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如何确定蛋白质自我剪接的部位?
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这个帖子发布于13年零195天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
有一个细菌的基因X, 其ORF为1.4kb, 推断可以编码50kD的蛋白. 但是经过无蛋白酶的体外转录和翻译实验(S35标记)证实, 其在细菌中表达的蛋白的分子量大约为34kD. 而利用在N末端和C末端分别加HIS-tag的方法发现, N末端和C末端的HIS-tag都不会丢失, 初步证实所丢失的约16kD的部分氨基酸序列可能位于该50kD蛋白的中间部位. 那么,接下来我该怎么确定蛋白质的自我剪接部位呢(软件分析以及实验设计方面)?希望各位帮兄弟一把! 谢谢!!
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体外转录和翻译实验是真核系统吧，是否应该先分析一下原核与真核表达系统的不同？个人认为软件是无法解决的，蛋白拿去测序吧。
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会不会推断本身有错误呢，经常有表达蛋白预测的分子量和实际电泳不一样的，如果真的是猜测的那样，过程中自我剪切也有个过程，那么带his标签表达，你可以分时段监控，例如开始诱导表达后每隔两小时取样纯化，跑电泳，如果所有的样品中目标蛋白都一样，那应该没有剪切，如果有，那说明猜测是对的，先检验一下看看。确定猜测没有错，再进一步做实验看是在哪里。
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首先谢谢二位的应助！icesugar75 wrote:体外转录和翻译实验是真核系统吧，是否应该先分析一下原核与真核表达系统的不同？个人认为软件是无法解决的，蛋白拿去测序吧。我的体外转录和翻译实验是原核系统的.chromatography wrote:会不会推断本身有错误呢，经常有表达蛋白预测的分子量和实际电泳不一样的，如果真的是猜测的那样，过程中自我剪切也有个过程，那么带his标签表达，你可以分时段监控，例如开始诱导表达后每隔两小时取样纯化，跑电泳，如果所有的样品中目标蛋白都一样，那应该没有剪切，如果有，那说明猜测是对的，先检验一下看看。确定猜测没有错，再进一步做实验看是在哪里。很感谢您的建议，对我很有启发。也许是我没有说清楚。还有一个实验结果是这样的，经Ni－NTA纯化发现2个不同大小的蛋白泳带，50kD蛋白产物存在于BL21表达菌株的可溶性蛋白部分（细菌裂解液的上清中）， 34kD蛋白产物则存在于细菌裂解离心后的沉淀（包涵体）中。不知道这是否能证实我的推断是正确的呢？
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即使是实验中纯化出两种蛋白，不少蛋白即使不带his标签，一样被柱子吸附。所以你纯化结果不一定表明它们是同类蛋白，其实金属螯合层析特异性非常差，不能做检测手段，所以建议你用别的检测方法检测它们是不是有相同的序列，最简单的方法是测定它们的末端氨基酸组成看是不是一样。如果有抗体可以用western方法检测。只有证明它们序列相同，那你的推测也许成立，如果不是，那应该不是。
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自我剪切是处于 post-transcription 过程还是 post-translation 过程中呢？如果是前者，不同时段检测可能测不出。其它部分同意 chromatography
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我是用Promega的试剂盒E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA做的体外转录和翻译实验，并用S35标记methionine, 电泳后放射自显影的结果显示有一条主要的34kD的带，还各有一条弱的50kD和16kD的带，这可以说明问题吗？附试剂盒说明书：/tbs/tb219/tb219.pdf
To icesugar75:细菌染色体上的基因与真核生物不同，无内含子，转录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可直接翻译成多肽。《医学微生物学》
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呵呵，一直做真核，脑子里那根弦都松了。是的，原核基因是不需要转录后修饰的。做过真核的体处转录和翻译，原核的没有做过。是否原核基因组里有这样的现象：同一基因不同的转录起始位点，以至于翻译结果不同？不知 wdzhao 的实验现象可否以这种现象来解释。
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Thanks for reply!chromatography wrote:即使是实验中纯化出两种蛋白，不少蛋白即使不带his标签，一样被柱子吸附。所以你纯化结果不一定表明它们是同类蛋白，To chromatography :我的实验除了用柱子层析可以得到两种蛋白外，用His-tag的抗体做western也可以检测到N末端和/或C末端带有HIS-tag的融合蛋白的表达,这应该可以排除不带his标签的其他蛋白的污染吧？icesugar75 wrote:是否原核基因组里有这样的现象：同一基因不同的转录起始位点，以至于翻译结果不同？不知 wdzhao 的实验现象可否以这种现象来解释。To icesugar75:利用在N末端和C末端分别加HIS-tag并通过western blot检测的方法发现, N末端和C末端的HIS-tag都不会丢失, 这是否可以排除不同的转录起始位点?
