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流式细胞术在蛋白质-蛋白质相互作用中的应用
前言蛋白质-蛋白质相互作用是分子生物学研究领域的重要分枝。研究蛋白质-蛋白质相互作用，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且对于提示生长、发育、分化和凋亡等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发等提供重要的理论基础。蛋白质-蛋白质相互作用的研究通常分为三个阶段，第一个阶段是发现与某个感兴趣的蛋白质相互作用的其他蛋白；第二个阶段是考察两个具有相互作用的蛋白质的相互作用方式与性质；第三个阶段是研究调节这两个蛋白质相互作用的机制。研究蛋白质相互作用的方法有很多，目前仍很难有一种方法能够完全满足蛋白质相互作用研究的全部三个阶段。例如，酵母双杂交技术、TAP亲和纯化质谱联用技术能够高效的发现与兴趣蛋白相互作用的其他蛋白，并对这种蛋白加以鉴定，非常适合第一阶段的研究；第二阶段中首先是对第一阶段发现的成果加以鉴定，然后通过基因手段对蛋白质相互作用的结构域进行研究，并获得蛋白质相互作用的动力学性质，这一阶段常用免疫共沉淀、GST-Pulldown、荧光能量共振转移及biacore等技术；第三阶段使用的技术与第二阶段基本类似，但在蛋白质相互作用环境中增添了新的因素，并着重于考察这些因素对蛋白质相互作用的调节机制。以上三个阶段所使用的技术通常能够准确的获得研究者所需要的数据，但是在其结果输出的阶段，往往需要耗费较长时间与精力，部分操作步骤过多的技术还可能导致结果丢失，尤其是在第三阶段通常需要进行高通量筛选的工作中，显得有些捉襟见肘。流式细胞术在结果输出过程中，与传统技术相比具有很大优势，其快速、准确等特点尤其适合高通量筛选研究工作。本期专题，参考方法学权威期刊《Nature Protocols》发表的3篇研究流式细胞术在蛋白质相互作用中应用的文章，对双分子荧光互补技术、流式pulldown技术、调节蛋白质相互作用药物筛选、单链抗体制备过程中的动力学筛选与测定等方面向大家展示流式细胞术在蛋白质相互作用中的潜在应用方式。双分子荧光互补流式分析技术——最真实的活细胞内实时“免疫共沉淀”免疫共沉淀技术是研究细胞内蛋白质相互作用最常见的实验室技术之一，能够客观的反应蛋白在细胞内环境中的相互作用关系。但由于其结果输出过程中需要将细胞破碎，并经过较为复杂的处理过程才能通过免疫印迹的方法实现，因此通常会检测不到蛋白质间较弱或暂时性的相互作用。西班牙巴塞罗那自治大学研究者利用双分子荧光互补技术结合流式细胞术，创建了一种能够实时检测细胞内蛋白质相互作用的研究方法，被称为双分子荧光互补流式分析技术（bimolecular fluorescent complementation-flow cytometry, BiFC-FC）。双分子荧光互补流式分析技术——最真实的活细胞内实时“免疫共沉淀”免疫共沉淀技术是研究细胞内蛋白质相互作用最常见的实验室技术之一，能够客观的反应蛋白在细胞内环境中的相互作用关系。但由于其结果输出过程中需要将细胞破碎，并经过较为复杂的处理过程才能通过免疫印迹的方法实现，因此通常会检测不到蛋白质间较弱或暂时性的相互作用。西班牙巴塞罗那自治大学研究者利用双分子荧光互补技术结合流式细胞术，创建了一种能够实时检测细胞内蛋白质相互作用的研究方法，被称为双分子荧光互补流式分析技术（bimolecular fluorescent complementation-flow cytometry, BiFC-FC）。 一．方法介绍实验原理：& & &&双分子荧光互补技术是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。活细胞收集后，在流式细胞仪中的检测是实时进行的，只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号，因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。& & & 双分子荧光互补技术原理示意图& & & (a) 诱饵和捕获蛋白分别携带CYFP和NYFP两段YFP荧光蛋白片段& & & (b)诱饵和捕获蛋白结合同时CYFP与NYFP形成YFP& & & (c) 形成的YFP发出荧光常见的用于双分子荧光互补技术的荧光蛋白
