietal.,2005),从而使其结论不能确切地反映真正纳米材料的毒理学特性.因此,有必要确定严格意义下的纳米TiO2悬浮液是否对细菌(如大肠杆菌)的生长有抑制作用.目前在对纳米TiO2材料的研究中多侧重其对生物体内不同器官的影响及转移分布规律(Wangetal.,2007;Warheitetal.,2007),而纳米材料本身(小尺度效应)可能对细菌造成的伤害研究较少(al.,2008),纳米TiO2对细菌在营养丰富条件下的生长周期的影响更是一个研究空白.紫外光催化下TiO2的灭菌作用早有发1
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实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四& 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
连接反应中形成的重组子及其他质粒分子的混合群体必须通过转入宿主细胞将它们相互分离，进而进行自主复制（克隆）。人们发现用Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化(transformation)。转化是将异源DNA分子引入另一细胞系的过程，是受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。它是遗传工程的一项关键技术，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
转化过程所用的受体细胞一般是修饰限制系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用符号R-、M-表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许带有外源DNA的载体分子进入的受体细胞(competence cell)。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
目前单一的克隆实验中最常用的宿主细胞仍然是具有限制-修饰系统缺陷的大肠杆菌菌株。大肠杆菌的转化过程是将质粒分子的水溶液或连接反应的混合物与感受态细胞的悬浮液混合放置一定的时间，以使得DNA能被大肠杆菌细胞吸收。但DNA进入细胞的确切机制仍不清楚。将混合溶液于42℃热处理一定的时间，会诱导质粒分子或连接反应的混合物进入细胞，结果提高了转化效率。然后加适量生长培养液于转化细胞中，并在适温下培养，最终涂布于琼脂平板的表面，培养至形成细菌单菌落。同一克隆中的所有细胞均起源于某一单独个体的分裂繁殖，因此同一克隆的所有细胞具有相同的基因型（不包括自发突变，只包括转化步骤中引入的质粒）。
如果转化反应中的所有感受态细胞都能在琼脂平板上生长，则将会形成成千上万甚至上百万的的克隆，且大多数克隆中都不会含有外源DNA分子，这种转化将是无效的。可见需要一种筛选哪个克隆含有质粒或外源DNA的方法。这通常是利用质粒载体携有某一抗生素抗性基因来实现的。例如β-内酰胺酶基因（Ampr）赋予对氨苄青霉素抗性。若将转化的细胞涂布于含有氨苄青霉素的平板，则只有那些含有被转化质粒从而表达β-内酰胺酶基因的细胞才能生存并生长增殖。这样可以确定转化后在氨苄青霉素平板上形成的克隆都是从携有完整β-内酰胺酶基因的质粒的单个细胞增殖而成。如果转化中使用的是连接反应混合物，此时并不能确定哪些克隆是含有目的片段的重组质粒。一旦获得一群重组子克隆，首先要确定哪些克隆是含有插入目的片段的重组质粒。在多数情况下如DNA文库的筛选，有必要从成千上万甚至上百万的的克隆中筛选出目标克隆。在单一亚克隆实验中，要求实验设计应该充分体现重组子克隆的产率，例如可采用碱性磷酸酶处理载体。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与连接反应混合物共保温实现转化。T载体带有LacZ基因，其编码β-半乳糖苷酶在Xgal-IPTG培养基平板上可以发生显色反应，根据此原理，已经在某些插入型的λ噬菌体载体的LacZ基因中引入了若干常用的限制性核酸内切酶的识别位点。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时，形成的是无功能活性的β-半乳糖苷酶。于是被感染的大肠杆菌寄主细胞就会在含有Xgal-IPTG培养基平板上形成无色的噬菌斑，相反，没有外源基因插入的λ噬菌体载体则会形成蓝色的噬菌斑。同样的方法也可以适用于替换型载体的重组体分子的选择，但其先决条件是在可取代的区段中应带有LacZ基因的相应序列。由此可见，可以利用LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶的功能活性作为选择λ重组体分子的一种简便有效的生化指标，因而接受了该连接产物的受体菌就具有抗氨苄青霉素的特性。转化体经过进一步纯化扩增后，可再将转入的DNA分离提取出来，进行重复转化、电泳、电镜观察，并做限制性内切酶图谱、分子杂交或测序等实验鉴定。
2 内容提要
&&& 本实验以CaCl2制备E.coli DH5α感受态细胞，转化连接产物，并用含抗生素的平板筛选转化体。通过本实验，了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义，学习CaCl2制备E.coli DH5α感受态细胞和外源基因转入受体菌感受态细胞，以及蓝白斑筛选转化体的方法。