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这个就不知道了，原核方面的东西我不太熟。不知道同一基因的不同起始转录翻译方式是不是可以同时存在，也就是说同时以不同效率进行。
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应该说这能说明没有别的蛋白吗，我不很清楚，因为His-tag抗体的特异性我不清楚，我觉得就His-tag抗体而言一定能保证单个或连续几个组氨酸的残基没有阳性反应吗，不知道有没有人做过这样的的实验呢。所以我保留自己的观点，我觉得你可以鉴定末端氨基酸，这样也许能排除，否则仅凭His-tag的抗体做western我不知道是不是能确定两都是你表达的目标蛋白。
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谢谢两位热心人！看来蛋白测序是少不了的了！还请问chromatography ：
如果经过鉴定末端氨基酸发现是同一蛋白的不同表达产物，那我下一步实验应该怎么做呢？
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还请问chromatography ：
如果经过鉴定末端氨基酸发现是同一蛋白的不同表达产物，那我下一步实验应该怎么做呢？如果一样，那我觉得可能再测定末端5-6氨基酸，看是不是一样，如果相同，那你猜测的应该是对的，如果不一样，说明不是。
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蛋白的自我剪切的概念一般是指,在一个蛋白分子(多蛋白前体)中有一功能域具有蛋白酶样的作用,它识别自身分子中其它区域的酶切位点,从而由一个多蛋白前体形成几种成熟蛋白,不知你所研究的蛋白是否属于这样的具有蛋白酶样作用的蛋白.细菌在有限的基因组中具有充分利用基因资源的能力,往往是从一个较长的基因中转录较长的mRNA,表达一个大分子量的前体,然后切割形成几种成熟蛋白.而在真核细胞中同一个基因可能有不同的mRNA剪接方式,从而导致表达几种分子量差异但功能相近的生物活性蛋白.以上拙见仅供参考,但一旦证实,岂不是你有新发现.
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谢谢各位指教！
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你可能喜欢从DNA到蛋白质
8.2& 染色体遗传学说
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基因的概念及其发展
基因的本质――DNA(RNA)
从DNA到蛋白质
基因表达调控
遗传物质的改变
DNA损伤修复
（一）中心法则
&&& 基因是能够自我复制，永远保存的单位，它的生理功能是以蛋白质的形式表达出来的。所以DNA核苷酸序列是遗传信息的储存者，它通过自主复制得以永存，通过转录生成信使RNA，进而翻译成蛋白质的过程来控制生命现象，即贮存在核酸中的遗传信息通过转录，翻译成为蛋白质，体现为丰富多彩的生物界，这就是生物学中的中心法则(central
dogma)。该法则表明信息流的方向是有DNA――〉RNA――〉蛋白质。在该信息流中，RNA病毒及某些动物细胞可以RNA为模板复制出RNA，然后再由RNA直接合成出蛋白质；同时某些病毒，某些癌细胞及动物胚胎细胞可以由RNA转录出DNA，即发生反转录(reverse
transcription)。图8-3-7
遗传信息流
由中心法则可知DNA（基因）控制着蛋白质的合成。蛋白质的生物合成比DNA复制复杂，该过程包括转录、翻译、蛋白质合成因子和其他条件。（二）遗传密码&
&&& DNA的核苷酸序列是遗传信息的贮存形式，通过转录的方式合成信使RNA。通常把与mRNA序列互补的那条DNA链称为编码链(coding
strand)或有意义链，另一条不被转录只能通过碱基互补合成新的DNA，称为反义链(anticoding
strand)或无意义链。只有mRNA携带的遗传信息才被用于指导蛋白质的生物合成，即决定蛋白质中氨基酸排列顺序。故一般用U、C、A、G四种核苷酸不用T、C、A、G的组合来表示遗传信息。由上述可知DNA的编码链核苷酸序列决定mRNA中的核苷酸序列，rnRNA的核苷酸序列又决定着蛋白质中的氨基酸序列。实验证明mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质链上的一个氨基酸，把这3个核苷酸称作遗传密码，也叫三联体密码。&1． 遗传密码的提出