实验过程1、设计、构建带有合适荧光蛋白互补片段和目的蛋白基因的质粒；2、将两种质粒共同转染到表达系统（如细胞、细菌）中；3、流式检测表达体系内双分子互补荧光表达强度。4、（可选）如果具有相互作用，则使用基因突变的方式使蛋白质某结构域发生改变，以判定目标蛋白相互结合结构域。5、（可选）如具有相互作用，则可利用该体系进行调节目的蛋白相互作用药物的筛选或研究调节目的蛋白相互作用的分子机制。结果判定：1、设定单独转染一种质粒，不会发出报告荧光的阴性对照与转染完整报告荧光蛋白，发出最强荧光的阳性对照；2、与阴性对照荧光强度相比，发出显著高强度荧光的样本认为细胞内发生了目的蛋白的相互作用，反之则认为没有相互作用；3、结构域突变后荧光强度显著改变的提示可能是目的蛋白相互作用结构域发生突变，用以确定相互作用结构域；4、若对上述体系进行其他干预（如加入药物或对其他蛋白进行调节）后荧光强度发生显著改变，则提示干预因素能够调节目的蛋白间的相互作用。 二．内容解析& & &文中利用上述方法构建了表达Abl-SH3-CYFP和p41-NYFP的两种质粒，将两种质粒共同转染入细菌后，使用BD FACSCalibur检测YFP荧光强度，检测到显著高于阴性对照荧光强度的YFP表达峰，提示Abl-SH3与p41具有相互作用。而分别对其基因进行突变后，相互作用荧光强度显著减弱，提示AblP54L与p41Y4F是重要的相互作用结构域蛋白。 & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &Figure. Coupling bimolecular fluorescent complementation to flow cytometry for the analysis and discrimination of transient binders. (a) Bivariate forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) dot plot showing the R1 gate. Cells in R1 were analyzed for yellow fluorescence emission. The sample shown corresponds to cells expressing yellow fluorescent protein (YFP) (positive control). (b) Frequency histograms of cells expressing: the prey fusion alone, Abl-CYFP (gray); native YFP (black); p41-NYFP and Abl-CYFP (blue); Abl-CYFP and p41Y4F-NYFP (red); AblP54L-CYFP and p41-NYFP (yellow) and AblP54L-CYFP and p41Y4F-NYFP (orange). The mean value of each population is shown below the histograms. The highest value (other than cells expressing YFP) corresponds to bacteria expressing both wild-type prey and bait proteins. When one mutation negatively affected the interaction, a decrease in the mean value was detected. This reduction of fluorescence signal was proportional to the weakening of the binding. Therefore, mutation AblP54L had a stronger effect than p41Y4F. 三．方法点评优势：1、样本量小。传统的co-ip实验通常每个样本需要至少2-3个90 mm培养皿的细胞，在实验过程中会有大量的样本损失。BiFC-FC是以细胞为单个样本的检测方式，只要有效细胞数能够满足统计学需求，就能保证得到准确结果，即是说96孔板的1个孔就足够满足样本需求。2、准确性高。传统Co-ip实验最后结果输出是通过半定量的westernblot免疫印迹法，而BiFC-FC则是完全定量。3、重复性好。传统Co-ip实验由于样本量和结果输出方式的问题，不易重复。BiFC-FC每个细胞都可以作为一个副孔，所需样本量少，结果输出简便，易于重复。3、敏感性高。传统的co-ip方式由于过程相对复杂，很难检测到低亲和力的相互作用，而BiFC-FC相互作用即发出荧光的特性和流式细胞术实时检测活细胞内状态的特点，使得弱结合和一过性结合的现象不会被丢失。4、更快速。