步骤&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 所需时间
制备E.coli DH5α感受态细胞&&&&&&&&&&&&&&&&&& 1d
&&&&&&&& 转化细胞与平板筛选&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 1-2d
4 主要仪器、材料和试剂
主要仪器：
恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴锅、低温离心机、移液器、分光光度计、离心管、液氮、制冰机、高压灭菌锅等。
E.coli DH5α菌株，实验三的连接产物，质粒等。
① 0.1mol/LCaCl2的配制：称取0.147g CaCl2·2H2O
② LB培养基的配制：
10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物及5gNaCl溶于用水定容至1000mL并高压蒸汽灭菌。若要配制含氨苄青霉素的LB培养基，则将15g琼脂加1L　LB培养基中并高压灭菌，待冷却至55℃，向其中加入适量的氨苄青霉素（终浓度30～50mg/L）。
③ 氨苄青霉素贮存液：50mg/mL(溶于无菌水中)，保存于-20℃
④ X-gal 储液（20mg/mL）：用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/mL 的储液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20℃。
⑤ IPTG 储液（200mg/mL）：在800μL蒸馏水中溶解200mg IPTG 后，用蒸馏水定容至1mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf 管并储于-20℃。
⑥ 含X-gal IPTG筛选培养基：在事先制备好的含50μg/mL Amp 的LB平板表面加20μL X-gal储液和4μL　IPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37℃下放置30min，使培养基表面的液体完全被吸收。
5 操作步骤
（1）大肠杆菌感受态细胞的制备
& &&① 用接种针挑取宿主菌(DH5α)在LB琼脂平板上划线，37℃培养16h左右；
& &&② 挑取单菌落接种到含50mL LB的250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡(300rpm)培养，至OD600达0.1～0.2；
& &&③ 无菌条件下将培养物转移至冰预冷的2mL离心管中，冰浴10min；
&&& ④ 4℃ 12，000rpm离心10min，收集细胞；
& &&⑤ 倒出培养液，倒置离心管1min，使液体流尽；
& &&⑥ 用5mL冰预冷的0.1M CaCl2重悬细胞，冰浴10min；
& &&⑦ 同条件④离心，收集细胞；
& &&⑧ 重复⑤、⑥、⑦一次；
& &&⑨ 用2mL冰预冷的0.lM CaCl2重悬细胞(每50mL初始培养物用2mL冰浴冷CaCl2重悬细胞)；
⑩ 将CaCl2菌悬液放置4℃ 12～20h，然后加甘油至终浓度为20％，充分使甘油与CaCl2菌悬液混匀。分装成每份200μL，贮存于-70℃。
（2）细胞转化——热休克法
① 取一管感受态细胞于冰上冻融后，于无菌条件下加入一定量的连接产物或质粒(20ng/μL的DNA加入lμL即可)。轻轻混匀后，冰浴30min，同时设置两个对照：其中一个在相同条件下加入10ng已知质粒作阳性对照，也可同时检测感受态细胞效价（每ug质粒DNA转化出的菌落数）；另一个加lμL无菌水作阴性对照。
② 42℃水浴静置热激90秒。
③ 将管迅速转移至冰浴中，冰置2min。
④ 往管中加入600μL LB液体培养基，37℃摇床上，200rpm，温育45min，使细菌复苏。
⑤ 按适当的体积梯度，将细菌液铺于含Amp、Xgal-IPTG的琼脂平板上。待液体完全浸入培养基后，倒置平板在37℃培养12～16h。
（3）计算转化率
感受态细胞效价计算：以转化率表示，即每微克质粒DNA转化所得到的转化子数。&&&
统计每个培养皿中的菌落数。&
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：&
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积；&
转化频率（转化子数／mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)；&
感受态细胞总数＝对照组菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积；&
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数。&
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率不一定相同。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩(如离心)，才能较准确的计算转化率。&