&&& 1954年物理学家George Gamow研究组成蛋白质的20种氨基酸核rnRNA4个核苷酸之间的关系，即四种不同的核苷酸如何为20种氨基酸编码？如果3种核苷酸为一个氨基酸编码，可组合为：64种氨基酸，满足20种氨基酸的编码还有剩余，于是就把3个核苷酸组合在一起的方式称为三联体密码。2． 遗传密码的破译
&&& 遗传密码的破译就是确定每种氨基酸的具体密码。详见 通用遗传密码及相应的氨基酸表格。图8-3-8
遗传密码表3． 遗传密码的性质
密码的简并性：64种密码决定20种氨基酸，必然同一个氨基酸有多个密码。把由一种以上密码编码同一种氨基酸的现象称为简并性(degeneracy)，对应于同一氨基酸的密码称为同义密码(synonymous
密码的普遍性与特殊性：遗传密码不论在体外还是在体内，对绝大多数病毒、原核生物、真菌、植物和动物都是适用的。科学家在比较了大量的核酸和蛋白质序列后发现，密码具有普遍性。据现有生物资料，只有极个别的例外。在蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子在核糖体蛋白体内是通过碱基的反向（互补）配对的rnRNA的密码相互作用。1966年Crick根据立体化学原理提出了摆动假说，解释了反密码中的某些稀有碱基成分的配对，以及许多氨基酸有2个以上密码问题。据摆动学说，在密码与反密码配对中，前两对碱基严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码，究竟能识别多少个密码是由反密码的第一个碱基的性质决定的。第一位碱基为A或C者，只能识别1种密码；第一位碱基为G或U者可以识别两种密码；第一位碱基为 I 者可识别三种密码。对于某些个别密码，反密码的第一个碱基可识别4种密码，表明3对碱基中的第三位使无关紧要的，这就是所谓的“三中配二”原则。
密码无逗号及不重叠性：密码与密码之间没有逗号，即密码与密码间没有任何不编码的核苷酸。翻译从起始密码开始然后按连续的码组沿rnRNA多核苷酸链由5’至3’方向进行，直到终止密码处，翻译自然停止。在多核苷酸链上任何两个相邻的密码不共用任何核苷酸。
密码的使用规律：原核生物中大部分以AUG为起始密码，少数使用GUG,，真核生物全部使用AUG为起始密码，终止密码
UAA、UAG、UGA全部被使用，有时连续用两个终止密码，以保证肽链合成的终止。
（三）mRNA的转录与加工1、转录(transcription)
&&& 活细胞内蛋白质氨基酸排列顺序由DNA所带的遗传信息控制，DNA中遗传信息的表达必须经过中介产物，即转移到信使RNA上，这个过程叫转录
。由mRNA再将这些信息转移到蛋白质合成系统中，合成蛋白质的过程称为翻译（translation）。图8-3-9&
蛋白质合成过程
mRNA合成过程 和DNA复制一样，需要多种酶催化，从DNA合成RNA的酶称RNA聚合酶(RNA
polymerase)。真核细胞rnRNA转录需要RNA聚合酶 II 。DNA双链分子转录成RNA的过程是全保留式的，即转录的结果产生一条单链RNA，DNA仍保留原来的双链结构。转录的第一步是RNA聚合酶 II
和启动子(promotor)结合。启动子是DNA链上的一段特定的核苷酸序列，转录起点即位于其中。然而RNA聚合酶 II 本身不能和启动子结合，只有在另一种称为转录因子的蛋白质与启动子结合后，RNA聚合酶才能识别并结合到启动子上，使DNA分子的双链解开，转录就从此起点开始。解开的DNA双链中只有一条链可以充当转录模板的任务，RNA聚合酶 II 沿着这一条模板链由3’端向5’端移行，一方面使DNA链陆续解开，同时将和模板DNA上的核苷酸互补的核苷酸序列连接起来形成5'―〉3’的RNA，RNA聚合酶只能在DNA的3'连接新的核苷酸，即mRNA分子按5'―〉3’方向延长，这就说明了为什么DNA两条链中只有一条可作为模板。当RNA聚和酶沿模板链移行到DNA上的终点序列后，RNA聚合酶即停止工作，新合成的RNA陆续脱离模板DNA游离于细胞核中。图8-3-10
转录过程2、加工
&&& 转录出来的RNA必须经过加工方能变为成熟的mRNA。mRNA的前体是分子较大的hnRNA（heterogeneous nuclear
RNA，核内不均一RNA）。真核细胞中的hnRNA5’端要连上一个甲基化的鸟嘌呤，这就是mRNA的5’端帽子。该帽子由下述功能：①使mRNA免遭核酸酶的破坏；②使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质；③ 被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质合成。在mRNA3’端需要加上poly(A)序列的尾巴，其长度因mRNA种类不同而不同，一般为40~200个左右的碱基，有两个功能：①它是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的；②提高mRNA在细胞质中的稳定性。HnRNA链上还含有不编码氨基酸的内含子和编码氨基酸的外显子。mRNA戴上甲基鸟苷“帽子”，加上poly(A)“尾巴”，并且在切除内含子后把所有外显子连接起来才能成为成熟的mRNA。（四）翻译