传统的co-ip需要有繁琐的样本制备和western检测过程，通常需要2天的时间，BiFC-FC从样品制备到上机检测获得结果只需要大概10分钟时间。5、能够进行高通量筛选。传统的co-ip获得结果的速度较慢，很难进行高通量筛选，BiFC-FC只要筛选体系建成，可以轻松的进行各种高通量筛选。6、更真实。BiFC-FC是反应的活细胞在被检测的瞬间，目的蛋白相互作用的状态，这一相互作用是最真实的细胞内多因素综合调节的体现。这一优势是需要裂解细胞和单纯的体外研究体系所不具备的。不足：1、发现功能相对较弱。BiFC-FC通常局限于两种确定的目的蛋白相互作用的研究。不具备发现某一目的蛋白新的相互作用蛋白的功能。2、研究体系建立难度相对较高。和传统co-ip构建带有标签蛋白的目的蛋白基因质粒相比，BiFC-FC相关质粒构建过程中涉及一些分子构象和链接蛋白的选择，所需分子生物学知识相对较高。3、对于表达的目的蛋白较难定量。由于没有相互作用报告片段不带有荧光，因此在背景值较低（与FRET相比）的同时，很难判断质粒的转染效率。 四．文献欣赏流式pulldown技术——高通量的GST-pulldown技术GST(glutathione S-transferase, 谷胱甘肽巯基转移酶)-pulldown是一种行之有效的验证蛋白质相互作用的体外实验技术，能够很好的判定两种蛋白质间是否具有直接的相互作用。通常实验室研究中会使用免疫印迹的方式输出蛋白质相互作用的结果。这种方式需要的样本量通常较大，而且步骤繁琐不易重复，在需要研究大量样本的实验中显得有些捉襟见肘。美国新墨西哥州立大学健康科学中心和桑福德/伯纳姆医学研究所的研究人员，创新性的用谷胱甘肽荧光微球替代传统的谷胱甘肽亲和柱，并使用流式细胞仪进行结果输出，大大提高了研究工作的效率，使GST-pulldown技术真正实现了高通量应用。我们不妨暂且将这种技术命名为Flow-pulldown。流式pulldown技术——高通量的GST-pulldown技术GST(glutathione S-transferase, 谷胱甘肽巯基转移酶)-pulldown是一种行之有效的验证蛋白质相互作用的体外实验技术，能够很好的判定两种蛋白质间是否具有直接的相互作用。通常实验室研究中会使用免疫印迹的方式输出蛋白质相互作用的结果。这种方式需要的样本量通常较大，而且步骤繁琐不易重复，在需要研究大量样本的实验中显得有些捉襟见肘。美国新墨西哥州立大学健康科学中心和桑福德/伯纳姆医学研究所的研究人员，创新性的用谷胱甘肽荧光微球替代传统的谷胱甘肽亲和柱，并使用流式细胞仪进行结果输出，大大提高了研究工作的效率，使GST-pulldown技术真正实现了高通量应用。我们不妨暂且将这种技术命名为Flow-pulldown。 一．方法介绍实验原理：仿照传统的GST-pulldown技术，将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽包被荧光微球上，作为与目的蛋白亲和的支撑物与带有不同荧光标签的目的蛋白共同孵育，如果微球同时显示两种荧光则表示发生相互作用，目的蛋白荧光强度值越高则说明相互作用越强。在高通量研究中，仿照BDTM CBA技术原理，将结合不同靶蛋白的微球上结合不同强度的荧光染料，以便区别不同蛋白种类，并同时与荧光标记的目的蛋孵育，从而实现同时进行“多对一”蛋白质相互作用的研究，并能够高通量的同时筛选调节目的蛋白与多种靶蛋白相互作用的药物。& & & 实验原理示意图. a 不同荧光强度微球携带不同目标蛋白与靶蛋白结合; b 选择代表微球的区域; c 以SS为横轴，FL8为纵轴，分离代表不同蛋白的各群细胞。&实验过程：1、表达多种靶蛋白并与GST融合，再各自与一定（红色）荧光强度的微球结合；2、表达带有绿色荧光的目标蛋白；3、将不同靶蛋白微球与目标蛋白共同孵育；4、流式细胞术检测微球上的荧光强度。5、（可选）可将某些已知具有“多对一”相互作用的蛋白共同孵育（如文中Bcl2家族成员与Bim-BH3）然后对候选化合物进行高通量筛选，同时对多组蛋白质间相互作用调节进行研究。结果判定：1、根据微球红色荧光强度不同，可将微球分群，每群微球代表一种蛋白；2、带有绿色荧光的蛋白，如果没有与靶蛋白结合，会在样本处理过程中被洗掉，即不会出现单独的绿色荧光；3、与红色荧光共定位的绿色荧光强度值越高提示蛋白质相互作用越强；红色荧光值仅用于根据荧光强度不同区分不同蛋白；4、高通量筛选中，以时间为坐标横轴，绿色荧光值为坐标纵轴，通过每孔样本上样时间一致和换孔间隙信号空白区分各孔细胞荧光信号； 二．内容解析 & & & & & & & && &文中利用微球荧光强度的不同，将不同目的蛋白区分开来，下图所示是文中Gate 6即影响Bcl-B与Bim-BH3结合的药物的筛选过程。研究者利用高通量筛选中每孔检测时间相同和时间轴上孔间信号空白的特点，利用时间轴将每孔样本区分出来，通过图形级联放大和数据统计结果我们可以发现，B5孔药物对Bcl-B与Bim-BH3的相互作用具有显著的抑制作用。&