6 结果分析
&& 若将上述经培养的转化反应液铺板后，长出的菌落太密，则可进行适当梯度稀释后再铺板。铺板操作需在超净工作台中进行。待菌落生长良好而又未相互重叠时停止培养。统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况如下表所示：
表3-1 培养皿内各实验组菌落的生长状况及结果分析
不含抗菌素平板
含抗菌素平板
受体菌对照组
有大量菌落长出
无菌落长出
本实验未产生抗药性突变株
无菌落生长
无菌落长出
质粒DNA溶液不含杂菌
转化实验组
有大量菌落长出
有菌落长出
质粒进入受体细胞便产生抗药性
&&& 由上表可知，转化实验组含抗菌素平板上生长的菌落即为转化体，根据数据则可计算出转化体数和转化频率，计算公式如下：
转化体数=菌落数×稀释倍数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）；
转化频率=转化总数/加入质粒DNA的质量；
再根据受体菌对照组不含抗生素平板上检出的菌落数，则可求出转化反应液内受体菌总数，进一步计算出本实验条件下，由多少受体菌可获得一个转化体。
7 问题讨论
（1）为提高转化率须思考以下几个重要因素：
① 细胞生长状态和密度。细胞生长不足或过高均会使转化率下降，一般以每毫升培养液的细胞数在5×107个范围为好。要使用新鲜的培养液，否则效果不佳。受体菌生长状况可用分光光度计来测定，不同菌株的合适OD值是不一样的，因为OD值与细胞之间的关系随菌株的不同而异。
② 转化质粒DNA的浓度和质量。转化率与所加DNA浓度在一定范围内成正比，但当DNA量过多或体积过大时，则会使转化率下降。用于转化的质粒DNA应主要是cccDNA（即共价闭合或超螺旋DNA）。
③ 试剂的质量与污染。所用的试剂如CaCl2等应是分析纯，且最好保存于干燥的荫凉的暗处。整个过程需要注意防止杂菌的污染和其他DNA的污染；所用器皿如离心管、分装用的微量离心管等一定要干净，最好是新的；并在整个实验过程中要无菌操作。少量其他试剂在器皿中残留或DNA的污染均会影响转化率。实验中凡涉及溶液的移液管、分装等敞开实验器皿的操作，最好在无菌超净台中进行以防污染。
④ 若在不该长出菌落的平板上长出了菌落（如阴性对照板），首先考虑是否抗生素已失效，若排除了这一因素，则说明实验有污染（如所用的离心管、器皿等）；如果长出的菌落相对于转化实验组的平板上长出的菌落而言，数量极少（一般在5个以下），则此次转化还算成功，可继续以后的实验；如果长出的菌落很多，则需要设计对照实验，分析找出原因后，再决定是否重新进行转化。
⑤ 本实验方法适用于E.coli各菌株，但同一菌株与不同质粒DNA间的转化效率是不一样的，有的重组质粒转化率会很低。
（2）转化是DNA扩增和体内进行基因研究的关键步骤。转化有多种方法，常用的有氯化钙法、氯化铷法、一步法。与其他两种方法相比一步法较简易，它无需离心、漂洗、热处理以及特殊的仪器（如电穿孔法）。另外在PEG、DMSO和Mg2+存在的情况下可获得较高的转化率。感受态细胞在不作任何处理的情况下在所在溶液中可保存长达3个月以上。
（3）一般认为冰冷氯化钙溶液处理可使细菌进入“感受态”，而热休克则使细菌的细胞膜张开，这样DNA得以进入细胞。迄今人们为提高转化率对这一技术进行了许多改进。本实验所介绍的氯化钙法是一种简便、快速的方法。使用本法进行转化，每微克超螺旋质粒（pGEM系列）可产生107个转化菌落。
（4）感受态细胞的质量可以通过测定某一特定样品的转化率来衡量，转化率定义为每微克用于转化的DNA在选择平板上所形成的菌落数。这里DNA为纯质粒，通常是在克隆实验中的载体。转化率的变动幅度很大，可以从粗放转化程序的105个菌落/微克到精细转化程序高于108个菌落/微克。粗放转化程序只适合完整质粒转入新的宿主菌，而精细转化程序所精心制备的感受态细胞可用于文库的构建。约105个菌落/微克的转化率足以满足简单克隆实验。
（5）一般培养液中必须含有原平板筛选转化子所用的抗生素，以维持对质粒有无的选择。部分质粒在长期无筛选压力的生长条件下会从宿主菌体内丢失，因为那些偶然丢失了质粒后能以耗能少的方式复制的细菌将会淘汰那些携带质粒的细菌。扩增的质粒可以用小量法从培养基中制备。通常在这一时刻要制备培养物的保存液，方法是将培养物分散于含有一定浓度的甘油溶液中保存，甘油的作用是保护细胞冰晶形成的伤害（甘油贮液）。这样的贮液能使同一菌株（质粒）在必要时被接种增殖并再次制备。
&&& 影响转化效率的因素主要有哪些？
[1] Sambrook，J.et al.Moleculer Cloning:A Laboratory Manual，174-184，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
[2] 张龙翔等.生物化学试验方法和技术，北京:高等教育出版社，1981。
[3] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆试验指南，北京:科学出版社，1998.
[4] 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术，北京:科学出版社，1998.
[5] 吴乃虎.基因工程原理（第二版），北京:科学出版社，2000.
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