&&& 将mRNA的碱基顺序依次翻译成特定的肽链，这一过程即为翻译。1． 蛋白质合成起始物的形成和氨基酸活化。
&&& mRNA从细胞核进入细胞质后，附在rRNA上并开始形成起始物。起始物包括核糖体的大小亚基，起始tRNA和几十个蛋白合成因子，在mRNA编码区5’端形成核糖体―mRNA―起始tRNA复合物。原核生物和真核生物的起始物略有不同。原核生物的起始tRNA是fMet―tRNA，(fMet, formy lmethionine,甲酰甲硫氨酸)真核生物的起始tRNA是Met―tRNA。原核生物种30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet―tRNA相结合，最后与50S大亚基结合；在真核生物中，40S小亚基首先与Met―tRNA相结合，再与模板mRNA结合,最后与60S大亚基结合生成80S―mRNA―Met―tRNA起始复合物。起始物生成除需要GTP提供能量外，还需要Mg2+、NH4+及三个起始因子(IF1、IF2、IF3)在起始tRNA中，无论是fMet还是Met（甲硫氨酸）均是第一个参与蛋白质合成的氨基酸，它们和所有参与蛋白质合成的氨基酸一样首先必须被活化，所以在起始复合物形成前氨基酸先需活化。氨基酸活化后才能形成AA―tRNA。图8-3-11
氨基酸活化在翻译过程中，是由氨酰―tRNA将氨基酸携带到核糖体。2． 肽链的起始
原核生物和真核生物肽链的起始及延伸基本相似。&图8-3-12
肽链合成过程3． 肽链的延伸和终止
&&& 30S起始复合物形成之后在形成70S复合物过程中第一个fMet―tRNAfMet，放在大亚基的P位点，70S复合物形成之后，第二个AA―tRNA在延伸因子EF―TU及GTP的存在下，生成AA―tRNA、EF―TU―GTP复合物，结合到大亚基的A位点上。此时GTP被水解，EF―TU―GTP被释放，通过延伸因子EF―TS和GTP获得再生，形成EF―TU?GTP复合物。落在A位上的第二个氨基酸是通过核糖体沿mRNA5’―〉3’移动即阅读，读出第二个遗传密码，据该密码第二个氨基酸方可上到A位上，即A位上就被带有和该密码子互补的反密码子的tRNA所占据，该AA―tRNA以它的反密码子和mRNA的密码子以氢键连接起来，它所带的氨基酸就是即将生成肽链的第二个氨基酸。至于fMet―tRNAfMet为什么不能首先到第A位上，这是因为EF―TU只能和fMet―tRNA以外的其他AA―tRNA起反应，所以起始tRNA不能落在A位上，这也是mRNA内部的AUG不会被起始tRNA读出，肽链中也不会出现甲酰甲硫氨酸的原因。
肽链的生成和移位
&&& 经上述作用后在该核糖体―mRNA―AA―tRNA复合物中的AA―tRNA占据着A位，fMet―tRNAfMet占据着P位。在肽转移酶的作用下，P位上的甲酰甲硫氨酸脱离tRNAfMet，而与A位上的tRNA所带的氨基酸的3’方向移动（阅读）一个密码的距离，结果P位上的tRNAfMet脱离P位，成为自由的tRNA，A位上的二肽转移到P位上，A位空出，A位面对mRNA的一个新密码子，于是带有与该密码子互补的反密码子的氨酰―tRNA进入A位。核糖体继续“阅读”，P位上的二肽脱离tRNA而连到A位的tRNA所带的氨基酸上，此时就有了三肽链，核糖体继续“阅读”下去，循环不止。
（2）肽链的终止
&&& 肽链延伸过程中，当终止密码子UUA、UAG或UGA出现在核糖体A位时，没有相应的AA―tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，激活肽基转移酶，水解P位上的多肽链与tRNA之间的链，新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，完成多肽链的合成。（五）蛋白质的加工
&&& 新生的多肽链大多数是没有功能的，必须加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。首先要切除N端的fMet或Met，还要形成二硫链，进行磷酸化、糖基化等修饰并切除新生肽链非功能所需片段，然后经过剪接成为有功能的蛋白质，从细胞质中转运到需要该蛋白质的场所。
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从DNA到蛋白质
基因表达调控
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