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &Figure. Finding an inhibitor specific for Bcl-B. (a) Time bins corresponding to bead-containing wells are partitioned and analyzed in ~3 s for a 384- we use no beads in columns 23 and 24, leaving 352 bins with beads. A plot of events (beads per 0.1 s) versus time for a plate is displayed. (b) An enlarged view of Row B. (c) An enlarged view of the wells around well B5, with log FL1 (green fluorescence) on the y axis. (d) Median fluorescence intensity (MFI) measurements for the wells around well B5. Only the Bcl-B value in B5 is significantly decreased. 三．方法点评优势：1、Flow-pulldown技术以流式细胞术替代了传统GST-pulldown技术中免疫印迹法作为结果输出的方式，显著缩短了检测时间；2、Flow-pulldown技术与传统GST-pulldown技术相比，检测所需样本量显著减少；3、Flow-pulldown技术与传统GST-pulldown技术相比，以完全定量的流式细胞术代替了半定量的免疫印迹法，更易于准确定量；4、Flow-pulldown技术能够同时检测“多对一”的，甚至“多对多”（加入不同荧光标记的多种目的蛋白）的蛋白质相互作用药物高通量筛选，这是传统GST-pulldown很难实现的。不足：由于加入荧光标签，在高通量实验设计时需要考虑荧光配伍的问题，但通常是易于解决的。 四．四文献欣赏高效的单链抗体动力学筛选技术与快速的动力学测定方法抗体药物的开发是当前全球医药发展的必然趋势。2010年全球销售额前十名的药物中，有一半是抗体类药物，目前临床上的抗体类药物主要集中在肿瘤和自身免疫病治疗领域。据2010年统计数据显示，全球有5000余种抗体药物正在进行不同阶段的临床实验，进行临床前实验的潜在抗体药物更是数量繁多。抗体药物凭借其安全有效、特异性高、性质均一、靶点定制等特点在未来医药产业领域尤其是当前严重威胁人类健康的慢性复杂性疾病治疗领域将具有很大市场。抗体制备过程中候选抗体与抗原亲和力动力学性质的优化是抗体研发过程中的第一个难关。动力学性质良好的候选抗体会使抗体研发成功率大大提高，也是很多制药公司和投资人选择项目的重要指标之一。 然而，传统的动力学筛选与测定如生物淘洗法和竞争/非竞争性ELISA法在抗体动力学筛选和测定过程的初期，面对大量筛选和检测工作时会显得捉襟见肘。由于药物研发的时效性，开发者需要一种能够快速对候选抗体进行动力学筛选和测定方法。美国马萨诸塞州立技术研究所研究人员，利用结合酵母展示技术、荧光抗原表达技术和流式细胞术，建立了一种能够快速、高效的对单链抗体进行动力学筛选和测定的方法。 一．方法介绍实验原理：向大库容单链抗体酵母展示库中，加入少量（红色）荧光标记的靶抗原蛋白，过量的带有（绿色）荧光的单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，亲和力较高的组合会显示双荧光，被流式细胞分选仪分选出来。通过检测事先设定好的不同抗原/抗体数量比样本的荧光强度值，根据解离常数公式计算解离常数。& & & 酵母表面展示单链抗体与抗原结合示意图.&实验过程：1、建立库容大于109的酵母展示单链抗体库，并对单链抗体标记绿色荧光；2、构建和表达带有红色荧光标签的靶抗原；3、将少量靶蛋白加入单链抗体库进行竞争性结合，并使用磁珠分选将库容缩小至107，并使用流式细胞术验证次级库可用性；4、将次级库酵母再次富集后，再次进行动力学筛选，利用流式细胞分选技术对双荧光酵母进行初次分选5%动力学性质较好酵母；5、并将这部分酵母进行富集扩增后，再次加入少量抗原进行竞争性结合，并利用流式细胞分选技术，再次分选0.1-1%高亲和力的酵母；6、反复几次直到获得较好亲和力的候选抗体；7、对候选抗体进行动力学性质即解离常数进行初步测定，并进行使用基因突变的方式进行体外亲和力成熟，随时使用流式细胞术检测动力学性质，直到获得动力学性质合格的候选抗体。结果判定：1、红色荧光代表抗原蛋白，绿色荧光代表酵母表面单链抗体，酵母可以视为是类似微球的存在，能够被流式细胞仪检测出来，抗原蛋白如果不被抗体“捕获”，在样本处理过程中会被洗掉，理论上不会出现检测到只有红色荧光蛋白表达的情况；2、双色荧光散点图中，红绿双阳性（右上区）代表抗原与抗体结合，红色荧光越强，说明酵母上单链抗体结合的抗原越多，即亲和力越高，动力学性质越好；3、本方法中以MFI作为荧光强度的指标，进行各种数据统计与计算。4、本方法中假定每个酵母表面表达5X104个相同的单链抗体，进行计算。 二．内容解析 & & & & & & & && &本方法中，应用流式细胞分选技术对单链抗体进行动力学筛选是方法的关键环节。如下图所示是研究者第一次动力学筛选的过程。研究者使用未标记的酵母细胞作为阴性对照，使用Alexa Flour 488单阳性酵母细胞调节与PE共同标记的补偿值，并将Alexa Flour 488和PE双阳性细胞作为第一次分选的目标群。同时利用与单链抗体上的c-myc相互结合的Alexa Flour 488荧光强度检测酵母展示的效率。为接下来的次级库富集和进一步筛选奠定了坚实的基础。&& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &&Figure. Representative flow cytometry data. (a) Unlabeled yeast cells. (b) Yeast cells labeled with chicken anti-c-Myc IgY followed by Alexa Fluor 488–conjugated goat anti-chicken (Alexa Fluor 488 control), compensated to reject crosstalk between the Alexa Fluor 488 and phycoerythrin channels. (c) MACS-sorted population labeled for the initial round of flow cytometry sorting. Cells are double-labeled with anti-c-Myc IgY as in b plus biotinylated antigen followed by streptavidin-phycoerythrin. The thick red outline indicates a typical sort gate. (d) Histogram of Alexa Fluor 488 signal for cells labeled in c, indicating yeast surface expression of scFvs. The left peak represents the nondisplaying fraction of yeast due to plasmid loss. PE, phycoerythrin. 三．方法点评优势：1、传统的抗体亲和力筛选是使用生物淘洗法，生物淘洗法是采用一种抗原过量的淘洗方式，不具有动力学筛选的功能，很难筛选到低解离常数的抗体，而且与流式细胞分选技术相比过程较复杂，周期较长，准确性也不高；2、传统简单测定抗体亲和力的方法为竞争/非竞争性ELISA法，使用流式细胞术进行抗体亲和力初步检测较传统方法更加快速、高效、简便和准确；3、经典的测定抗体亲和力的方式为biacore生物大分子相互作用分析仪，但该方法检测一个样本至少需要6个小时时间，不适用于亲和力成熟阶段所需的大量亲和力测定工作，本方法中使用流式细胞术检测一次亲和力只需要对12个抗原/抗体不同比例的样品进行检测即可获得较为准确的数据，按照每个样本30s计算只需要6分钟时间；4、与经典的放射免疫分析法相比，使用流式细胞术测定抗体亲和力更安全、更简便、更高效。不足：目前本方法不能替代经典的biacore或放射免疫分析法的根本原因在于不能对酵母上表达的单链抗体数量进行准确定量，如果能够解决这一技术难题，本方法将会在这一领域获得更多的青睐。目前本方法检测数据与biacore检测数据相比，相差不超过1个数量级，完全能够满足抗体亲和力成熟阶段对候选抗体亲和力的初步检测工作。 四．四文献欣赏编后随着蛋白质-蛋白质相互作用研究的深入和蛋白质-蛋白质相互作用技术在多领域尤其是制药领域的推广，传统的研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法由于结果输出过程较为复杂，不能准确反映真实状态下蛋白质-蛋白质相互作用的情况，难以适应研究与开发人员对于高通量实验的要求。荧光标记的使用，是科学界的一次革命，不仅使原本“黑箱操作”的分子生物学技术变得可视，也使相关检测更加高效准确。流式细胞仪是快速、高效、准确进行荧光检测的最专业的设备之一，与传统的荧光分光光度计和荧光显微镜等技术相比，在高通量实验中具有明显的优势。本期专题介绍的几种研究蛋白质相互作用的方法，正是将蛋白质-蛋白质相互作用、分子生物学荧光标记技术、流式细胞（分选）术有机的结合起来，为蛋白质-蛋白质相互作用及其相关领域研究提供了高效、可靠地方法，我们相信，随着相关技术的进一步发展，流式细胞（分选）术在包括蛋白质-蛋白质相互作用等分子生物学领域将大有可为。知识点视频
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将红色荧光染料标记的人细胞表面的蛋白质分子与绿色荧光染料标记的小鼠细胞表面的蛋白质分子，细胞融合后，放到37℃的恒温箱中培养40min．其结果和说明的问题是（　　）A．两种荧光点不均匀分布，细胞膜流动性受温度影响B．两种荧光点均匀分布，细胞膜流动性不受环境影响C．两种荧光点不均匀分布，细胞膜能控制物质进出细胞D．两种荧光点均匀分布，细胞膜具有一定的流动性【考点】．【分析】果酒的然发，冲洗不要反复进行，以免使酵母菌量减少发酵期加长生的果酒中酒精含下降．备腐乳用盐腌制目的：能抑制微生生，免豆腐块腐败变质；加盐可以析出豆腐中的，使腐块变硬，后期制过程中会过酥烂有调味作用．【解答】解：酵术制葡萄酒所需的母菌种附着在葡萄皮上的野生型酵，不能进行复冲洗A错误；作醋时，的醋酸菌，是好氧细菌，应通空气以保证有正代谢，B错误；制酸奶是利用乳酸菌在无氧环下大量繁殖，萄糖分解成乳酸，D误．故选：【点评】本题考查微生物养应用的知识，属记内相简单，应理解记忆并举，生作答一不会太多错误．声明：本试题解析著作权属菁优网所有，未经书面同意，不得复制发布。答题：pygh老师　难度：0.75真题：3组卷：85
解析质量好中差
&&&&，V2.30556【科学美图】Brainbow：荧光点亮神经彩虹 | 科学人 | 果壳网 科技有意思
【科学美图】Brainbow：荧光点亮神经彩虹
荧光 绿色荧光蛋白 彩虹
本文作者:FranklinWhite
图片来自：Tamily Weissman, Harvard University
上图中的景象不是黑夜中的奇幻梦境，也不是艺术家的创作，而是神经细胞交织成的网络，这些细胞来自一只小鼠脑中的海马区域。
平时我们所见到的大脑标本都是灰白暗淡的颜色，而这种名叫“Brainbow”的技术则显得格外惊艳，神经细胞们个个分明，闪耀着五彩光芒。
另一张展示了小脑结构的“神经彩虹”。图片来自：Tamily Weissman, Harvard University
大脑是如何变成彩虹的？这要从荧光蛋白的故事开始说起。
绿色荧光蛋白：色彩的开端
这些美丽的颜色都是荧光，当分子吸收能量达到激发态后，它们会在较短时间内再回到比较稳定的基态，并且通过发光的方式重新释放出能量，这个过程中产生的就是荧光。
在一般的细胞中，原本没有那么多能发出各色荧光的物质，让它们发光，靠的是人为引入的荧光标记。而在这些荧光标记中，绿色荧光蛋白就是最为经典的一个。
绿色荧光蛋白是来自海洋的馈赠，它来自一种发光水母。在上世纪60年代，日裔科学家下村修（Osamu Shimomura，下村脩）和美国科学家约翰森（Frank H. Johnson）首先揭开了水母发光的秘密。一开始，他们从这些水母中提取到了水母发光蛋白（aequorin），在钙离子的作用下，这种蛋白质会发出蓝光。然而，在水母身上，人们最终观察到的却是绿色的荧光，将蓝光转化为绿光的，就是水母体内的另外一种蛋白质——绿色荧光蛋白。
发出绿色荧光的水母。图片来自：shiro1000.jp
更多的色彩
在发现之初，生物学家们就意识到了这种发光蛋白的价值，如果能在其他的细胞、生物组织中引入这样的蛋白质，那么在显微镜下，我们所看到的画面也就能变得更加清晰而且多彩了。
上世纪80年代，普鲁切（Douglas Prasher）成功地克隆出了水母中编码绿色荧光蛋白的基因，这使得荧光蛋白标记的大量应用成为了可能。有了这段基因，我们就可以让特定的细胞表达这些荧光蛋白，或者把绿色荧光蛋白和各种分子结合在一起，为细胞中特定的结构染上颜色。
不过，天然的绿色荧光蛋白还不够完美，它只有一种颜色，也无法进行复杂的标记。解决这一问题的，是华裔科学家钱永健（Roger Y Tsien）。通过对绿色荧光蛋白分子的种种改造，他得到了现在实验中广泛使用的增强型绿色荧光蛋白，以及蓝色、青色和黄色的新型荧光蛋白。在此之后，其他的实验室又从珊瑚虫中发现了红色的荧光蛋白。随着不断的探索和改造，生物学家“荧光调色盘”中的色彩也逐渐丰富了起来。
不同颜色的荧光蛋白。图片来自：Lei Wang et al
在培养皿上用细菌画出的彩色“荧光画”。在图中，这些细菌共表达了8种不同的荧光蛋白。图片来自：wikipedia
把神经细胞变成彩虹
有了荧光调色盘上的种种色彩之后，科学家们又是如何把神经细胞变成绚丽的彩虹的呢？这还需要基因编辑和重组技术来帮忙。
如果将不同荧光蛋白对应的基因片段转入细胞，让它们与目标蛋白共同表达，就可以对细胞以及细胞中的特定结构进行标记。但如果仅仅是这样做，我们一般得到只是单一的色彩，或者两三种颜色的图像。在很多情况下，这就已经够了，但要想把数量庞大、错综复杂的神经细胞彼此区分开，我们还需要更新的技术。
猪肾上皮细胞的有丝分裂，在这里用到了红色和绿色两种荧光标记。图片来自：microscopyu
能做到这一点的技术出现在2007年，哈佛大学的神经生物学家杰夫oWo里奇曼（Jeff W. Lichtman）和他的团队做出了这项名叫“脑彩虹”（Brainbow）的革命性成果[1]。通过这种技术，他们能让小鼠的神经细胞显示出了几十种不同的色彩。
在这种技术中，研究者们用到了一种名叫“Cre重组酶”的酶，它可以识别特定的DNA序列，并把两个“识别标记”中间的序列删除。研究者们把几种颜色的荧光蛋白基因串在一起，并在他们之间加上了Cre重组酶可以识别的标志序列。最终，在酶的帮助下，这些基因在细胞内会被随机地“剪掉”一部分，而剩下的部分得以表达，这样一来，细胞就可以随机地表达出各种不同的颜色了。
通过添加荧光蛋白基因的种类，以及改变基因的拷贝数，科学家们还可以像使用调色盘一样，在细胞中混合出更多颜色。
利用荧光蛋白的种类和基因数量“调制”颜色。图片来自：Jean Livet et al
在里奇曼的研究中，这些神经细胞的图像经过计算机分析，一共分辨出了89种不同的颜色，在下面的图像中，98.9%的细胞都展现出了不同的颜色。而到了后来，究极版的Brainbow已经能够产生多达166种可分辨的颜色。
异彩纷呈的神经细胞。图片来自：Jean Livet et al
这有什么用？
如此大费周章地用荧光蛋白为细胞调色，它到底有什么用呢？这种技术最大的作用，还是将某些需要研究的细胞与错综复杂的背景区分开来。通过对不同色彩的分析，可以计数细胞，也可以追踪细胞的走向，观察神经网络的连接布局以及细胞之间的相互作用。当然，让大众领略神经科学之美，也不失为“神经彩虹”重要的宣传作用。
下面，就让我们一起来欣赏Brainbow的美丽成果吧。
图片来自：Laura Dumas et al
这条五光十色的“长蛇”其实是小鼠的视神经，它连接着眼睛与大脑，负责传输视觉信号。
图片来自：Stefanie Hampel et al
除了小鼠之外，Brainbow在其他模式生物身上也同样行得通。在这张图中就展示了经过荧光标记的果蝇神经网络。
视网膜烟花
图片来自：Josh R. Sanes, Harvard University
这个看起来像烟花一般的结构是小鼠的视网膜神经节细胞，它接收来自视网膜视锥细胞和视杆细胞的信号，并参与视觉信号的传递。
图片来自：Karine Loulier, Institut de la Vision
虽然是为研究神经细胞所设计，但Brainbow技术同样可以点亮其他类型的细胞。在这张图中，被染上色彩的是小鼠舌头的肌纤维。现在，这种荧光标记技术也进入了更加广阔的研究领域。
（编辑：窗敲雨）
题图：浦肯野神经元。来自：Tamily Weissman, Harvard University
参考资料：
http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2010/IB/b926500g#!divAbstract
/pictureshow/brainbow
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引用 的话：还有人用羊毛毡做过一个，不过更像五彩精子……最近发现细胞污染，一种带尾巴的菌满盘游来游去，头部还一亮一亮的，2h细胞死完 ，突然想到这个
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色盲科学家表示强烈不满！明度太像了！
还有人用羊毛毡做过一个，不过更像五彩精子……
引用 的话：还有人用羊毛毡做过一个，不过更像五彩精子……如果你不说那个更像，我会认为这就是…
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话说……以后的猪肉会不会变成彩色发光的？？？？？？？
引用 的话：话说……以后的猪肉会不会变成彩色发光的？？？？？？？这个荧光发光是需要激光激发的
引用 的话：哦，要是价格不贵的话……为吸引顾客……其实也可以考虑嘛。。。想象下，激光灯下五彩缤纷的……生肉。。。。
艺术生要失业系列，
引用 的话：哦，要是价格不贵的话……为吸引顾客……其实也可以考虑嘛。。。想象下，激光灯下五彩缤纷的……生肉。。。。不会觉得好恶心么XD.....一般人接受不了的
引用 的话：哦，要是价格不贵的话……为吸引顾客……其实也可以考虑嘛。。。...这个，我是不想吃的
哈哈哈哈哈，没人会吃的。话说别打击人家了。（虽然我也在打击）
引用 的话：是紫外光
引用 的话：不会觉得好恶心么XD.....一般人接受不了的引用 的话：这个，我是不想吃的熟了，自然就没颜色了。。。。
引用 的话：是紫外光是我错
话说为什么同一个个体的不同细胞上表达的荧光蛋白不同啊。难道是一个一个细胞导入？还是各种颜色基因导入同一个受精卵后分裂的细胞各自随机表达一个颜色？
引用 的话：话说为什么同一个个体的不同细胞上表达的荧光蛋白不同啊。难道是一个一个细胞导入？还是各种颜色基因导入同一个受精卵后分裂的细胞各自随机表达一个颜色？可以参考这个或者原文，我写的更详细一点，作者把几个荧光蛋白连在一起在载体上，中间加上cre，表达的时候会随机切掉其中一部分，然后表达另一部分，由于拷贝数不一样，每个细胞里表达的荧光蛋白种类和数量都不一样，然后就有不同的颜色了。表达分为两个，一个是体外表达，用培养皿里的细胞只要做成稳定转染细胞系就行了，再瞬时转染cre，体内的作者用的是病毒感染，让它感染一片细胞，在目的片段之前加上一个在神经细胞特异性的转录子就可以达到在特定位点表达了。。
引用 的话：话说为什么同一个个体的不同细胞上表达的荧光蛋白不同啊。难道是一个一个细胞导入？还是各种颜色基因导入同一个受精卵后分裂的细胞各自随机表达一个颜色？原文是参考文献第一个
引用 的话：哦，要是价格不贵的话……为吸引顾客……其实也可以考虑嘛。。。想象下，激光灯下五彩缤纷的……生肉。。。。作大死，牛肉切面上出现点绿色反光都能在网上闹起一番风波。
引用 的话：，我写的更详细一点，作者把几个荧光蛋白连在一起在载体上，中间加上cre，表达的时候会随机切掉其中一部分，然后表达另...非常感谢
引用 的话：作大死，牛肉切面上出现点绿色反光都能在网上闹起一番风波。话说牛肉的那个绿色反光能吃吗？
诶，那为什么不把整个脑子都染上呢？这样直接可以建立一个精确到细胞的大脑模型么？
引用 的话：诶，那为什么不把整个脑子都染上呢？这样直接可以建立一个精确到细胞的大脑模型么？染色的目的是为了区分不同类型的细胞或者区域，把整个染色肯定是可以的，但是那个只是好看而已，利用这个技术就是可以在一堆缠在一起的细胞中定位一个或者一群，去研究他们的走向和与别的细胞的相互联系
以后人类会习得变色龙的技能么？
引用 的话：话说……以后的猪肉会不会变成彩色发光的？？？？？？？当然有可能。然后通过某人拉的臭臭的发什么荧光可以知道他/她午餐吃了什么
引用 的话：当然有可能。然后通过某人拉的臭臭的发什么荧光可以知道他/她午餐吃了什么可以把屁做个GC看看
引用 的话：染色的目的是为了区分不同类型的细胞或者区域，把整个染色肯定是可以的，但是那个只是好看而已，利用这个技术就是可以在一堆缠在一起的细胞中定位一个或者一群，去研究他们的走向和与别的细胞的相互联系对哇。我不是说把整个都染成一个颜色，而是说，可不可以保持这种高区分度的情况下，把染色区域扩展到全脑，然后整个就是花的了。。不过应该会有观测方面的技术限制吧，我猜。
引用 的话：对哇。我不是说把整个都染成一个颜色，而是说，可不可以保持这种高区分度的情况下，把染色区域扩展到全脑，然后整个就是花的了。。不过应该会有观测方面的技术限制吧，我猜。技术上问题不大，用一个比较通用的启动子就行，但是要考虑到一个问题，你要用显微镜观察细胞必须是要切片的，那样你看到的也是跟图片一样一张一张的，虽然理论上你可以把大脑切成好多好多切片，然后用软件3d重组，但是尺度上就看不清每个细胞的样子了，就会一坨彩色的样子吧
引用 的话：技术上问题不大，用一个比较通用的启动子就行，但是要考虑到一个问题，你要用显微镜观察细胞必须是要切片的，那样你看到的也是跟图片一样一张一张的，虽然理论上你可以把大脑切成好多好多切片，然后用软件3d重组，...啊，为什么会看不清每个细胞的样子？ 是切片技术的限制？切片过程中会变形？另外用多光子显微镜的话，可以观测比较深的样品的吧~
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